Здесь мы опишем работу микрофлюидном устройство, которое позволяет непрерывно и с высоким разрешением микроскопическое изображение одного перспективных дрожжевых клеток во время их полного репликативной и / или хронологической продолжительности жизни.
Мы демонстрируют использование простого Микрожидкостных установки, в которых один перспективных дрожжевых клеток можно проследить на протяжении всей своей жизни. Микрофлюидный чип использует размер разницы между матерью и дочерью клетки с использованием массива micropads. После загрузки, клетки в ловушке под этими micropads, поскольку расстояние между MicroPad и покровным стеклом похожа на диаметр дрожжевой клетки (3-4 мкм). После процедуры загрузки, культуры среда непрерывно пропускают через чип, который не только создает постоянный и определенной среде на протяжении всего эксперимента, но и вымывает новые дочерние клетки, которые не сохраняются под колодки из-за их меньшего размера. Установка сохраняет материнских клеток настолько эффективно, что в одном эксперименте до 50 отдельных клеток можно контролировать в полностью автоматическом режиме в течение 5 дней или, если необходимо, дольше. Кроме того, отличные оптические свойства микросхемы обеспечивают высокуюРазрешающая способность клеток в течение всего процесса старения.
Почкующихся дрожжей является важной моделью для организма старение исследования 1. До недавнего времени изучение репликативного старения в клетках дрожжей не было трудоемкий процесс, требующий вскрытия методом, в котором каждая почка не удалены вручную из материнской клетки 2,3. Чтобы решить эту проблему, мы недавно представили новую установку микрожидкостной возможность отслеживать отдельные клетки матери на протяжении всей своей жизни 4.
В нашем микрофлюидный чип, дрожжевые клетки оказались в ловушке под мягкие на основе эластомеров micropads (см. Рисунок 1). Непрерывный поток среднего смывает новообразованных дочерних клеток и обеспечивает клетки со свежими питательные вещества. В одном эксперименте, до 50 материнские клетки можно наблюдать в полностью автоматическом режиме на протяжении всего их репликативной продолжительности жизни. В связи с превосходными оптическими свойствами микрофлюидного чипа, можно одновременно контролировать различные аспекты биологии клетки дрожжей (например, </EM> с помощью флуоресцентных белков).
По сравнению с классическим методом вскрытия, микрожидкостной установки обеспечивает существенные преимущества. Это обеспечивает определенную и постоянную среду в течение всего эксперимента старения. Она не требует дорогого специализированного оборудования и может быть запущен на любой микроскоп оснащен автоматизированной фокус и покадровой способностей, а также контроля температуры для выращивания клеток. Производства и эксплуатации микрожидкостных чипов можно узнать в течение нескольких дней. Кроме того, клетки могут быть непосредственно загружены с экспоненциально растущей культуры, преимущество над другими недавно опубликованных Микрожидкостных методу 5, который требует биотинилирования материнских клеток. В сочетании с высоким разрешением, описанные здесь способ может быть использован для измерения постепенных изменений в клеточной морфологии, экспрессии белка и локализация во время старения дрожжей беспрецедентным образом. Способность кдолгосрочный мониторинг отдельных клеток также предоставляет уникальные возможности для исследования дрожжей клеточного цикла.
Этот метод в последнее время были оптимизированы, чтобы удалить биотинилированием из протокола 16, который был опубликован в то время как эта рукопись была в обзоре.
Микрожидкостных метод, описанный здесь является важным инструментом романа в исследовании старения, поскольку позволяет простой и автоматизированной генерации дрожжей репликативное данные продолжительности жизни в сочетании с непрерывным высоким разрешением. Эти атрибуты являютс…
The authors have nothing to disclose.
Мы хотели бы поблагодарить Лору Schippers для написания первой версии протокола нагрузки сотовой ячейки и Маркус де Goffau и Guille Zampar тестов митохондриальной морфологии.
Name | Company | Catalogue number | Comments |
REAGENTS | |||
DC Sylgard 184 elastomer | Mavom bv | 1060040 | This package contains PDMS base and PDMS curing agent. |
Glass Petri dishes 120/20 mm | VWR International | 391-2850 | |
Cover glasses 22×40 mm | CBN Labsuppliers BV | 190002240 | |
Tough-Tags | Sigma-Aldrich | Z359106 | |
Aluminum foil | |||
Plastic disposable cup | |||
Serological pipette 5 ml | VWR International | 612-1245 | |
Scotch tape | VWR International | 819-1460 | |
Baysilone paste (GE Bayer silicones) | Sigma-Aldrich | 85403-1EA | |
PTFE microbore tubing, 0.012″ID x 0.030″OD | Cole Parmer | EW-06417-11 | Referred to as thin tubing |
Tygon microbore Tubing, 0.030″ID x 0.090″OD | Cole Parmer | EW-06418-03 | Referred to as thick tubing |
Scalpel | VWR International | 233-5334 | |
50 ml Luer-Lok syringes | BD | 300137 | |
5 ml syringes, Luer tip | VWR International | 613-1599 | |
Tweezers | VWR International | 232-2132 | |
20 Gauge Luer stubs | Instech Solomon | LS20 | |
Syringe filters (pore size 0.20 μm) | Sigma-Aldrich | 16534K | |
Stainless steel catheter Plug, 20 ga x12 mm | Instech Solomon | SP20/12 | |
Petri dishes | VWR International | 391-0892 | |
EQUIPMENT | |||
Benchtop UV-Ozone Cleaner | NOVA Scan | PSD-UVT | |
Harvard Pump 11 Elite | Harvard Apparatus | 70-4505 | |
SU-8 silicon master mold (wafer) | Self-made; For details contact corresponding author | ||
Balance | Sartorius corporation | ED4202S | |
Vacuum pump | KNF Neuberger | N022 AN.18 | |
Desiccator | VWR International | 467-2115 | |
Hot plate | VWR International | 460-3267 | |
Optional: Metal holder for cover glass (22×40 mm) | Self-made; For details contact corresponding author | ||
(Fluorescence) Microscope with 60x objective, autofocus, time-lapse abilities and preferably an automated (motorized XY control) stage | Nikon | Eclipse Ti-E |