Summary
Resultaterne og konklusionerne i denne rapport, er dem af forfatterne og ikke nødvendigvis repræsentere Centers for Disease Control og Forebyggelse.
Abstract
De apikale og basolaterale overflader af luftvejs-epitelceller viser retningsbestemte reaktioner på patogen eksponering in vivo. Således ideel in vitro-modeller til at undersøge cellulære reaktioner til luftvejspatogener polariserer og danner apikale og basolaterale overflader. Én sådan model er differentieret normale humane bronchiale epithelceller (NHBE). Dette system kræver lunge vævsprøver, ekspertise isolering og dyrkning af epitelceller fra væv, og tiden til at frembringe en luft-væske-grænsefladen kultur.
Calu-3 celler, afledt fra en human bronkial adenocarcinom, er en alternativ model til undersøgelse af respons på proximale luftvejs-epitelceller i luftvejene insult 1, farmakologiske forbindelser 2-6, og bakteriel 7-9 og virale patogener, herunder influenzavirus, rhinovirus og svær akut respiratorisk syndrom - associeret coronavirus 10-14. For nylig, we viste, at Calu-3 celler er modtagelige for respiratorisk syncytialvirus (RSV)-infektion i overensstemmelse med NHBE 15,16. Her har vi detalje oprettelsen af et polariseret, væske-dækket kultur (LCC) af Calu-3-celler, der fokuserer på de tekniske detaljer vedrørende dyrkning og dyrkning af Calu-3-celler, opretholde celler, der er blevet dyrket i LCC, og vi præsenterer den fremgangsmåde til udførelse af respiratorisk virusinfektion af polariserede Calu-3 celler.
Konsekvent at opnå polariseret Calu-3 LCC, Calu-3 celler skal nøje subdyrkes før dyrkning i Transwell skær. Calu-3 monolagskulturer bør forblive under 90% konfluens, bør videredyrkes færre end 10 gange fra frossen lager, og bør regelmæssigt forsynes med frisk medium. Når dyrket i Transwells skal Calu-3 LCC skal håndteres med forsigtighed. Uregelmæssige medieændringer og mekanisk eller fysisk afbrydelse af cellelag eller plader negativ indflydelse polarisering forflere timer eller dage. Polarization overvåges ved at vurdere trans-epitel elektrisk modstand (TEER) og verificeres ved at evaluere den passive ækvilibrering af natrium fluorescein mellem de apikale og basolaterale rum 17,18. Når TEER plateauer på eller over 1.000 Ω × cm 2, Calu-3 LCC er klar til at bruge til at undersøge cellulære reaktioner på respiratoriske patogener.
Protocol
1. Dyrkning af Calu-3 celler til brug i Transwell Cultures
Sikkerhedsforanstaltninger: Udfør alle procedurer i en biosikkerhed skab ved hjælp af steril kultur teknik.
- At optø celler fra frossen opbevaring:
- Forberede Eagles Minimum Essential Medium indeholdende 20% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (FBS), 0,1 mM ikke-essentielle aminosyrer, 2 mM L-glutamin, og 10 mM HEPES pH 7,4 (EMEM-20% + S). Sterilt filter det fremstillede medium under anvendelse af en 0,2 um porestørrelse filter, og varme i et vandbad til 37 ° C. For at være mere reflekterende for in situ luftvejsepitel miljø, medium ikke suppleret med antibiotika eller antimykotiske midler.
- Tø en frossen cryovialet i Calu-3 celler hurtigt (<1 min) i et 37 ° C vandbad.
- Overføre de optøede celler til et 50 ml sterilt konisk rør, og der tilsættes 30 ml opvarmet EMEM-20% + S.
- Pelleter cellerne ved centrifugering i 5 minutter ved 1.000-1.200 x g,uden køling, og med lav bremse hastighed.
- Dekanteres forsigtigt, og cellerne resuspenderes i 5 ml opvarmet EMEM-20% + S ved forsigtigt at pipettere op og ned. Seed 2-5 x 10 6 celler per brønd i en 6-brønds vævskulturplade og inkuber ved 37 ° C, 7% CO2 i luft atmosfære, indtil cellerne er 75% - 80% sammenflydende. Kontroller dagligt, op til 7 dage kan være påkrævet. Hver 3-4 dage sug mediet fra cellerne og erstatte det med frisk EMEM-20% + S.
- Til subkultur-celler:
- Varm 0,05% trypsin - 0,02% EDTA i et 37 ° C vandbad. Aspirer fra cellerne, og cellerne vaskes en gang med warmed 0,05% trypsin - 0,02% EDTA for at fjerne overskydende medium og serum. Fjern vask og tilsættes 1 ml opvarmet trypsin per brønd til cellerne.
- Inkuber ved 37 ° C og 7% CO2 og monitor under et mikroskop hvert 5 min, indtil mindst 75% af cellerne løsnes fra brønd (e) af vævskulturplade. Dette kantager mellem 5 og 30 min.
- Vask cellerne i EMEM-20% + S til fjernelse af overskydende trypsin. Overfør trypsinerede celler til et 50 ml sterilt konisk rør. Multiple brønde af celler fra en 6-brønds dyrkningsplade kan samles til et 50 ml sterilt konisk rør. Der tilsættes 30 ml EMEM-20% + S og pelletere cellerne ved centrifugering ved 1.000-1.200 x g uden afkøling og med lav bremse hastigheden.
- Dekanteres forsigtigt, og cellerne resuspenderes i frisk EMEM-20% + S ved forsigtigt at pipettere op og ned. Anvendelse af trin 1.2.1 gennem 1.2.3 ovenfor til Trypsinisér cellerne, stadig subkultur-celler i vævskulturskåle som beskrevet i trin 1.2.5 gennem 1.2.7 når de er mellem 75 til 80% konfluente.
- Subkultur fra en brønd i en 6-brønds plade op til en T-25 cm2 kolbe i et slutvolumen på 5 ml EMEM-20% + S, såning mellem 0,5 og 1 x 10 6 celler / kolbe.
- Anvendelse af 5 ml opvarmet trypsin per T-25 cm2 kolbe at frigøre celler, subkulturfra en T-25 cm2 kolbe op til en T-75 cm2 kolbe i et slutvolumen på 10 ml EMEM-20% + S, såning mellem 1 til 5 x 10 6 celler / kolbe.
- Anvendelse af 8 ml opvarmet trypsin per T-75 cm2 kolbe at frigøre celler, subkultur fra en T-75 cm2 kolbe i 2 T-75 cm2 kolber. For at opnå optimal cellevækst, ikke subkultur-celler i kolber større end T-75 cm2 eller subkultur i et forhold større end 1 forælder kolbe: 3 nye kolber.
- Når først cellerne er blevet subkultiveret, fuldstændigt fjerne og udskifte medium hver 2-3 dage, indtil de når 75-90% konfluens. Celler kan tage op til tre uger for at nå 75-90% konfluens. For optimal generation af polariserede kulturer, subkultur celler, før de vokser ud over 90% sammenløb som et monolag.
- Fortsæt til subkultur celler, indtil nok celler er vokset til frø det ønskede antal Transwell skær. Hver Transwell indsats kræver 2 × 10 5 celler. For optimal ydeevne generere polariserede kulturer, bruge celler, der har undergået ikke mere end 10 subkulturer.
2. Voksende Polariserede Calu-3 Liquid-dækket kulturer (LCC)
Sikkerhedsforanstaltninger: Udfør alle procedurer i en biosikkerhed skab ved hjælp af steril kultur teknik.
- Forbered EMEM indeholdende 10% FBS (EMEM-10%) og varmt i et vandbad til 37 ° C.
- Fremstille en 24-brønds Transwell plade til podning. Ved hjælp af sterile pincetter, Transwell inserts bevæge sig fra det indre til de ydre rækker af pladen uden at røre insert membran. Celler bør kun videredyrkes i brønde på de ydre rækker af pladen. For at forhindre indføring af luftbobler i de basolaterale rum, tilsættes 600 pi EMEM-10% til hver af dem ved at vinkle pipetten mod væggen af hvert rum og langsomt frigive mediet ind i brønden.
- Frigøre celler fra T-75 cm2 væv. Subculture kolber med opvarmet trypsin, og der vaskes i 30 ml EMEM-20% + S pr hver 2 kolber med trypsinerede celler som beskrevet i trin 1.2.
- Grundigt at opblande vaskede celler i 5 ml EMEM-10% ved forsigtigt at pipettere op og ned.
- Påvisning af levedygtighed og samlede celletællinger af trypan blåt udelukkelsesmetoden. Fortsæt kun hvis 80% - 90% er levedygtige.
- I et 50 ml sterilt konisk rør, fortyndes cellerne til en koncentration på 2 × 10 6 levedygtige celler / ml med EMEM-10%.
- Læg celler til det apikale rum i hver Transwell. Til brønde A1 og D1, som vil være cellefrie kontrolbrønde, der, blanke, tilsættes 100 pi EMEM-10% uden celler. Til hver af de resterende brønde, 100 pi resuspenderede Calu-3 celler tilsættes forsigtigt fiskeri pipetten mod den indvendige ledekanal af indsatsens væg og langsomt frigive cellerne. Rør ikke ved pipette til indsatsen membranen. For at opretholde en homogen suspension af Calu-3 celler, ryst forsigtigt cellesuspensionenunder dette seeding trin.
- Inkuber Transwell plade ved 37 ° C og 7% CO2 i luft atmosfære. Anbring pladen i en inkubator, hvor fysisk forstyrrelse vil være minimal. At forbedre effektiviteten af polarisering, at stable plader oven på hinanden.
- For at opretholde kulturer indtil polariseret og klar til brug i eksperimenter, helt erstatte medium i Transwells, som beskrevet i trin 2,10 gennem 2,13 nedenfor. Medium skal være helt erstattet tre dage efter subkultiveret i Transwells, og derefter på en cyklus skiftevis den fjerde og derefter tredje dag efter den foregående fodring, indtil cellerne er helt polariseret.
- Varm EMEM-10% i et vandbad til 37 ° C.
- Forsigtigt aspirere medium fra Transwell skær. Med kapillarrør pipette fastgjort til en vakuum-fælde med en mild vakuum, med eller en 1 ml pipette, aspireringsstilling medium fra cellefrit brønde A1 og D1, derefter fra podede brønde, først at fjerne apikalt medium fra alle brønde, og thøne fjernes basolaterale medium fra alle brønde. Rør ikke indsætte membraner mens sugning medium.
- Der tilsættes 200 pi EMEM-10% til det apikale rum i cellefrit brønde A1 og D1, derefter til den podede brønde, der leder mediet til det apikale kammer med den side af indsatsen til styring af pipettespidsen. Må ikke tilføje medie direkte på cellerne, og ikke røre indsatsen membran.
- Tilsættes 600 pi EMEM-10% til basolaterale rum. For at forhindre indføring af luftbobler i de basolaterale rum, tilføje medium til hver ved vinkling af pipetten mod væggen af hvert rum og langsomt frigive mediet ind i brønden.
3. Evaluering Resistance Udvikling af Calu-3 LCC
Sikkerhedsforanstaltninger: Udfør alle procedurer i en biosikkerhed skab ved hjælp af steril kultur teknik.
- Evaluere trans-epitel elektrisk resistens (TEER) af Calu-3 LCC 30 min eftermedium ændringer; evalueringen kan udføres efter hver medium forandringer, hvis det ønskes. Udføre målinger under sterile betingelser. Begynder målinger med cellefrie kontrolbrønde A1 og D1 (emnerne) for at opnå basisliniemålinger, og fortsætte med målinger for hver brønd.
- Under sterile betingelser, overføre stx2 elektrode til et 50 ml centrifugerør indeholdende 70% ethanol i sterilt vand og steriliseres 15 min.
- Kalibrere og afprøve voltohmmeter til anvendelse ifølge producentens anvisninger.
- Tag elektroden fra ethanol, lufttørre 5-10 sek, og skylles elektroden med sterilt EMEM-10%.
- Indstil funktionsvælgeren til voltohmmeter til indstilling af modstanden, og tænde ON.
- Forsigtigt placere elektroden i en af de tre porte, som giver adgang til den basolaterale rum i en Transwell kultur. Sted elektrode, således at den længere fører netop rører bunden af den ydre brønd og forbliver vertikal,og den kortere bly er i vævskulturmedium af den apikale kammer, uden at røre insert membran.
- Push "Measure R" knappen, og vent på, at aflæsningen kan stabilisere sig. Gentag for de andre to porte til hver brønd og registrere målingerne fra alle tre porte, for i alt tre målinger per brønd. Fortsætte med at måle modstand for alle huller i celler.
- Rengør elektroden ved gennemvædning 5-10 min i 70% ethanol, skylning i sterilt dH2O og tørring grundigt. Opbevares i den originale beholder.
- Beregne modstanden i hver brønd under anvendelse af ligning 1..
Ω faktiske = Ω prøven - Ω blank, ligning 1
hvor Ω prøve er gennemsnittet måling fra en podet brønd og Ω råemnet er den gennemsnitlige måling fra to brønde, A1 og D1, som indeholder inserter og medium, men ikke celler. - Beregne arealenhed modstand, ved hjælp Equation 2.
Ω faktiske × effektive membranareal = Ω x cm 2, ligning 2
hvor den effektive membranareal er 0,33 cm2 i 24-brønds Transwell inserts.
- Kontroller, at polariseringen er komplet ved at udføre en sekundær analyse, måling passiv natriumfluorescein diffusion mellem de apikale og basolaterale rum, på 02:59 Transwell kulturer. Brøndene, der anvendes til natriumfluorescein assayet skal kasseres umiddelbart efter afslutningen af assayet.
- Fremstille ikke-fluorescerende puffer (118 mM NaCl; 4,75 mM KCI, 2,53 mM CaCl2 0,2 H2O, 2,44 mM MgSO4, 1,19 mM KH 2 PO 4, 25 mM NaHCO3 i sterilt vand, sterilt filter med 0,45 um filtreringsindretning ). Forbered natriumfluorescein ved 1 mg / ml i ikke-fluorescerende buffer, sterilt filter, wrap i aluminiumsfolie, og opbevares ved 4 ° C, beskyttet mod lys. Varm til rum temre før brug.
- Efter at have udfyldt modstandsmålinger, fjern forsigtigt medium fra både basolaterale og apikale rum på én til tre individuelle Transwell kulturer.
- Skyl Transwell kulturer. Forsigtigt tilsættes 600 pi stuetemperatur sterilt Dulbeccos PBS (D-PBS) til basolaterale rum og 100 pi stuetemperatur sterile D-PBS til de apikale rum.
- Fjern forsigtigt D-PBS fra brønde. Tilsættes 600 pi sterile ikke-fluorescerende puffer til basolaterale rum. Tilsæt 100 pi sterilt 1 mg / ml natrium-fluorescein til de apikale rum.
- Inkubér pladen ved 37 ° C i 1 time. CO 2 er ikke nødvendig under denne inkubering.
- Under inkubation udarbejde en natriumfluorescein standardkurve i området mellem 20 ug / ml og 0 ug / ml, ved hjælp af ikke-fluorescerende puffer til fortynding natriumfluorescein. Forberede mindst 8 forskellige koncentrationer af natriumfluorescein, hver i et slutvolumen på mindst 600 pi. Holdstandardkurve fortyndinger beskyttet mod lys indtil klar til at måle absorbansen.
- Overfør ikke-fluorescerende puffer prøve fra den basolaterale rum i hver test Transwell til en separat rent rør til analyse. Tag testen Transwells bruges til at undersøge passiv natriumfluorescein diffusion fra pladen, og kassér. Returnere pladen med resterende Transwells til inkubatoren.
- Anbring 100 ul af hver standardopløsning in triplo til en 96 brønds fladbundet plade.
- Der fremstilles tre fortyndinger af hver basolaterale prøve (1:2, 1:20 og 1:50) i ikke-fluorescerende puffer, og der tilsættes 100 pi af hver fortyndet prøve og af hver fortynding, i to eksemplarer, i en 96-brønds flad- bundpladen.
- Foranstaltning prøveabsorbans på en ELISA-pladelæser ved 486 nm eller 490 nm.
- Bestemme koncentrationen af natriumfluorescein i den basolaterale rum ved at sammenligne absorbansen for prøverne mod de absorbansværdier for natriumfluorescein standard kurve.
4. Inficerende Polarized Calu-3 LCC med respiratorisk virus
Sikkerhedsforanstaltninger: Udfør alle procedurer i en biosikkerhed skab ved hjælp af steril kultur teknik, på et biosikkerhedsniveauet hensigtsmæssigt for virus, der anvendes.
- Fortynd virus i serumfrit EMEM, således at den ønskede inokula ville være i 100 pi.
- Vask cellerne i serumfrit EMEM. Forsigtigt sug mediet fra alle brønde, fjerner det apikale medium derefter den basolaterale medium. Med kapillarrør pipette fastgjort til en vakuum-fælde med en mild vakuum, eller med en standard 1 ml pipette, aspireringsstilling medium fra cellefrit brønde A1 og D1, derefter fra podede brønde, fjernes først det apikale medium fra alle brønde, og derefter fjerne den basolaterale medium fra alle brønde. Rør ikke indsætte membraner mens sugning medium.
- Tilsættes 100 ul serumfrit EMEM til det apikale rum i cellefrit brønde A1 og D1, og derefter til tHan podede brønde, lede medium til det apikale kammer ved hjælp af den side af indsatsen til styring af pipettespidsen. Må ikke tilføje medie direkte på celler, og ikke røre indsatsen membran.
- Tilsættes 600 ul serumfrit EMEM til basolaterale rum. Læg medium til hver Transwell ved vinkling af pipetten mod væggen af kammeret og langsomt frigive mediet ind i brønden.
- Aspirer forsigtigt serumfrit medium fra brønde.
- Begyndende med uinficerede eller mock-inficerede brønde, passende virus fortyndinger tilføje til den apikale rum i Transwells. For ikke-inficerede brønde tilsættes 100 ul serumfrit EMEM til det apikale rum i passende Transwells, for mock-inficerede brønde tilsættes 100 ul virusfrit præparat fortyndet i serumfrit EMEM til det apikale rum i passende Transwells, og virusinfektion, fortyndet virus i serumfrit EMEM, og 100 ul til de apikale rum i passende Transwells.
- Tilsættes 600 ul serumfrit EMEM til alle basolaterale rum.
- Inkuber ved 37 ° C og 7% CO2 i 2 timer.
- Aspirér medium fra brønde, først fra uinficerede og mock-inficerede brønde, og derefter fra inficerede brønde. Fjern apikale supernatanter først, efterfulgt af basolaterale supernatanter.
- Erstat medium med 200 pi EMEM-10% i det apikale rum og 600 pi EMEM-10% i de basolaterale rum.
Representative Results
Hvis de dyrkes som væske-dækkede kulturer (LCC) i Transwell dyrkningssystemer, som vist i figur 1, Calu-3 celler polariserer, udvikle forskellige apikale og basolaterale overflader. Efter den her beskrevne fremgangsmåde, trans-epitel elektrisk resistens (TEER) af Calu-3 LCC når et plateau ved eller over 1000 Ω x cm 2 inden for 3 uger efter podning, hvoraf et eksempel er vist i figur 2. De stramme kryds dannet mellem polariserede celler forhindre passiv ækvilibrering af små molekyler mellem de apikale og basolaterale rum. Således er en modificeret natriumfluorescein ækvilibrering assay anvendt til at bekræfte polarisering af Calu-3 LCC 15,17,18. Som TEER i Calu-3 cellemonolag i LCC stiger, falder mængden af fluorescein, som passivt ækvilibrerer til den basolaterale rum. Når TEER er 1.000 Ω x cm 2, mængden af fluorescein, som ækvilibrerer iden basolaterale rum er ≤ 1%, som vist i figur 3, og derfor er Calu-3 LCC for at være fuldt polariseret når TEER er ≥ 1000 Ω x cm2. Peak TEER måling af Calu-3 LCC kan variere fra forsøg til forsøg. Men når TEER-værdier plateau på et givet forsøg, kan en fuldt polariseret, uinficeret Calu-3 LCC være stabil i 5 til 12 uger efter såning. Fravær af resistensudvikling i Transwell-dyrkede Calu-3 kan skyldes flere faktorer, som er skitseret i tabel 1.. Når TEER i Calu-3 LCC plateauer ved eller over 1000 Ω x cm2, at modellen er klar til at blive anvendt til at undersøge luftvejs-epitelceller svar på respiratoriske patogener, herunder respiratorisk syncytialvirus (RSV). Udsættelse for RSV resulterer i et hurtigere fald i polariseret kultur integritet sammenlignet med en mock-infektion af celler (figur 4).
Figur 1. Tværsnit repræsentation af Transwell-dyrkede celler. Celler dyrkes på den apikale overflade af indsatsen membran.
Figur 2. Udvikling af trans-epitel elektrisk resistens (TEER) og polariseringen af Calu-3 celler efter podning i Transwell inserts. På hvert tidspunkt, er TEER præsenteret som median Ω x cm 2 ± SEM af 32 uafhængige brønde fra et repræsentativt eksperiment.
Figur 3. Passiv equili brering af natriumfluorescein i den basolaterale rum i Calu-3 cellemonolag inhiberes som cellerne bliver polariseret. Kumulative data fra fire uafhængige forsøg er vist. Hvert datapunkt repræsenterer en enkelt måling.
Figur 4. RSV-infektion af polariseret Calu-3 LCC accelererer et fald i monolag integritet. Polariserede Calu-3 celler blev inficeret med RSV-A2 ved en MOI = 1 på dag 0, og polariteten blev overvåget i 8 uger efter infektion. Et repræsentativt eksperiment er vist. Data er præsenteret som median modstand 8 uafhængige brønde pr infektion ± SEM per tidspunkt. * P <0,05 mellem mock-og RSV-A2-inficerede kulturer som bestemt ved Students t-test.
- Fjern eventuelle luftbobler i brøndene
- Brug Calu-3 celler, der er subdyrket fra frosset mindre end 10 gange
- Lad ikke Calu-3-celler til at nå op på 100% konfluens i monolag subkultur
- Kontrollere, at cellerne ikke vokser på plastik godt stykke under indsatsen (hvilket indikerer, at celler kan have vokset gennem porerne i indsatsens)
- Tillad 2-3 uger efter såning for fuld udvikling af resistens
- Kontroller sammensætning og porestørrelse af indsatse anvendes, ændres, hvis nødvendigt (anbefalet polyester indsats, 0,3 um porestørrelse, ingen belægninger, se materialer for detaljer)
- Kontrollere kvaliteten af elektroden, slibning forsigtigt for at fjerne akkumulerede proteiner fra spidsen, og erstatte om nødvendigt
- Tjek medium for bakterievækst
- Tillad ekstra tid til polarisering til at udvikle (lejlighedsvis kan tage op til 4 uger)
- Brug Calu-3 celler, der er subdyrket fra frosset mindre end 10 gange
- Lad ikke Calu-3-celler til at nå op på 100% konfluens i monolag subkultur
- Konsekvent erstatte medium i Transwell kulturer, vekslende mellem den tredje og derefter fjerde dag efter tidligere fodring
- Kun kultur celler på indsatser, der er placeret i de udvendige rækker af plader
- Brug en anden masse Transwell skær
- Du må ikke forstyrre eller stable pladerne i inkubatoren
- Må ikke forårsage vibrationer i biosikkerhed skab mens Transwell plates bliver håndteret
- Fjern eventuelle luftbobler i brøndene
- Forstyr ikke cellelaget med pipettespidser, når skiftende medier eller udføre TEER aflæsninger
- Brug 200 ul medium i det apikale rum, lavere volumen kan resultere i ustabile TEER aflæsninger
- Kontrollere kvaliteten af elektroden, slibning forsigtigt for at fjerne akkumulerede proteiner fra spidsen, og udskiftes om nødvendigt
Tabel 1. Trouble-shooting problemer der kan opstå, når dyrkning af Calu-3 celler i Transwells. Flere faktorer bidrager til fuld polarisering af Calu-3-celler i flydende-dækkede kulturer, den mest sandsynlige af dem er fremhævet i denne tabel.
Discussion
Ved etableringen af Calu-3 LCC i Transwell inserts kan celler ikke polarisere overhovedet, eller måske ikke fuldt polarisere som defineret i et TEER ≥ 1000 Ω x cm 2 og ≤ 1% natrium fluoresceinfarvestoffet ækvilibrering mellem de apikale og basolaterale rum. Desuden kan Calu-3 celler i LCC fuldt polariserer, men TEER ikke stemmer overens mellem målingerne. Selv om udsving i TEER målinger af Calu-3 LCC er normale fra dag til dag, er når det er fuldt polariseret, dramatiske udsving i TEER forventes først at kulturen naturligt falder med alderen, hvilket kan være så lidt som 5 uger eller så længe 12 uger efter podning.
Evnen af Calu-3 LCC at polarisere afhænger til dels af, hvordan cellerne vedligeholdes og subkultiveres før anvendelse i Transwell system. Celler, der er vokset ud over 90% konfluens som et monolag ved subkultivering, der er blevet subkultiveret mere end 10 gange fra frossen lager, eller som ikke eren forsynet med frisk medium med jævne mellemrum er mindre tilbøjelige til fuldt ud at polarisere, og enhver polarisering sandsynligvis vil falde hurtigt. Ufuldstændige eller fuldstændige mangel på polarisation kan også tilskrives forskelle i materiale og porestørrelse Transwells anvendes til Calu-3 LCC, og parti-til-parti variation i Transwells med lignende sammensætning, og porestørrelsen kan også påvirke polarisering. Større porestørrelser kan tillade Calu-3 at vokse gennem Transwell membran ind i basolaterale rum, forhindrer kulturen fra polariserende. Et fravær af polarisering kan også skyldes bakterievækst, angives med overskygges dyrkningsmedium, hvilket fører til efterfølgende fordeling af de tætte forbindelser mellem Calu-3 celler.
Variable TEER målinger af Calu-3 LCC kan skyldes mekaniske forstyrrelser af Calu-3 LCC cellemonolag, indsatsene eller pladerne selv. Medium ændringer og TEER målinger bør udføres uden pipettespidser eller elektrode fører røre cellerne. Under udførelsen af disse operationer, bør der udvises omhu for at undgå at indføre luftbobler i de apikale og basolaterale rum, som vil forstyrre evne til voltohmmeter at detektere modstand. Evnen af voltohmmeter at detektere modstand i en kultur, der er faktisk polariseret kan også begrænset af proteinbelægninger på elektroderne. Denne ophobning kan fjernes ved forsigtig slibning, eller kan korrigeres ved udskiftning af elektroden.
Når Calu-3 LCC fuldstændig polarisering og TEER ikke mere er stigende, Calu-3 LCC er klar til anvendelse som en in vitro model til karakterisering host lungeepitelceller celle respons på luftvejsinfektion. Dette system muliggør bedre karakterisering af retningsbestemte reaktioner på patogener i forhold til monolag-dyrkede lunge cellelinier traditionelt anvendes til at studere respiratoriske patogener, såsom A549 og HEp-2-celler, med de yderligere fordele, Calu-3 LCC being hurtigere at udvikle, lettere opnås, og mindre dyrt at generere end primære, polariserede, differentieret NHBE. Svarende til NHBE, polariseret Calu-3 viser tight junction-dannelse og fremstilling af muciner. Men i modsætning NHBE, har polariserede Calu-3 celler ikke differentiere til lag af basale celler og cilierede søjleformede epitelceller, og få polariserede Calu-3 celler udvikler cilia-fremspring 19. Således kan være nyttig i behandlingen af polariserede reaktioner luftvejene epitelceller til respiratorisk fornærmelse, er polariseret Calu-3 LCC ikke en ideel model til at undersøge luftvejene udvikling eller remodeling som reaktion på respiratorisk fornærmelse eller skade. Slimproduktion fra dyrkede celler in vitro kan påvirke cellulær infektivitet, og frigivelse af infektiøst virus og virus spredes i en polariseret model, og en direkte sammenligning af slimproduktion mellem polariseret Calu-3 LCC og polariseret, differentieret NHBE er ikke rapporteret . A549 og HEp-2-celler enre lettere at kulturen end Calu-3 celler, dog i modsætning Calu-3 LCC, danner de ikke polariserede kulturer ved dyrkning på Transwell inserts, og er således ikke ideelle modeller til undersøgelse in vitro svarene fra polariserede epithelceller til respiratorisk virusinfektion .
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Elisabeth Blanchard for hendes teknisk bistand. Resultaterne og konklusionerne i denne rapport, er dem af forfatterne og ikke nødvendigvis repræsentere Centers for Disease Control og Forebyggelse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Calu-3 | ATCC | HTB-55 | |
| 0.05% Trypsin - 0.02% EDTA | Gibco/Invitrogen | 25300 | |
| Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) | Gibco/Invitrogen | 07-00100DK | |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | SH30070.03 | Heat-inactivate, 56 °C, 30 mins |
| Non-essential amino acids 100X (10 mM) | Gibco/Invitrogen | 11140 | Store at 4 °C in the dark |
| L-glutamine | Gibco/Invitrogen | 25030 | |
| HEPES | Gibco/Invitrogen | 15630 | |
| EMEM-10% FBS (EMEM-10%) | Supplement EMEM with heat-inactivated FBS to 10% serum, sterile-filter | ||
| EMEM-20% FBS + supplements (EMEM-20%+S) | Supplement EMEM to final concentrations: heat-inactivated FBS, 20%; 1X amino acids; 2 mM L-glutamine; 10 mM HEPES; sterile-filter | ||
| 24-well Transwell plates | Corning Costar | 3472 | 3 μm pore size, polyester |
| Trypan blue | Gibco/Invitrogen | 15250 | |
| Ethanol | Sigma | E7023 | Prepare to 70% using sterile dH2O |
| Dulbecco's PBS (D-PBS) | Invitrogen | 14040 | |
| Non-fluorescent buffer | 118 mM NaCl; 4.75 mM KCl; 2.53 mM CaCl2×H2O; 2.44 mM MgSO4; 1.19 mM KH2PO4; 25 mM NaHCO3 in sterile water; sterile-filter | ||
| Sodium fluorescein | Sigma | 6377 | 1 mg/ml in sterile non-fluorescent buffer; sterile-filter, protect from light; store at 4 °C up to 6 months |
| EQUIPMENT | |||
| Voltohmmeter | World Precision Instruments | ||
| STX2 electrode | World Precision Instruments | ||
| ELISA plate reader | Capable of measuring A486 or A490 | ||
References
- Zhu, Y., Chidekel, A., Shaffer, T. H. Cultured human airway epithelial cells (calu-3): a model of human respiratory function, structure, and inflammatory responses. Critical care research and practice. 2010, (2010).
- Mukherjee, M., Pritchard, D. I., Bosquillon, C. Evaluation of air-interfaced Calu-3 cell layers for investigation of inhaled drug interactions with organic cation transporters in vitro. International journal of pharmaceutics. 426, 7-14 (2012).
- Baginski, L., et al. Investigations into the fate of inhaled salmon calcitonin at the respiratory epithelial barrier. Pharmaceutical research. 29, 332-341 (2012).
- Vllasaliu, D., Alexander, C., Garnett, M., Eaton, M., Stolnik, S. Fc-mediated transport of nanoparticles across airway epithelial cell layers. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. , (2011).
- Vinhas, R., et al. Pollen proteases compromise the airway epithelial barrier through degradation of transmembrane adhesion proteins and lung bioactive peptides. Allergy. 66, 1088-1098 (2011).
- Hein, S., Bur, M., Schaefer, U. F., Lehr, C. M. A new Pharmaceutical Aerosol Deposition Device on Cell Cultures (PADDOCC) to evaluate pulmonary drug absorption for metered dose dry powder formulations. European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics : official journal of Arbeitsgemeinschaft fur Pharmazeutische Verfahrenstechnik e. 77, 132-138 (2011).
- Huttunen, S., Toivanen, M., Arkko, S., Ruponen, M., Tikkanen-Kaukanen, C. Inhibition activity of wild berry juice fractions against Streptococcus pneumoniae binding to human bronchial cells. Phytotherapy research: PTR. 25, 122-127 (2011).
- Elm, C., Rohde, M., Vaerman, J. P., Chhatwal, G. S., Hammerschmidt, S. Characterization of the interaction of the pneumococcal surface protein SpsA with the human polymeric immunoglobulin receptor (hpIgR). The Indian journal of medical research. 119, 61-65 (2004).
- Sutherland, T. C., Quattroni, P., Exley, R. M., Tang, C. M. Transcellular passage of Neisseria meningitidis across a polarized respiratory epithelium. Infection and immunity. 78, 3832-3847 (2010).
- Grantham, M. L., et al. Palmitoylation of the influenza A virus M2 protein is not required for virus replication in vitro but contributes to virus virulence. Journal of. 83, 8655-8661 (2009).
- Saedisomeolia, A., Wood, L. G., Garg, M. L., Gibson, P. G., Wark, P. A. Lycopene enrichment of cultured airway epithelial cells decreases the inflammation induced by rhinovirus infection and lipopolysaccharide. The Journal of nutritional biochemistry. 20, 577-585 (2009).
- Yoshikawa, T., Hill, T., Li, K., Peters, C. J., Tseng, C. T. Severe acute respiratory syndrome (SARS) coronavirus-induced lung epithelial cytokines exacerbate SARS pathogenesis by modulating intrinsic functions of monocyte-derived macrophages and dendritic cells. Journal of virology. 83, 3039-3048 (2009).
- Yoshikawa, T., et al. Dynamic innate immune responses of human bronchial epithelial cells to severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus infection. PloS one. 5, e8729 (2010).
- Hsu, A. C., et al. Critical role of constitutive type I interferon response in bronchial epithelial cell to influenza infection. PloS one. 7, e32947 (2012).
- Harcourt, J. L., Caidi, H., Anderson, L. J., Haynes, L. M. Evaluation of the Calu-3 cell line as a model of in vitro respiratory syncytial virus infection. Journal of virological methods. 174, 144-149 (2011).
- Zhang, L., Peeples, M. E., Boucher, R. C., Collins, P. L., Pickles, R. J. Respiratory syncytial virus infection of human airway epithelial cells is polarized, specific to ciliated cells, and without obvious cytopathology. Journal of virology. 76, 5654-5666 (2002).
- Geys, J., et al. In vitro study of the pulmonary translocation of nanoparticles: a preliminary study. Toxicology letters. 160, 218-226 (2006).
- Geys, J., Nemery, B., Hoet, P. H. Optimisation of culture conditions to develop an in vitro pulmonary permeability model. Toxicology in vitro : an international journal published in association with BIBRA. 21, 1215-1219 (2007).
- Grainger, C. I., Greenwell, L. L., Lockley, D. J., Martin, G. P., Forbes, B. Culture of Calu-3 cells at the air interface provides a representative model of the airway epithelial barrier. Pharmaceutical research. 23, 1482-1490 (2006).
