Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

إرساء ثقافة السائل المغطاة من مجرى الهواء الإنسان المستقطب طلائي Calu-3 خلايا لدراسة استجابة الخلية المضيفة لمسببات الأمراض التنفسية Published: February 7, 2013 doi: 10.3791/50157
Automatic Translation
1, 1
1National Center for Immunization and Respiratory Diseases, Division of Viral Diseases, Gastroenteritis and Respiratory Viruses Laboratory Branch, Centers for Disease Control and Prevention (CDC)

Summary

النتائج والاستنتاجات الواردة في هذا التقرير هي آراء أصحابها ولا تمثل بالضرورة وجهة نظر مراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها.

Abstract

السطوح قمية وbasolateral من الخلايا الظهارية الهوائية تظهر الاستجابات الاتجاه إلى التعرض الممرض في الجسم الحي. وهكذا، مثالية نماذج في المختبر لدراسة الاستجابات الخلوية لمسببات الأمراض التنفسية استقطاب، وتشكيل السطوح قمية وbasolateral. ويتمايز نموذج واحد مثل الإنسان الطبيعي الخلايا الظهارية القصبية (NHBE). ومع ذلك، فإن هذا النظام يتطلب عينات أنسجة الرئة والخبرات وعزل الخلايا الظهارية زراعة الأنسجة من، والوقت لإنشاء واجهة الثقافة الهواء السائل.

Calu-3 خلايا، والمستمدة من الشعب الهوائية والسرطان الغدي الإنسان، هي النموذج البديل للنظر في استجابة الخلايا الظهارية الهوائية القريبة لإهانة الجهاز التنفسي 1، مركبات الدوائية 2-6 و 7-9 والبكتيرية والفيروسية مسببات الأمراض، بما في ذلك فيروس الأنفلونزا، فيروسات الانف والمتلازمة التنفسية الحادة - المرتبطة التاجى 10-14. مؤخرا، ثأظهرت الإلكتروني التي Calu-3 خلايا عرضة لفيروس الجهاز التنفسي المخلوي (RSV) في العدوى على نحو يتفق مع NHBE 15،16. هنا، ونحن من التفصيل إرساء ثقافة الاستقطاب السائل المغطاة، (LCC) من الخلايا-3 Calu، مع التركيز على التفاصيل التقنية لزراعة الخلايا والنمو Calu-3، والحفاظ على الخلايا التي تم زرعها في LCC، ونقدم الأسلوب لتنفيذ عدوى فيروس الجهاز التنفسي من الاستقطاب خلايا-3 Calu.

للحصول على الاستقطاب باستمرار Calu LCC-3، Calu-3 يجب خلايا subcultured بعناية قبل زراعة في إدراج Transwell. يجب Calu-3 الثقافات أحادي الطبقة تظل دون التقاء 90٪، وينبغي subcultured أقل من 10 مرات من المخزون المجمدة، ويجب أن يتم توفير بانتظام مع المتوسط ​​الطازجة. مثقف مرة واحدة في Transwells، لا بد من التعامل معها Calu-3 LCC بعناية. عدم انتظام وسائل الإعلام وتعطيل التغييرات الميكانيكية أو المادية للطبقات الخلية أو لوحات تؤثر سلبا الاستقطاب للعدة ساعات أو أيام. ويتم رصد الاستقطاب من خلال تقييم عبر الظهارية المقاومة الكهربائية (طير) ويتم التحقق من خلال تقييم السلبي للموازنة الصوديوم فلوريسئين بين حجرات قمية وbasolateral 17،18. الهضاب طير مرة واحدة عند أو فوق 1000 سم 2 × Ω، Calu-3 LCC على استعداد لاستخدامها لدراسة الاستجابات الخلوية لمسببات الأمراض في الجهاز التنفسي.

Protocol

1. زراعة خلايا Calu-3 للاستخدام في الثقافات Transwell

تدابير السلامة: تنفيذ جميع الإجراءات في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية باستخدام تقنية معقمة الثقافة.

  1. لذوبان الجليد من خلايا التخزين المجمد:
    1. إعداد متوسطة النسر الأساسية الدنيا للحرارة التي تحتوي على 20٪ الجنين المعطل مصل بقري (FBS)، 0.1 ملي غير الأحماض الأمينية الأساسية، 2 مم L-الجلوتامين، and10 درجة الحموضة HEPES ملي 7.4 (EMEM-20٪ + S). العقيمة مرشح الوسط المعدة باستخدام 0.2 ميكرومتر حجم المسام تصفية، ودافئة في حمام مائي إلى 37 ° C. ليكون أكثر تعبيرا عن البيئة الهوائية في الموقع ظهارة، لا تستكمل مع المضادات الحيوية أو المتوسطة antimycotics.
    2. ذوبان الجليد في cryovial من الخلايا المجمدة-3 Calu بسرعة (<1 دقيقة) في حمام ماء C ° 37.
    3. نقل الخلايا إلى أنبوب إذابة 50 مل المخروطية العقيمة وإضافة 30 مل من حرارة S. + EMEM-20٪
    4. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 1،000-1،200 × ز،دون تبريد، والفرامل بسرعة منخفضة.
    5. صب طاف بلطف و resuspend الخلايا في 5 مل من٪ EMEM-20 + S من حرارة pipetting بلطف صعودا وهبوطا. البذور 2-5 × 10 6 خلايا لكل بئر في لوحة زراعة الأنسجة 6 جيدا واحتضان عند 37 درجة مئوية، CO 7٪ 2 في الغلاف الجوي الهواء حتى الخلايا هي 75٪ - 80٪ متموجة. تحقق يوميا، وقد تكون هناك حاجة تصل إلى 7 أيام. كل 3-4 أيام نضح المتوسطة من الخلايا واستبدالها جديدة EMEM-20 +٪ S.
  2. إلى خلايا فرعية:
    1. الحارة التربسين 0.05٪ - 0.02٪ EDTA في حمام ماء C ° 37. نضح المتوسطة من الخلايا، وخلايا يغسل مرة واحدة مع حرارة التربسين 0.05٪ - 0.02٪ EDTA لإزالة الزائدة والمتوسطة المصل. إزالة غسل وإضافة 1 مل من التربسين استعد جيدا لفي الخلايا.
    2. احتضان عند 37 درجة مئوية وCO 2 و 7٪ مونيتور تحت المجهر كل 5 دقائق على الأقل حتى 75٪ من الخلايا فصل من البئر (ق) من الأنسجة لوحة الثقافة. يجوز هذايستغرق ما بين 5 و 30 دقيقة.
    3. غسل الخلايا في EMEM-20٪ + S لإزالة الزائدة التربسين. نقل الخلايا إلى أنبوب trypsinized 50 مل المخروطية العقيمة. ويمكن تجميع آبار متعددة من الخلايا من لوحة واحدة 6 الثقافة جيدا في واحدة 50 مل المخروطية أنبوب العقيمة. إضافة 30 مل من خلايا EMEM-20٪ + S وبيليه بواسطة الطرد المركزي عند 1،000-1،200 × غرام، دون تبريد، والفرامل بسرعة منخفضة.
    4. صب طاف بلطف و resuspend الخلايا في EMEM-20٪ + S جديدة من pipetting بلطف صعودا وهبوطا. 1.2.1 باستخدام الخطوات المذكورة أعلاه ل1.2.3 من خلال خلايا يعرض للتريبسين، لا تزال ثقافة فرعية الخلايا في أطباق زراعة الأنسجة كما هو موضح في الخطوات 1.2.5 1.2.7 من خلال عندما يكونون بين 75 - 80٪ متموجة.
    5. ثقافة فرعية من بئر واحد من لوحة 6 جيدا حتى قارورة 2 واحدة T-25 سم في الحجم النهائي من 5 مل من EMEM S-20 +٪، بذر بين 0.5 إلى 1 × 6 10 خلايا / القارورة.
    6. باستخدام 5 مل التربسين في درجة حرارة T-25 قارورة 2 سم لفصل الخلايا، ثقافة فرعيةمن T-25 قارورة 2 سم تصل إلى T-75 سم 2 في قارورة الحجم النهائي من 10 مل من٪-20 + S EMEM، بذر بين 1 إلى 5 × 10 6 خلية / القارورة.
    7. 8 مل باستخدام تحسنت التربسين في T-75 قارورة 2 سم لفصل الخلايا، ثقافة فرعية من قارورة 2 T-75 سم في 2 T-75 قوارير 2 سم. الأمثل لنمو الخلايا، لا ثقافة فرعية الخلايا في قوارير أكبر من T-75 سم 2 أو ثقافة فرعية في نسبة أكبر من قارورة الأم 1: 3 قوارير جديدة.
  3. مرة واحدة وقد تم subcultured الخلايا، وإزالة بالكامل ويستعاض المتوسطة كل 2 إلى 3 أيام حتى تصل 75-90٪ التقاء. قد يستغرق فترة تصل الى الخلايا 3 أسابيع للوصول إلى التقاء 75-90٪. لتوليد الأمثل للثقافات الاستقطاب، وخلايا فرعية قبل أن تنمو وراء التقاء 90٪ وأحادي الطبقة.
  4. تواصل الخلايا خلايا كافية ثقافة فرعية حتى نمت لبذور العدد المرغوب فيه من إدراج Transwell. كل إدراج Transwell يتطلب 2 × 10 5 خلايا. لتحقيق الأداء الأمثل توليد الثقافات الاستقطاب، استخدام الخلايا التي خضعت لا يزيد عن 10 الثقافات الفرعية.

2. تزايد الاستقطاب Calu-3 السائل المغطاة الثقافات (LCC)

تدابير السلامة: تنفيذ جميع الإجراءات في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية باستخدام تقنية معقمة الثقافة.

  1. إعداد EMEM تحتوي على 10٪ FBS (EMEM-10٪) ودافئة في حمام مائي إلى 37 ° C.
  2. إعداد لوحة Transwell 24 جيدا للبذار. باستخدام ملقط معقم، نقل إدراج Transwell من الداخل إلى الخارج من صفوف لوحة دون لمس الغشاء إدراج. يجب فقط أن الخلايا subcultured في الآبار على الصفوف الخارجي للوحة. لمنع دخول فقاعات الهواء في مقصورات basolateral، اضافة 600 ميكرولتر من EMEM-10٪ لكل واحد من الصيد ماصة ضد جدار حجرة والإفراج عن كل ببطء المتوسطة في البئر.
  3. فصل الخلايا T-75 من الأنسجة 2 سم. Subcuقوارير lture باستخدام التربسين تحسنت، ويغسل في 30 مل من٪-20 + S EMEM في كل القوارير 2 من خلايا trypsinized، كما هو موضح في الخطوة 1.2.
  4. إعادة تعليق بدقة خلايا غسلها في 5 مل من EMEM-10٪ بحلول pipetting بلطف صعودا وهبوطا.
  5. تحديد عدد الخلايا قابلة للحياة ومجموع استبعاد التريبان الأزرق الأسلوب. المضي قدما إذا فقط 80٪ - 90٪ قابلة للبقاء.
  6. في أنبوب 50 مل المخروطية العقيمة، تمييع الخلايا لتركيز 2 × 10 6 خلايا قابلة للحياة / مل مع EMEM-10٪.
  7. إضافة إلى المقصورة خلايا قمية كل Transwell. إلى الآبار وA1 D1، والتي سوف تكون السيطرة الآبار خالية من الخلايا، وهذا هو، والفراغات، إضافة 100 ميكرولتر من EMEM-10٪ دون الخلايا. إلى كل من الآبار المتبقية، إضافة 100 ميكرولتر من معلق الخلايا Calu-3، الصيد بلطف ماصة ضد القناة دليل الداخلية من الجدار والإفراج عن إدراج ببطء الخلايا. لا تلمس ماصة لغشاء إدراج. للحفاظ على التعليق متجانسة من الخلايا-3 Calu، تستنهض الهمم بلطف التعليق الخليةخلال هذه الخطوة البذر.
  8. احتضان لوحة Transwell في 37 ° C و 7٪ CO 2 في الغلاف الجوي الهواء. لوحة مكان في حاضنة حيث الاضطرابات الجسدية ستكون ضئيلة. لتحسين كفاءة الاستقطاب، لا كومة لوحات على رأس كل منهما الآخر.
  9. للحفاظ على الثقافات حتى الاستقطاب وجاهزة للاستخدام في التجارب، تماما استبدال المتوسطة في Transwells، كما هو موضح في الخطوات 2،10 2،13 خلال أدناه. ينبغي استبدال المتوسطة تماما بعد ثلاثة أيام يجري في subcultured Transwells، ومن ثم على دورة بالتناوب بين اليوم الرابع والثالث ثم بعد التغذية السابقة، حتى الخلايا مستقطبة بشكل كامل.
  10. الحارة EMEM-10٪ في حمام مائي إلى 37 ° C.
  11. نضح بلطف المتوسطة من إدراج Transwell. مع ماصة شعري المرفقة فخ الفراغ مع فراغ لطيف، أو مع ماصة 1 مل القياسية والمتوسطة الرشفة من A1 الآبار خالية من الخلايا وD1، ثم من المصنف الآبار وإزالة أول قمي المتوسطة من جميع الآبار، ورالدجاجة إزالة المتوسطة basolateral من جميع الآبار. لا تلمس الأغشية إدراج بينما الشفط المتوسط.
  12. أضف 200 ميكرولتر من EMEM-10٪ إلى المقصورة القمي من A1 الآبار خالية من الخلايا وD1، ثم إلى الآبار المصنف، توجيه المتوسطة في مقصورة قمي باستخدام جانب من إدراج لتوجيه تلميح ماصة. لا تقم بإضافة المتوسطة مباشرة على الخلايا، وعدم لمس الغشاء إدراج.
  13. اضافة 600 ميكرولتر من EMEM-10٪ إلى حجرات basolateral. لمنع دخول فقاعات الهواء في مقصورات basolateral، إضافة إلى كل واحد المتوسطة من الصيد ماصة ضد جدار حجرة والإفراج عن كل ببطء المتوسطة في البئر.

3. تقييم التنمية مقاومة Calu-3 LCC

تدابير السلامة: تنفيذ جميع الإجراءات في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية باستخدام تقنية معقمة الثقافة.

  1. تقييم عبر الظهارية المقاومة الكهربائية (طير) من Calu-3 LCC بعد 30 دقيقةالتغييرات المتوسطة، ويمكن إجراء تقييم بعد كل تغيير المتوسطة اذا شئت. أداء قياسات تحت ظروف معقمة. تبدأ القياسات مع سيطرة خالية من الخلايا A1 الآبار وD1 (الفراغات) للحصول على قياسات خط الأساس، ومتابعة القياسات لكل بئر.
    1. تحت ظروف معقمة، ونقل القطب STX2 إلى أنبوب الطرد المركزي 50 مل تحتوي على 70٪ إيثانول في الماء المعقم، وتعقيم 15 دقيقة.
    2. معايرة واختبار voltohmmeter للاستخدام وفقا لتوجيهات المصنع.
    3. إزالة القطب من الإيثانول، والهواء الجاف 5-10 ثانية، وشطف مع القطب٪ EMEM-10 العقيمة.
    4. تعيين مفتاح الوضع من voltohmmeter إلى الإعداد المقاومة، وتحويل الطاقة.
    5. وضع القطب الكهربائي بلطف إلى واحدة من الموانئ 3 والتي تسمح بالوصول إلى المقصورة basolateral الثقافة Transwell واحد. القطب مكان بحيث زمام المبادرة تعد طفيفة فقط تلامس قاع البئر الخارجي ويبقى العمودي،وأقصر الرصاص في الأنسجة المتوسطة ثقافة المقصورة قمي، دون لمس الغشاء إدراج.
    6. دفع "قياس R" الزر، وانتظر لتحقيق الاستقرار في القراءة. تكرار لمنافذ 2 أخرى لكل بئر وتسجيل القياسات من جميع الموانئ الثلاثة، ليصبح المجموع ثلاثة قياسات لكل بئر. مواصلة لقياس مقاومة لجميع الآبار من الخلايا.
    7. تنظيف الكهربائي عن طريق نقع 5-10 دقيقة في الايثانول 70٪، في الشطف العقيمة O 2 درهم، والتجفيف جيدا. تخزين في حاوية الأصلي.
    8. حساب المقاومة من كل بئر، وذلك باستخدام المعادلة 1.
      Ω الفعلية = Ω عينة - Ω فارغة، المعادلة 1
      حيث Ω عينة هو قياس متوسط ​​من بئر المصنف فارغة وΩ هو قياس متوسط ​​من A1 2، الآبار وD1، التي تحتوي على إدراج والمتوسطة، ولكن الخلايا لا.
    9. حساب المقاومة وحدة المساحة، وذلك باستخدام المعادلاتنشوئها 2.
      Ω الفعلي × فعالة غشاء منطقة Ω × = سم 2، المعادلة 2
      حيث منطقة الغشاء فعالة إلى 0.33 سم 2 بالنسبة لإدراج Transwell 24 أيضا.
  2. تحقق من أن الاستقطاب كاملة عن طريق إجراء فحص الثانوية، وقياس السلبي نشر فلوريسئين الصوديوم بين حجرات قمية وbasolateral، على الثقافات 02:59 Transwell. يجب التخلص من الآبار المستخدمة للمقايسة الصوديوم فلوريسئين مباشرة بعد الانتهاء من الفحص.
    1. إعداد غير الفلورسنت العازلة (118 ملي كلوريد الصوديوم؛ 4،75 بوكل مم؛ 2.53 ملي CaCl 2 0.2 H 2 O؛ 2،44 ملم MgSO 4؛ 1،19 ملم KH 2 PO 4؛ 25 مم NaHCO 3 في الماء المعقم؛ تصفية العقيمة مع 0،45 ميكرون جهاز الترشيح ). إعداد فلوريسئين الصوديوم في 1 ملغ / مل في غير الفلورسنت العازلة، مرشح العقيمة، والتفاف في احباط الالومنيوم، وتخزينها في 4 درجات مئوية، محمية من الضوء. غرفة دافئة لtemperatuإعادة قبل الاستخدام.
    2. بعد الانتهاء من القياسات المقاومة، وإزالة بعناية من المقصورات المتوسطة على حد سواء basolateral والقمي واحد إلى ثلاثة الثقافات Transwell الفردية.
    3. شطف الثقافات Transwell. إضافة ميكرولتر 600 بلطف درجة حرارة الغرفة معقمة Dulbecco في PBS (D-PBS) إلى حجرات و 100 ميكرولتر basolateral درجة حرارة الغرفة معقمة D-PBS إلى حجرات قمي.
    4. إزالة بلطف D-PBS من الآبار. اضافة 600 ميكرولتر العقيمة غير الفلورسنت المخزن المؤقت إلى حجرات basolateral. إضافة 100 ميكرولتر العقيمة 1 فلوريسئين الصوديوم ملغ / مل إلى حجرات قمي.
    5. احتضان لوحة في C ° 37 لمدة 1 ساعة. غير مطلوب CO 2 خلال هذه الحضانة.
    6. خلال الحضانة، يعد منحنى الصوديوم فلوريسئين مستوى يتراوح بين 20 ميكروغرام / مل و 0 ميكروغرام / مل، وذلك باستخدام الفلورية غير عازلة لتمييع فلوريسئين الصوديوم. إعداد لا يقل عن 8 تركيزات مختلفة من فلوريسئين الصوديوم، كل في الحجم النهائي من لا يقل عن 600 ميكرولتر. احتفظالتخفيفات منحنى القياسية محمية من الضوء حتى على استعداد لقياس الامتصاصية.
    7. نقل العينة عازلة غير الفلورسنت من المقصورة basolateral كل Transwell اختبار لأنبوب نظيفة منفصلة للتحليل. إزالة الاختبار المستخدمة لفحص Transwells السلبي نشر فلوريسئين الصوديوم من لوحة والتخلص منها. العودة لوحة مع Transwells المتبقية إلى الحاضنة.
    8. وضع 100 ميكرولتر من كل حل القياسية في ثلاث نسخ إلى لوحة مسطحة القاع 96-أيضا.
    9. إعداد ثلاث التخفيفات من كل عينة basolateral (1:2، 1:20، و1:50) في غير الفلورسنت العازلة، وإضافة 100 ميكرولتر من كل عينة وغير مخفف من كل تخفيف من نسختين، إلى جانب 96-مسطحة أسفل اللوحة.
    10. قياس الامتصاصية عينة على قارئ لوحة في 486 نانومتر ELISA أو نانومتر 490.
    11. تحديد تركيز الصوديوم فلوريسئين في المقصورة basolateral بمقارنة عينات من الامتصاصية ضد القيم الامتصاصية لالصوديوم فلوريسئين شandard المنحنى.

4. اصابة المستقطب Calu-3 LCC مع فيروس الجهاز التنفسي

تدابير السلامة: تنفيذ جميع الإجراءات في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية باستخدام تقنية معقمة والثقافة، وعلى مستوى السلامة الحيوية المناسبة لتستخدم الفيروس.

  1. تمييع فيروس في مصل الدم خالية EMEM بحيث قائح المطلوب سيكون في 100 ميكرولتر.
  2. غسل الخلايا في مصل خالية EMEM. نضح بلطف المتوسطة من جميع الآبار، وإزالة المتوسطة القمي ثم المتوسطة basolateral. مع ماصة شعري المرفقة فخ الفراغ مع فراغ لطيف، أو مع ماصة 1 مل القياسية والمتوسطة الرشفة من A1 الآبار خالية من الخلايا وD1، ثم من الآبار المصنف، وإزالة أولا المتوسطة القمي من جميع الآبار، ومن ثم إزالة وسيلة basolateral من جميع الآبار. لا تلمس الأغشية إدراج بينما الشفط المتوسط.
    1. إضافة 100 ميكرولتر من المصل خالية EMEM إلى المقصورة القمي من A1 الآبار خالية من الخلايا وD1، ثم إلى رانه المصنف الآبار، وتوجيه المتوسطة في مقصورة قمي باستخدام جانب من إدراج لتوجيه تلميح ماصة. لا تقم بإضافة المتوسطة مباشرة على الخلايا، وعدم لمس الغشاء إدراج.
    2. اضافة 600 ميكرولتر من المصل خالية EMEM إلى حجرات basolateral. إضافة إلى كل Transwell المتوسطة من الصيد ماصة ضد جدار حجرة والإفراج عن ببطء المتوسطة في البئر.
    3. نضح المصل بلطف خالية من الآبار المتوسطة.
  3. بدءا الآبار غير مصاب أو المصابة وهمية، إضافة التخفيفات المناسبة لفيروس المقصورة القمي من Transwells. للآبار غير مصاب، إضافة 100 ميكرولتر من المصل خالية EMEM إلى المقصورة من قمية Transwells الاقتضاء، لوهمية المصابين الآبار، إضافة 100 ميكرولتر من الفيروسات مجانا مخففة في إعداد المصل خالية EMEM إلى المقصورة من قمية Transwells المناسبة، ولل عدوى فيروس، فيروس في مصل الدم تمييع خالية EMEM وإضافة 100 ميكرولتر إلى حجرات القمي من Transwells المناسبة.
  4. اضافة 600 ميكرولتر من المصل خالية EMEM لجميع المقصورات basolateral.
  5. احتضان عند 37 درجة مئوية و 7٪ CO 2 ل 2 ساعة.
  6. نضح المتوسطة من الآبار، أولا من الآبار غير مصاب ومصاب وهمية، ثم من الآبار المصابة. إزالة supernatants قمي الأولى، تليها supernatants basolateral.
  7. استبدال المتوسطة مع 200 ميكرولتر من EMEM-10٪ في حجرات القمي و 600 ميكرولتر من EMEM-10٪ في حجرات basolateral.

Representative Results

عندما نمت وسائل المغطاة الثقافات (LCC) في نظم الثقافة Transwell، كما هو موضح في الشكل 1، Calu-3 خلايا استقطاب وتطوير متميزة السطوح قمية وbasolateral. وفقا للطريقة الموصوفة هنا، المقاومة الكهربائية عبر الظهارية (طير) من Calu LCC-3 تصل إلى الهضبة عند أو فوق 1000 سم 2 × Ω في غضون 3 أسابيع بعد الغرس ومثال الذي يظهر في الشكل 2. وشكلت منعطفات ضيقة بين الخلايا الاستقطاب السلبي موازنة منع من جزيئات صغيرة بين حجرات قمية وbasolateral. وبالتالي، يتم استخدام فلوريسئين الصوديوم تعديل موازنة فحص للتأكد من الاستقطاب Calu-3 LCC 15،17،18. كما طير من monolayers الخلية Calu-3 في زيادات LCC، ومقدار فلوريسئين أن equilibrates بشكل سلبي في مقصورة basolateral النقصان. مرة واحدة في طير هو 1،000 × Ω سم 2، ومقدار فلوريسئين أن equilibrates في إلى المقصورة basolateral و≤ 1٪، كما هو موضح في الشكل 3، وبالتالي، تعتبر Calu-3 LCC أن تكون مستقطبة بشكل كامل عندما هو طير ≥ Ω × 1000 سم 2. قد طير قياس ذروة Calu-3 LCC تختلف من تجربة إلى تجربة. ومع ذلك، مرة واحدة هضبة القيم طير لأي تجربة معينة، قد، غير مصاب تماما الاستقطاب Calu-3 LCC تكون مستقرة لمدة 5 إلى 12 أسابيع بعد البذر. قد يكون سبب غياب التنمية المقاومة في Transwell-مثقف Calu-3 من قبل عدة عوامل على النحو المبين في الجدول 1. مرة واحدة في طير من Calu-3 الهضاب LCC عند أو فوق 1000 سم 2 × Ω، هذا النموذج هو على استعداد لاستخدامها لفحص ردود الخلايا الظهارية الهوائية لمسببات الأمراض التنفسية، بما في ذلك فيروس الجهاز التنفسي المخلوي (RSV). التعرض لنتائج RSV في انخفاض أسرع في نزاهة ثقافة الاستقطاب مقارنة العدوى وهمية من الخلايا (الشكل 4).

= "دائما"> الشكل 1
الشكل 1. تزرع الخلايا المقطع العرضي تمثيل Transwell-مثقف الخلايا. على سطح الغشاء القمي إدراج.

الشكل 2
الشكل 2. التنمية العابرة للالظهارية المقاومة الكهربائية (طير) واستقطاب Calu-3 الخلايا بعد البذر في إدراج Transwell. وفي كل نقطة الوقت، كما يتم تقديم طير متوسط ​​سم × Ω ± 2 SEM من 32 بئرا مستقلة عن التجربة ممثل واحد.

الشكل 3
الشكل 3. السلبي equili هو تحول دون bration من فلوريسئين الصوديوم في مقصورة basolateral من monolayers الخلية Calu-3 كما تصبح الخلايا الاستقطاب. يتم تقديم البيانات التراكمية من أربع تجارب مستقلة. كل نقطة بيانات يمثل القياس الفردية.

الشكل 4
الشكل 4. RSV إصابة LCC Calu-3 الاستقطاب تسارع انخفاض في سلامة أحادي الطبقة. المستقطب Calu-3 خلايا والمصابين RSV-A2 في وزارة الداخلية 1 = في يوم 0، وتمت مراقبة القطبية لمدة 8 أسابيع بعد العدوى. ويرد ممثل تجربة واحدة. يتم عرض البيانات في مقاومة متوسط ​​من 8 آبار مستقلة في الإصابة ± SEM في نقطة زمنية. * P <0.05 بين الثقافات وهمية وRSV-A2 المصابين، على النحو الذي يحدده للطالب اختبار t.

طرق "> قضية القرار (ق) المقاومة ليست قابلة للقياس
  • إزالة أي فقاعات الهواء في الآبار
  • استخدام الخلايا Calu-3 التي تم subcultured من المخزون المجمدة أقل من 10 مرات
  • لا تسمح Calu-3 خلايا لتصل إلى 100٪ في التقاء ثقافة فرعية أحادي الطبقة
  • تأكد من أن الخلايا لا تنمو على البلاستيك أقل بكثير من إدراج (تشير إلى أن الخلايا قد نمت من خلال مسام إدراج)
  • السماح 2-3 أسابيع بعد الغرس من أجل التنمية الكاملة المقاومة
  • تحقق من تكوين وحجم المسام من إدراج المستخدمة، تغيير إذا لزم الأمر (مستحسن إدراج البوليستر، 0.3 ميكرون حجم المسام، لا الطلاء، انظر المواد للحصول على التفاصيل)
  • تأكد من جودة القطب، الرملي بلطف لإزالة البروتينات المتراكمة من طرف، واستبدال إذا لزم الأمر
  • تحقق المتوسطة لنمو البكتيريا
    • المقاومة تتطور، ولكن لم يبلغوا الاستقطاب الكامل (≥ Ω × 1000 سم 2)
    • إتاحة المزيد من الوقت لاستقطاب لتطوير (قد تتخذ في بعض الأحيان تصل إلى 4 أسابيع)
    • استخدام الخلايا Calu-3 التي تم subcultured من المخزون المجمدة أقل من 10 مرات
    • لا تسمح Calu-3 خلايا لتصل إلى 100٪ في التقاء ثقافة فرعية أحادي الطبقة
    • استبدال باستمرار المتوسطة في الثقافات Transwell، بالتناوب بين النهار والثالثة والرابعة ثم بعد الرضاعة السابقة
    • الخلايا فقط على إدراج الثقافة التي يتم وضعها في الصفوف الخارجي للوحات
    • استخدام الكثير مختلفة من إدراج Transwell
    خلايا استقطاب تماما، ولكن المقاومة ليست متسقة من قراءة واحدة إلى أخرى
    • لا تعطيل أو كومة لوحات في الحاضنة
    • لا تسبب الاهتزاز في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية في حين Transwell بلاتويجري التعامل معها ES
    • إزالة أي فقاعات الهواء في الآبار
    • لا تخل طبقة الخلايا مع نصائح ماصة عند تغيير أداء وسائل الإعلام أو قراءات طير
    • يستخدم الانسان 200 ميكرولتر المتوسطة في المقصورة القمي، وانخفاض الصوت قد يؤدي إلى قراءات غير مستقرة طير
    • تأكد من جودة القطب، الرملي بلطف لإزالة البروتينات المتراكمة من طرف، واستبدالها إذا لزم الأمر

    الجدول 1. حل المشاكل التي قد تنشأ المشاكل عندما زراعة الخلايا Calu-3 في Transwells. عوامل متعددة تسهم في استقطاب كاملة من خلايا-3 Calu في السائل المغطاة الثقافات، وعلى الأرجح من التي أبرزت في هذا الجدول.

Discussion

عند إنشاء Calu-3 LCC في إدراج Transwell، قد لا خلايا استقطاب في كل شيء، أو لا استقطاب بالكامل، كما تم تعريفها من قبل طير ≥ Ω × 1000 سم 2 و≤ 1٪ موازنة الصوديوم فلوريسئين صبغ بين حجرات قمية وbasolateral. وبالإضافة إلى ذلك، قد Calu-3 خلايا في استقطاب LCC تماما، ولكن قد تكون غير متناسقة طير بين القياسات. على الرغم من التقلبات في القياسات طير من Calu-3 LCC طبيعية من يوم لآخر، ومن غير المتوقع تماما مرة واحدة الاستقطاب، وتقلب كبير في طير حتى ينخفض ​​بشكل طبيعي ثقافة مع التقدم في السن، والتي قد تكون اقل من 5 أسابيع أو ما دامت 12 أسبوعا بعد البذر.

قدرة Calu-3 LCC لاستقطاب يعتمد في جزء منه على كيفية الحفاظ على الخلايا وsubcultured قبل الاستخدام في نظام Transwell. الخلايا التي نمت خارج التقاء 90٪ وأحادي الطبقة خلال subculturing، التي تم subcultured أكثر من 10 مرات من المخزون المجمدة، أو التي لا تكونEN المتوفرة مع الطازجة المتوسطة على جدول منتظم هم أقل عرضة للاستقطاب بالكامل، والاستقطاب أي من المرجح أن ينخفض ​​بسرعة. ويمكن أيضا عدم ناقصة أو الكلي من الاستقطاب يمكن أن يعزى إلى اختلاف في حجم المسام والمواد من Transwells تستخدم لCalu LCC-3، وإلى الكثير الكثير من التباين في تركيبة مماثلة Transwells وحجم المسام قد تؤثر أيضا الاستقطاب. يمكن أحجام أكبر المسام تسمح Calu-3 في النمو من خلال الغشاء Transwell في مقصورة basolateral، ومنع الثقافة من الاستقطاب. وأشار إلى عدم وجود الاستقطاب قد يكون أيضا بسبب نمو البكتيريا، من خلال ثقافة المتوسط ​​بظلالها، مما يؤدي إلى انهيار اللاحقة للمنعطفات ضيقة بين الخلايا Calu-3.

قد يكون سبب القياسات طير متغير من Calu-3 LCC عن اضطرابات الميكانيكية للmonolayers Calu-3 خلية LCC، إدراج، أو لوحات أنفسهم. يجب أن يتم تنفيذ التغييرات والقياسات المتوسطة طير بدون نصائح أو ماصة الكهربائيةدي يؤدي لمس الخلايا. أثناء تنفيذ هذه العمليات، ينبغي الحرص على تجنب إدخال فقاعات الهواء إلى حجرات قمية وbasolateral، والتي سوف تعطيل قدرة voltohmmeter للكشف عن المقاومة. قد يقتصر أيضا على قدرة voltohmmeter للكشف عن المقاومة في ثقافة الاستقطاب التي هي في الواقع من تراكم البروتين يؤدي على القطب. قد تتم إزالة هذا تراكم مع طيف الرملي، أو قد يتم تصحيحها عن طريق الاستعاضة عن القطب.

مرة واحدة Calu-3 LCC استقطاب تماما وطير في تزايد لم يعد، Calu-3 LCC على استعداد لاستخدامها كعامل في المختبر نموذج لوصف ردود المضيف الرئة الخلايا الظهارية لعدوى الجهاز التنفسي. هذا النظام يسمح أفضل توصيف الردود الاتجاه لمسببات الأمراض مقارنة أحادي الطبقة، خطوط الخلايا المستزرعة الرئة تستخدم عادة لدراسة مسببات الأمراض التنفسية، مثل التهاب الكبد وخلايا A549-2، مع مزايا إضافية من Calu-3 باي LCCنانوغرام أسرع لتطوير وبسهولة أكبر الحصول عليها، وأقل تكلفة لتوليد من الابتدائي، NHBE، الاستقطاب متباينة. مماثلة لNHBE، الاستقطاب Calu-3 إثبات مشددة تشكيل تقاطع، وإنتاج mucins. ولكن، خلافا NHBE، الاستقطاب Calu-3 خلايا لا تفرق في طبقات من الخلايا القاعدية والخلايا المهدبة العمودية الطلائية، وعدد قليل الاستقطاب Calu-3-أهداب الخلايا تطوير مثل التوقعات 19. وهكذا، على الرغم من المفيد لدراسة الردود الاستقطاب من الخلايا الظهارية الهوائية لإهانة الجهاز التنفسي، والاستقطاب Calu-3 LCC ليست نموذجا مثاليا لدراسة التنمية مجرى الهواء أو إعادة عرض ردا على إهانة أو إصابة الجهاز التنفسي. قد إنتاج المخاط من قبل الخلايا المستزرعة في المختبر تؤثر العدوى الخلوية، وكذلك الإفراج عن فيروس المعدية وانتشار الفيروس في نموذج الاستقطاب، وإجراء مقارنة مباشرة للإنتاج المخاط بين الاستقطاب LCC-3 Calu ولم تبلغ الاستقطاب، NHBE متباينة تم . A549 والخلايا التهاب الكبد A-2إعادة أسهل للثقافة من الخلايا-3 Calu، ولكن، خلافا Calu-3 LCC، فإنها لا تشكل الثقافات الاستقطاب عندما نمت على إدراج Transwell، وبالتالي هي نماذج مثالية لا لفحص في المختبر ردود الخلايا الظهارية المستقطبة لعدوى فيروس الجهاز التنفسي .

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

الكتاب أود أن أشكر اليزابيث بلانشارد للحصول على المساعدة الفنية لها. النتائج والاستنتاجات الواردة في هذا التقرير هي آراء أصحابها ولا تمثل بالضرورة وجهة نظر مراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Calu-3 ATCC HTB-55
0.05% Trypsin - 0.02% EDTA Gibco/Invitrogen 25300
Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) Gibco/Invitrogen 07-00100DK
Fetal bovine serum (FBS) HyClone SH30070.03 Heat-inactivate, 56 °C, 30 mins
Non-essential amino acids 100X (10 mM) Gibco/Invitrogen 11140 Store at 4 °C in the dark
L-glutamine Gibco/Invitrogen 25030
HEPES Gibco/Invitrogen 15630
EMEM-10% FBS (EMEM-10%) Supplement EMEM with heat-inactivated FBS to 10% serum, sterile-filter
EMEM-20% FBS + supplements (EMEM-20%+S) Supplement EMEM to final concentrations: heat-inactivated FBS, 20%; 1X amino acids; 2 mM L-glutamine; 10 mM HEPES; sterile-filter
24-well Transwell plates Corning Costar 3472 3 μm pore size, polyester
Trypan blue Gibco/Invitrogen 15250
Ethanol Sigma E7023 Prepare to 70% using sterile dH2O
Dulbecco's PBS (D-PBS) Invitrogen 14040
Non-fluorescent buffer 118 mM NaCl; 4.75 mM KCl; 2.53 mM CaCl2×H2O; 2.44 mM MgSO4; 1.19 mM KH2PO4; 25 mM NaHCO3 in sterile water; sterile-filter
Sodium fluorescein Sigma 6377 1 mg/ml in sterile non-fluorescent buffer; sterile-filter, protect from light; store at 4 °C up to 6 months
EQUIPMENT
Voltohmmeter World Precision Instruments
STX2 electrode World Precision Instruments
ELISA plate reader Capable of measuring A486 or A490

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhu, Y., Chidekel, A., Shaffer, T. H. Cultured human airway epithelial cells (calu-3): a model of human respiratory function, structure, and inflammatory responses. Critical care research and practice. 2010, (2010).
  2. Mukherjee, M., Pritchard, D. I., Bosquillon, C. Evaluation of air-interfaced Calu-3 cell layers for investigation of inhaled drug interactions with organic cation transporters in vitro. International journal of pharmaceutics. 426, 7-14 (2012).
  3. Baginski, L., et al. Investigations into the fate of inhaled salmon calcitonin at the respiratory epithelial barrier. Pharmaceutical research. 29, 332-341 (2012).
  4. Vllasaliu, D., Alexander, C., Garnett, M., Eaton, M., Stolnik, S. Fc-mediated transport of nanoparticles across airway epithelial cell layers. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. , (2011).
  5. Vinhas, R., et al. Pollen proteases compromise the airway epithelial barrier through degradation of transmembrane adhesion proteins and lung bioactive peptides. Allergy. 66, 1088-1098 (2011).
  6. Hein, S., Bur, M., Schaefer, U. F., Lehr, C. M. A new Pharmaceutical Aerosol Deposition Device on Cell Cultures (PADDOCC) to evaluate pulmonary drug absorption for metered dose dry powder formulations. European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics : official journal of Arbeitsgemeinschaft fur Pharmazeutische Verfahrenstechnik e. 77, 132-138 (2011).
  7. Huttunen, S., Toivanen, M., Arkko, S., Ruponen, M., Tikkanen-Kaukanen, C. Inhibition activity of wild berry juice fractions against Streptococcus pneumoniae binding to human bronchial cells. Phytotherapy research: PTR. 25, 122-127 (2011).
  8. Elm, C., Rohde, M., Vaerman, J. P., Chhatwal, G. S., Hammerschmidt, S. Characterization of the interaction of the pneumococcal surface protein SpsA with the human polymeric immunoglobulin receptor (hpIgR). The Indian journal of medical research. 119, 61-65 (2004).
  9. Sutherland, T. C., Quattroni, P., Exley, R. M., Tang, C. M. Transcellular passage of Neisseria meningitidis across a polarized respiratory epithelium. Infection and immunity. 78, 3832-3847 (2010).
  10. Grantham, M. L., et al. Palmitoylation of the influenza A virus M2 protein is not required for virus replication in vitro but contributes to virus virulence. Journal of. 83, 8655-8661 (2009).
  11. Saedisomeolia, A., Wood, L. G., Garg, M. L., Gibson, P. G., Wark, P. A. Lycopene enrichment of cultured airway epithelial cells decreases the inflammation induced by rhinovirus infection and lipopolysaccharide. The Journal of nutritional biochemistry. 20, 577-585 (2009).
  12. Yoshikawa, T., Hill, T., Li, K., Peters, C. J., Tseng, C. T. Severe acute respiratory syndrome (SARS) coronavirus-induced lung epithelial cytokines exacerbate SARS pathogenesis by modulating intrinsic functions of monocyte-derived macrophages and dendritic cells. Journal of virology. 83, 3039-3048 (2009).
  13. Yoshikawa, T., et al. Dynamic innate immune responses of human bronchial epithelial cells to severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus infection. PloS one. 5, e8729 (2010).
  14. Hsu, A. C., et al. Critical role of constitutive type I interferon response in bronchial epithelial cell to influenza infection. PloS one. 7, e32947 (2012).
  15. Harcourt, J. L., Caidi, H., Anderson, L. J., Haynes, L. M. Evaluation of the Calu-3 cell line as a model of in vitro respiratory syncytial virus infection. Journal of virological methods. 174, 144-149 (2011).
  16. Zhang, L., Peeples, M. E., Boucher, R. C., Collins, P. L., Pickles, R. J. Respiratory syncytial virus infection of human airway epithelial cells is polarized, specific to ciliated cells, and without obvious cytopathology. Journal of virology. 76, 5654-5666 (2002).
  17. Geys, J., et al. In vitro study of the pulmonary translocation of nanoparticles: a preliminary study. Toxicology letters. 160, 218-226 (2006).
  18. Geys, J., Nemery, B., Hoet, P. H. Optimisation of culture conditions to develop an in vitro pulmonary permeability model. Toxicology in vitro : an international journal published in association with BIBRA. 21, 1215-1219 (2007).
  19. Grainger, C. I., Greenwell, L. L., Lockley, D. J., Martin, G. P., Forbes, B. Culture of Calu-3 cells at the air interface provides a representative model of the airway epithelial barrier. Pharmaceutical research. 23, 1482-1490 (2006).

Tags

العدوى، العدد 72، علم المناعة، والأمراض المعدية، والطب، علم الأحياء الدقيقة، وعلم الفيروسات، علم الأحياء الخلوي، علم الأحياء الجزيئية، علم الأمراض والفيروسات التنفسية المخلوي، المخلوي التنفسي الفيروسات، الإنسان، التقاطب الخليوي، وعلوم الحياة، Calu-3، الاستقطاب زراعة الخلايا، والخلايا الظهارية ، والجهاز التنفسي فيروس والسائلة الثقافة تغطيتها، فيروس، زراعة الخلايا
إرساء ثقافة السائل المغطاة من مجرى الهواء الإنسان المستقطب طلائي Calu-3 خلايا لدراسة استجابة الخلية المضيفة لمسببات الأمراض التنفسية<em&gt; في المختبر</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Harcourt, J. L., Haynes, L. M.… More

Harcourt, J. L., Haynes, L. M. Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro. J. Vis. Exp. (72), e50157, doi:10.3791/50157 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter