Summary
De bevindingen en conclusies in dit rapport zijn die van de auteurs en vertegenwoordigen niet noodzakelijkerwijs de mening van de Centers for Disease Control and Prevention.
Abstract
De apicale en basolaterale oppervlak van epitheelcellen tonen directionele reactie op pathogenen exposure in vivo. Dus ideaal in vitro modellen voor de behandeling van cellulaire reacties op respiratoire pathogenen polariseren, die apicale en basolaterale oppervlakken. Een dergelijk model wordt gedifferentieerd normale menselijke bronchiale epitheelcellen (NHBE). Dit systeem heeft longweefsel monsters, expertise isoleren en kweken epitheelcellen van weefsel en tijd om een lucht-water grensvlak cultuur genereren.
Calu-3-cellen, afgeleid van een humane bronchiale adenocarcinoma, een alternatief model voor het onderzoeken van de reactie van proximale epitheelcellen de ademhalingswegen insult 1, farmacologische verbindingen 2-6, 7-9 en bacteriële en virale pathogenen, zoals influenza virus, rhinovirus en severe acute respiratory syndrome - geassocieerde coronavirus 10-14. Recent, we aangetoond dat Calu-3-cellen gevoelig zijn voor respiratoir syncytieel virus (RSV) infectie in overeenstemming met NHBE 15,16. Hier hebben we detail de oprichting van een gepolariseerde, vloeistof bedekte cultuur (LCC) van Calu-3-cellen, gericht op de technische details van de teelt en het kweken van Calu-3-cellen, het onderhouden van cellen die zijn gekweekt in LCC, en presenteren we de werkwijze voor het uitvoeren respiratoire virus infectie van gepolariseerd Calu-3-cellen.
Om consequent te verkrijgen gepolariseerde Calu-3 LCC, Calu-3-cellen moeten zorgvuldig worden gekweekt voor het kweken in Transwell inserts. Calu-3 monolaagkweken blijven dan 90% confluentie worden gekweekt minder dan 10 keer van bevroren voorraad, en moet regelmatig worden met vers medium. Eenmaal gekweekt in transwells, moet Calu-3 LCC met zorg worden behandeld. Onregelmatige media veranderingen en mechanische of fysische verstoring van de cel lagen of platen negatieve invloed polarisatie voorenkele uren of dagen. Polarisatie wordt gecontroleerd door evaluatie trans-epitheliale elektrische weerstand (TEER) en wordt gecontroleerd door evaluatie van de passieve evenwichtsinstelling van natriumfluoresceïne tussen de apicale en basolaterale compartimenten 17,18. Eenmaal TEER plateaus op of boven 1.000 Ω · cm 2, Calu-3 LCC zijn klaar voor gebruik om de cellulaire responsen na te gaan in respiratoire pathogenen.
Protocol
1. Kweken Calu-3 cellen voor gebruik in Transwell Cultures
Veiligheidsmaatregelen: Voer alle procedures in een bioveiligheid kast met steriele cultuur techniek.
- Om cellen van bevroren opslag ontdooien:
- Bereid Minimum Essential Eagle's medium dat 20% hitte-geïnactiveerd foetaal bovine serum (FBS), 0,1 mM niet-essentiële aminozuren, 2 mM L-glutamine, en 10 mM HEPES pH 7,4 (EMEM-20% + S). Steriel filter het bereide medium met een 0,2 urn poriegrootte filter en warm in een waterbad tot 37 ° C. Om meer een afspiegeling is van de in situ luchtwegepitheel omgeving, is medium niet aangevuld met antibiotica of antimycotica.
- Ontdooi een bevroren Cryovial van Calu-3 cellen snel (<1 min) in een 37 ° C waterbad.
- Breng de ontdooide cellen naar een steriele 50 ml conische buis en voeg 30 ml verwarmd EMEM-20% + S.
- Pelleteren van de cellen door centrifugatie gedurende 5 minuten bij 1,000-1,200 xg,zonder koeling, en met een lage rem snelheid.
- Giet het supernatant voorzichtig en suspendeer de cellen in 5 ml EMEM-20 opgewarmde% + S voorzichtig op en neer pipetteren. Zaad 2 tot 5 x 10 6 cellen per putje in een 6-well weefselkweekplaat en incubeer bij 37 ° C, 7% CO2 in lucht atmosfeer tot de cellen 75% - 80% confluent. Controleer dagelijks, tot 7 dagen kan noodzakelijk zijn. 3-4 dagen aspireer het medium van de cellen en vervangen door vers EMEM-20% + S.
- Om subcultuur cellen:
- Warm 0,05% trypsine - 0,02% EDTA in een 37 ° C waterbad. Zuig het medium van de cellen en eenmaal wassen cellen met verwarmde 0,05% trypsine - 0,02% EDTA om overtollig medium en serum te verwijderen. Verwijder het wassen en voeg 1 ml verwarmd trypsine per putje om de cellen.
- Incubeer bij 37 ° C en 7% CO2 en monitor onder een microscoop om de 5 min tot ten minste 75% van de cellen los van de put (s) van de weefselkweekplaat. Dit kaner 5 tot 30 minuten.
- Was de cellen in EMEM-20% + S om overmaat trypsine te verwijderen. Breng de getrypsiniseerde cellen in een 50 ml steriele conische buis. Meerdere putjes cellen van een 6-well kweekplaat worden samengevoegd in een 50 ml steriele conische buis. Voeg 30 ml EMEM-20% + S en de pellet cellen door centrifugatie bij 1,000-1,200 xg, zonder koeling, en met lage snelheid remmen.
- Voorzichtig Giet het supernatant en resuspendeer de cellen in vers EMEM-20% + S voorzichtig op en neer pipetteren. Met behulp van de stappen 1.2.1 tot 1.2.3 hierboven om de cellen trypsinize, om subcultuur cellen blijven in weefselkweekplaten zoals beschreven in de stappen 1.2.5 tot 1.2.7 als ze tussen de 75 - 80% confluent.
- Subcultuur van een putje van een 6-well plaat tot een T-25 cm2 fles in een eindvolume van 5 ml EMEM-20% + S, zaaien tussen 0,5 tot 1 x 10 6 cellen / kolf.
- Met 5 ml trypsine verwarmd per T-25 cm2 kolf cellen los subcultuurvan een T-25 cm2 fles tot een T-75 cm2 fles in een eindvolume van 10 ml EMEM-20% + S, zaaien van 1 tot 5 x 10 6 cellen / kolf.
- Met 8 ml trypsine verwarmd per T-75 cm2 fles voor cellen subcultuur losmaken van een T-75 cm2 fles in 2 T-75 cm2 flessen. Voor optimale celgroei, niet subcultuur cellen in kolven groter dan 75 cm T-2 of subcultuur in een verhouding groter dan 1 parent kolf: 3 nieuwe flessen.
- Zodra cellen zijn gekweekt, volledig verwijderen en vervangen medium om de 2 tot 3 dagen totdat ze 75-90% confluentie. Cellen kan tot 3 weken 75-90% confluentie bereiken. Voor een optimale generatie van gepolariseerde culturen, subcultuur cellen voordat ze groeien dan 90% confluentie als een monolaag.
- Blijf subcultuur cellen totdat er genoeg cellen zijn uitgegroeid tot zaad het gewenste aantal Transwell inserts. Elke Transwell insert is 2 x 10 5 cellen. Voor optimale prestaties genereren gepolariseerde culturen gebruiken cellen die ondergaan niet meer dan 10 subculturen.
2. Groeiende Gepolariseerde Calu-3 Liquid bedekte culturen (LCC)
Veiligheidsmaatregelen: Voer alle procedures in een bioveiligheid kast met steriele cultuur techniek.
- Bereid EMEM met 10% FBS (EMEM-10%) en warm in een waterbad tot 37 ° C.
- Bereid een 24-well Transwell plaat voor het zaaien. Met behulp van een steriel pincet, bewegen Transwell inserts van de binnenkant naar de buitenkant rijen van de plaat zonder het aanraken van de insert membraan. Cellen moeten alleen gekweekt in putten op de buitenkant van de plaat rijen. De invoering van luchtbellen te voorkomen in de basolaterale compartimenten, voeg 600 ul van EMEM-10% aan elk van de hoek van de pipet tegen de wand van elk compartiment en langzaam los het medium in de put.
- Los cellen van T-75 cm2 weefselkweek. Subculture kolven met trypsine verwarmd, en was in 30 ml EMEM-20% + S per elke 2 kolven van trypsine cellen, zoals beschreven in stap 1.2.
- Grondig gewassen resuspendeer de cellen in 5 ml EMEM-10% door het voorzichtig op en neer pipetteren.
- Bepaal levensvatbare en de totale celtellingen door de trypan blauw uitsluiting methode. Ga alleen als 80% - 90% zijn haalbaar.
- In een 50 ml steriele conische buis, verdun celconcentratie van 2 x 10 6 levensvatbare cellen / ml met EMEM-10%.
- Voeg cellen aan het apicale compartiment van elk Transwell. De putjes A1 en D1, die zal worden celvrije controleputjes, dat, blanco, 100 ul EMEM-10% toe zonder cellen. Aan elk van de resterende putjes, 100 ul geresuspendeerde Calu-3 cellen voorzichtig de hoek van de pipet tegen de binnenzijde geleidingskanaal van de insert wand en langzaam loslaten van de cellen. Gebruik de pipet niet in aanraking met de insert membraan. Om een homogene suspensie van Calu-3 bloedcellen voorzichtig schudden de celsuspensietijdens deze stap zaaien.
- Incubate Transwell plaat bij 37 ° C en 7% CO2 in lucht atmosfeer. Leg de plaat in een incubator waar fysieke verstoring minimaal zal zijn. Om de efficiëntie van polarisatie verbeteren, niet stapelen platen op elkaar.
- Om kweken te handhaven totdat gepolariseerd en klaar voor gebruik in experimenten volledig vervangen medium in transwells, zoals beschreven in stap 2,10 tot 2,13 hieronder. Medium moet volledig vervangen worden drie dagen na subcultuur in transwells en een hertz tussen de vierde en derde dag na de vorige voeding tot cellen volledig gepolariseerd.
- Warm EMEM-10% in een waterbad tot 37 ° C.
- Zuig medium van Transwell inserts. Met een capillaire pipet met het vacuümsysteem trap met een zacht vacuüm, of een standaard 1 ml pipet, aspiraat medium van celvrije putjes A1 en D1, dan van seeded wells eerste verwijderen apicale medium van alle putjes en tkip verwijderen basolaterale medium uit alle putjes. Raak insert membranen tijdens het opzuigen medium.
- Voeg 200 ul EMEM-10% van de apicale compartiment van cel putjes A1 en D1, daarna de geënte putjes, leiden het medium in het apicale compartiment met de zijkant van het inzetstuk aan de pipetpunt leiden. Voeg geen medium direct op cellen, en raak het inzetstuk membraan.
- Voeg 600 ul van EMEM-10% van de basolaterale compartimenten. De invoering van luchtbellen te voorkomen in de basolaterale compartimenten toe medium aan elk van de hoek van de pipet tegen de wand van elk compartiment en langzaam los het medium in de put.
3. Het evalueren van resistentie-ontwikkeling van Calu-3 LCC
Veiligheidsmaatregelen: Voer alle procedures in een bioveiligheid kast met steriele cultuur techniek.
- Evalueer trans-epitheliale elektrische weerstand (TEER) van Calu-3 LCC 30 min namedium veranderingen, de evaluatie kan worden uitgevoerd na elke medium verandering indien gewenst. Voer metingen onder steriele omstandigheden. Beginnen metingen met de celvrije controleputjes A1 en D1 (de blanco) tot nulmetingen verkrijgen, en verder met metingen voor elk putje.
- Onder steriele omstandigheden, overdragen stx2 elektrode een 50 ml centrifugebuis bevattende 70% ethanol in steriel water en 15 min steriliseren.
- Kalibreer en test de voltohmmeter voor gebruik volgens fabrikant.
- Verwijder de elektrode uit de ethanol, lucht drogen 5-10 sec, en spoel de elektrode met een steriele EMEM-10%.
- Zet de modusschakelaar van de voltohmmeter om de weerstand instelling en zet het apparaat in.
- Plaats voorzichtig de elektrode in een van de drie poorten die toegang te verlenen tot de basolaterale compartiment van een Transwell cultuur. Place elektrode zodat de lange draad slechts licht tegen de onderkant van de buitenste goed en de hoogte,en kortere doorlooptijd is in het weefselkweekmedium van het apicale compartiment, zonder het inzetstuk membraan.
- Druk op "Measure R" knop en wacht tot de waarde stabiel is. Herhaal voor de andere twee poorten voor elk putje en noteer de metingen van alle drie poorten, voor een totaal van drie metingen per well. Blijf de weerstand te meten voor alle putten van cellen.
- Reinig de elektrode 5-10 min onderdompelen in 70% ethanol, spoelen in steriel dH 2 O en drogen goed. Bewaren in de oorspronkelijke verpakking.
- Bereken de weerstand van elk putje met behulp van vergelijking 1.
Ω feitelijke = Ω monster - Ω blanco, Vergelijking 1
waar Ω monster de gemiddelde maat van een geënte goed en Ω blank de gemiddelde meting van de 2 putjes, A1 en D1, die inserties en medium, maar geen cellen. - Bereken het eenheidgebied weerstand, met Equatie 2.
Ω werkelijke × effectieve membraanoppervlak = Ω · cm 2, vergelijking 2
een effectief membraanoppervlak is 0,33 cm 2 voor 24-well Transwell inzetstukken.
- Controleer of polarisatie voltooid door het uitvoeren van een secundaire test, meten passieve natriumfluoresceïne diffusie tussen de apicale en basolaterale compartimenten, een tot drie Transwell culturen. De putjes voor de assay natriumfluoresceïne moet worden weggegooid onmiddellijk na voltooiing van de test.
- Bereid niet fluorescerende buffer (118 mM NaCl, 4,75 mM KCl, 2,53 mM CaCl2 .2 H 2 O; 2,44 mM MgSO4, 1,19 mM KH 2PO 4, 25 mM NaHCO 3 in steriel water, steriel filter met 0,45 urn filterinrichting ). Bereid natriumfluoresceïne bij 1 mg / ml in niet-fluorescerende buffer, steriel filter, wikkel in aluminiumfolie en bewaar bij 4 ° C, beschermd tegen licht. Warm om ruimte temperaopnieuw voor gebruik.
- Na het voltooien weerstandsmetingen, verwijder medium van zowel de basolaterale en apicale compartimenten van een tot drie afzonderlijke Transwell culturen.
- Spoel Transwell culturen. Zachtjesaan 600 pi kamertemperatuur steriele Dulbecco's PBS (D-PBS) aan de basolaterale compartimenten en 100 pi kamertemperatuur steriele D-PBS op de apicale compartimenten.
- Verwijder voorzichtig D-PBS uit putten. Voeg 600 pl steriele niet-fluorescerende buffer aan de basolaterale compartimenten. Voeg 100 ul steriel 1 mg / ml natriumfluoresceïne de apicale compartimenten.
- Incubeer de plaat bij 37 ° C gedurende 1 uur. CO 2 is niet nodig tijdens deze incubatieperiode.
- Tijdens incubatie bereiden een natriumfluoresceïne standaardcurve variërend tussen 20 ug / ml en 0 ug / ml, met niet-fluorescerende buffer natriumfluoresceïne verdunnen. Bereid ten minste 8 verschillende concentraties natriumfluoresceïne, elk in een eindvolume van ten minste 600 pi. Houdenstandaardcurve verdunningen beschermd tegen licht tot klaar om absorptie te meten.
- Breng de niet fluorescerende buffer monster uit de basolaterale compartiment van elke test Transwell een andere schone buis voor analyse. Verwijder de test transwells gebruikt om een passieve natriumfluoresceïne diffusie bestuderen van de plaat en gooi. Zet de plaat met de resterende transwells naar de incubator.
- Plaats 100 pl van elke standaardoplossing in drievoud in een 96-putjes met vlakke bodem plaat.
- Maak drie verdunningen van elk monster basolaterale (1:2, 1:20 en 1:50) in niet-fluorescerende buffer en voeg 100 ul van elk onverdund monster en van elke verdunning, in tweevoud, in een 96-well platte- bodemplaat.
- Proefstaal absorptie op een ELISA plaatlezer bij 486 nm of 490 nm.
- Het gehalte aan natriumfluoresceïne in de basolaterale compartiment door vergelijking van de absorptie van monsters tegen de absorptiewaarden voor de natriumfluoresceïne stAndard curve.
4. Infecteren Gepolariseerde Calu-3 LCC met respiratoire virus
Veiligheidsmaatregelen: Voer alle procedures in een bioveiligheid kast met behulp van steriele cultuur-techniek, op een bioveiligheidsniveau geschikt is voor het virus wordt gebruikt.
- Verdun virus in serumvrij EMEM zodat de gewenste inocula zou in 100 ul.
- Was de cellen in serumvrij EMEM. Zuig medium van alle putjes, het verwijderen van de apicale medium dan de basolaterale medium. Met een capillaire pipet met het vacuümsysteem trap met een zacht vacuüm, of een standaard 1 ml pipet, aspiraat medium van celvrije putjes A1 en D1, dan van seeded wells, eerst het apicale medium van alle putjes, en vervolgens het verwijderen de basolaterale medium van alle putjes. Raak insert membranen tijdens het opzuigen medium.
- Voeg 100 ul serumvrij EMEM aan het apicale compartiment van cel putjes A1 en D1 en tHij geplaatste putten, leiden medium in het apicale compartiment met de zijkant van het inzetstuk aan de pipetpunt leiden. Voeg geen medium direct op cellen, en raak het inzetstuk membraan.
- Voeg 600 ul serumvrij EMEM de basolaterale compartimenten. Voeg medium om elke Transwell door hengelen de pipet tegen de wand van het compartiment en langzaam vrijgeven van het medium in de put.
- Zuig serumvrij medium uit de putjes.
- Beginnend met niet-geïnfecteerde of mock-geïnfecteerde putten, voeg de juiste virusverdunningen aan de apicale compartiment van transwells. Voor geïnfecteerde putjes, 100 ul serumvrij EMEM aan het apicale compartiment van geschikte transwells voor mock-geïnfecteerde putjes, 100 ul virusvrije preparaat verdund in serumvrij EMEM aan het apicale compartiment van geschikte transwells, en virusinfectie, verdund virus in serumvrij EMEM en voeg 100 ul aan de apicale compartimenten van geschikte transwells.
- Voeg 600 ul serumvrij EMEM alle basolaterale compartimenten.
- Incubeer bij 37 ° C en 7% CO2 gedurende 2 uur.
- Zuig medium uit putten, eerst van niet-geïnfecteerde en mock-geïnfecteerde putten, dan van geïnfecteerde putten. Verwijder apicale supernatanten eerst, gevolgd door basolaterale supernatanten.
- Vervangen medium met 200 ul EMEM-10% in de apicale compartimenten en 600 pi van EMEM-10% in het basolaterale compartimenten.
Representative Results
Indien gegroeid als vloeistof bedekte culturen (LCC) in Transwell kweeksystemen, zoals geïllustreerd in figuur 1, Calu-3-cellen polariseren, ontwikkelen verschillende apicale en basolaterale oppervlakken. Volgens de werkwijze die hier de trans-epitheliale elektrische weerstand (TEER) van Calu-3 LCC bereikt een plateau bij of boven 1000 Ω cm x 2 binnen 3 weken na het zaaien, waarvan een voorbeeld is weergegeven in figuur 2. De tight junctions gevormd tussen gepolariseerde cellen te voorkomen passieve evenwicht van kleine moleculen tussen de apicale en basolaterale compartimenten. Aldus wordt een gemodificeerd natriumfluoresceïne evenwicht assay gebruikt om polarisatie van Calu-3 LCC 15,17,18 bevestigen. De TEER van Calu-3 celmonolagen in LCC toeneemt, de hoeveelheid fluoresceïne die passief evenwicht bereikt in de basolaterale compartiment af. Zodra de TEER van 1000 Ω cm × 2 wordt fluoresceïne die in evenwicht bereiktde basolaterale compartiment ≤ 1%, zoals getoond in figuur 3, daarom zijn Calu-3 LCC geacht volledig gepolariseerd als de TEER is ≥ 1000 Ω cm x 2. De piek TEER meting van Calu-3 LCC kan variëren van experiment om te experimenteren. Echter, zodra TEER waarden plateau voor een bepaalde experiment kan een volledig gepolariseerd, geïnfecteerde Calu-3 LCC stabiel zijn gedurende 5 tot 12 weken na het zaaien. Afwezigheid van resistentie in Transwell-gekweekte Calu-3 kunnen worden veroorzaakt door verschillende factoren zoals aangegeven in tabel 1. Zodra de TEER van Calu-3 LCC plateaus op of boven 1000 Ω cm x 2 het model klaar voor gebruik onderzocht luchtwegepitheelcellen celreacties op respiratoire pathogenen, waaronder respiratoir syncytieel virus (RSV). Blootstelling aan RSV resulteert in een snellere afname in gepolariseerd INTEGRITEIT vergeleken met een mock-infectie van cellen (figuur 4).
Figuur 1. Doorsnede weergave van Transwell-gekweekte cellen. Cellen worden gekweekt op het apicale oppervlak van het inzetstuk membraan.
Figuur 2. Ontwikkeling van trans-epitheliale elektrische weerstand (TEER) en polarisatie van Calu-3 cellen na het zaaien in Transwell inzetstukken. Op elk tijdstip, wordt TEER de mediaan Ω cm x 2 ± SEM van 32 onafhankelijke bronnen afkomstig van een representatief experiment.
Figuur 3. Passief equili lijkheid dat natriumfluoresceïne in het basolaterale compartiment van Calu-3 celmonolagen wordt geremd als cellen gepolariseerd. Cumulatieve gegevens van vier onafhankelijke experimenten wordt gepresenteerd. Elk datapunt representeert een afzonderlijke meting.
Figuur 4. RSV infectie van gepolariseerd Calu-3 LCC versnelt een daling in monolaag integriteit. Polarized Calu-3-cellen werden geïnfecteerd met RSV-A2 met een MOI = 1 op dag 0 en de polariteit werd gedurende acht weken na infectie. Een representatief experiment getoond. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde weerstand van 8 onafhankelijke wells per infectie ± SEM per tijdstip. * P <0,05 tussen mock-en RSV-A2-geïnfecteerde kweken, zoals bepaald door Student's t-test.
- Verwijder eventuele luchtbellen in de putten
- Gebruik Calu-3-cellen die zijn gekweekt uit ingevroren voorraad minder dan 10 keer
- Niet toegestaan Calu-3-cellen tot 100% confluentie in monolaag subcultuur bereiken
- Controleer of niet worden gekweekt op plastic en onder het inzetstuk (aangeeft dat cellen gegroeid door de poriën van de insert)
- Laat 2-3 weken na het zaaien voor de volledige ontwikkeling van resistentie
- Controleer de samenstelling en de poriegrootte van inserts gebruikt, indien nodig te wijzigen (aanbevolen polyester insert, 0,3 um poriegrootte, geen coatings, zie materialen voor details)
- De kwaliteit van de elektrode, schuren zachtjes om eiwitten verzameld uit de tip, en eventueel vervangen
- Controleer medium voor bacteriële groei
- Een extra termijn voor de polarisatie te ontwikkelen (kan soms oplopen tot 4 weken)
- Gebruik Calu-3-cellen die zijn gekweekt uit ingevroren voorraad minder dan 10 keer
- Niet toegestaan Calu-3-cellen tot 100% confluentie in monolaag subcultuur bereiken
- Consequent vervangen medium in Transwell culturen afwisselend de derde en vierde dag na previous feeding
- Alleen cultuur cellen inserts die zijn geplaatst in de buitenkant rijen plaatjes
- Gebruik een andere veel Transwell inzetstukken
- Niet verstoren of stapelen platen in de incubator
- Veroorzaken geen trillingen in de bioveiligheid kast terwijl Transwell plates worden behandeld
- Verwijder eventuele luchtbellen in de putten
- Gebruik de cellaag niet storen met pipettips bij het wisselen van media of het uitvoeren van TEER lezingen
- Gebruik 200 ul medium in het apicale compartiment; lager volume kan leiden tot instabiele TEER lezingen
- Controleer de kwaliteit van de elektrode, schuren voorzichtig om de geaccumuleerde eiwitten te verwijderen van de punt, en indien nodig vervangen
Tabel 1. Problemen oplossen problemen die kunnen ontstaan bij het kweken van Calu-3-cellen in transwells. Meerdere factoren dragen volledige polarisatie van Calu-3-cellen in vloeibare bedekte kweken, de meest waarschijnlijke die zijn aangegeven in deze tabel.
Discussion
Bij het vaststellen Calu-3 LCC in Transwell inzetstukken kunnen cellen niet polariseren helemaal of niet volledig polariseren, zoals gedefinieerd door een TEER ≥ 1000 Ω cm x 2 ≤ 1% natriumfluoresceïne kleurstof evenwicht tussen de apicale en basolaterale compartimenten. Bovendien kan Calu-3 cellen in LCC volledig polariseren, maar TEER kan inconsistent tussen de metingen. Hoewel schommelingen in TEER metingen van Calu-3 LCC zijn normaal van dag tot dag, eenmaal volledig gepolariseerd dramatische slingerbewegingen in TEER pas verwacht cultuur nature afneemt met de leeftijd, die zo weinig als 5 weken of zolang 12 weken na het zaaien.
Het vermogen van Calu-3 LCC polariseren mede afhankelijk hoe cellen worden gehandhaafd en doorgekweekt voor gebruik in het systeem Transwell. Cellen die meer dan 90% confluentie gekweekt als een monolaag in subcultuur, die zijn gekweekt meer dan 10 keer uit bevroren voorraad, of die niet zijnen met vers medium op regelmatige tijdstippen minder waarschijnlijk volledig polariseren en elke polarisatie waarschijnlijk snel dalen. Onvolledige of totaal gebrek aan polarisatie kan ook worden toegeschreven aan variatie in het materiaal en poriegrootte van transwells gebruikt voor Calu-3 LCC, en lot-to-lot variatie in transwells van vergelijkbare samenstelling, poriegrootte kan ook van invloed polarisatie. Grotere poriën kan toestaan Calu-3 om door de Transwell membraan groeien in de basolaterale compartiment, waardoor de cultuur van polariserende. Afwezigheid van polarisatie kan ook door bacteriële groei, aangegeven door vertroebeld kweekmedium, wat leidt tot verdere afbraak van de tight junctions tussen Calu-3 cellen.
Variabele TEER metingen van Calu-3 LCC kan worden veroorzaakt door mechanische storingen van de Calu-3 LCC celmonolagen, de inserts of de platen zelf. Medium veranderingen en TEER metingen dienen te worden uitgevoerd zonder pipettips of elektrode leidt het aanraken van de cellen. Hoewel deze bewerkingen moet erop worden genomen om te voorkomen dat er luchtbellen in de apicale en basolaterale compartimenten, die het vermogen van de voltohmmeter om weerstand te detecteren verstoren. Het vermogen van de voltohmmeter om weerstand te detecteren in een cultuur die eigenlijk gepolariseerd ook beperkt door eiwit opbouw op de elektrode leads. Deze opbouw kan worden verwijderd met zachte schuren of kan gecorrigeerd worden door de elektrode.
Zodra Calu-3 LCC volledig polariseren en de TEER niet meer toeneemt, Calu-3 LCC klaar voor gebruik als een in vitro model voor het karakteriseren gastheer longepitheelcellen cel responsen op infectie van de luchtwegen. Dit systeem maakt betere karakterisering van directionele reacties op pathogenen opzichte monolayer-gekweekte longcellijnen traditioneel gebruikt respiratoire pathogenen zoals A549 en HEp-2 cellen te bestuderen, met de extra voordelen van Calu-3 LCC being sneller te ontwikkelen, meer gemakkelijk te verkrijgen, en minder duur te genereren dan primaire, gepolariseerde, gedifferentieerde NHBE. Soortgelijke NHBE, gepolariseerde Calu-3 tonen tight junction vorming en produceren mucinen. In tegenstelling NHBE, niet gepolariseerd Calu-3-cellen geen verschil in lagen basale cellen en trilharen zuilvormige epitheelcellen en enkele gepolariseerde Calu-3 cellen ontwikkelen cilia uitsteeksels 19. Dus, hoewel nuttig voor de behandeling van gepolariseerde reacties van epitheelcellen aan de luchtwegen belediging, gepolariseerde Calu-3 LCC zijn niet een ideaal model van de luchtwegen ontwikkeling of renovatie te onderzoeken naar aanleiding van de luchtwegen belediging of letsel. Slijmproductie door gekweekte cellen in vitro kunnen beïnvloeden cellulaire infectiviteit, en afgifte van infectueus virus en verspreiding van het virus in een gepolariseerde model en een directe vergelijking van de slijmproductie tussen gepolariseerde Calu-3 LCC en gepolariseerde gedifferentieerde NHBE niet gemeld . A549 en HEp-2-cellen eenopnieuw gemakkelijker cultuur dan Calu-3 cellen, echter, in tegenstelling Calu-3 LCC, vormen zij geen gepolariseerd cultures bij groei op Transwell inzetstukken, en dus niet ideale modellen voor het onderzoek in vitro de respons van gepolariseerde epitheelcellen de ademhalingswegen virusinfectie .
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De auteurs willen Elisabeth Blanchard bedanken voor haar technische bijstand. De bevindingen en conclusies in dit rapport zijn die van de auteurs en vertegenwoordigen niet noodzakelijkerwijs de mening van de Centers for Disease Control and Prevention.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Calu-3 | ATCC | HTB-55 | |
| 0.05% Trypsin - 0.02% EDTA | Gibco/Invitrogen | 25300 | |
| Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) | Gibco/Invitrogen | 07-00100DK | |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | SH30070.03 | Heat-inactivate, 56 °C, 30 mins |
| Non-essential amino acids 100X (10 mM) | Gibco/Invitrogen | 11140 | Store at 4 °C in the dark |
| L-glutamine | Gibco/Invitrogen | 25030 | |
| HEPES | Gibco/Invitrogen | 15630 | |
| EMEM-10% FBS (EMEM-10%) | Supplement EMEM with heat-inactivated FBS to 10% serum, sterile-filter | ||
| EMEM-20% FBS + supplements (EMEM-20%+S) | Supplement EMEM to final concentrations: heat-inactivated FBS, 20%; 1X amino acids; 2 mM L-glutamine; 10 mM HEPES; sterile-filter | ||
| 24-well Transwell plates | Corning Costar | 3472 | 3 μm pore size, polyester |
| Trypan blue | Gibco/Invitrogen | 15250 | |
| Ethanol | Sigma | E7023 | Prepare to 70% using sterile dH2O |
| Dulbecco's PBS (D-PBS) | Invitrogen | 14040 | |
| Non-fluorescent buffer | 118 mM NaCl; 4.75 mM KCl; 2.53 mM CaCl2×H2O; 2.44 mM MgSO4; 1.19 mM KH2PO4; 25 mM NaHCO3 in sterile water; sterile-filter | ||
| Sodium fluorescein | Sigma | 6377 | 1 mg/ml in sterile non-fluorescent buffer; sterile-filter, protect from light; store at 4 °C up to 6 months |
| EQUIPMENT | |||
| Voltohmmeter | World Precision Instruments | ||
| STX2 electrode | World Precision Instruments | ||
| ELISA plate reader | Capable of measuring A486 or A490 | ||
References
- Zhu, Y., Chidekel, A., Shaffer, T. H. Cultured human airway epithelial cells (calu-3): a model of human respiratory function, structure, and inflammatory responses. Critical care research and practice. 2010, (2010).
- Mukherjee, M., Pritchard, D. I., Bosquillon, C. Evaluation of air-interfaced Calu-3 cell layers for investigation of inhaled drug interactions with organic cation transporters in vitro. International journal of pharmaceutics. 426, 7-14 (2012).
- Baginski, L., et al. Investigations into the fate of inhaled salmon calcitonin at the respiratory epithelial barrier. Pharmaceutical research. 29, 332-341 (2012).
- Vllasaliu, D., Alexander, C., Garnett, M., Eaton, M., Stolnik, S. Fc-mediated transport of nanoparticles across airway epithelial cell layers. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. , (2011).
- Vinhas, R., et al. Pollen proteases compromise the airway epithelial barrier through degradation of transmembrane adhesion proteins and lung bioactive peptides. Allergy. 66, 1088-1098 (2011).
- Hein, S., Bur, M., Schaefer, U. F., Lehr, C. M. A new Pharmaceutical Aerosol Deposition Device on Cell Cultures (PADDOCC) to evaluate pulmonary drug absorption for metered dose dry powder formulations. European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics : official journal of Arbeitsgemeinschaft fur Pharmazeutische Verfahrenstechnik e. 77, 132-138 (2011).
- Huttunen, S., Toivanen, M., Arkko, S., Ruponen, M., Tikkanen-Kaukanen, C. Inhibition activity of wild berry juice fractions against Streptococcus pneumoniae binding to human bronchial cells. Phytotherapy research: PTR. 25, 122-127 (2011).
- Elm, C., Rohde, M., Vaerman, J. P., Chhatwal, G. S., Hammerschmidt, S. Characterization of the interaction of the pneumococcal surface protein SpsA with the human polymeric immunoglobulin receptor (hpIgR). The Indian journal of medical research. 119, 61-65 (2004).
- Sutherland, T. C., Quattroni, P., Exley, R. M., Tang, C. M. Transcellular passage of Neisseria meningitidis across a polarized respiratory epithelium. Infection and immunity. 78, 3832-3847 (2010).
- Grantham, M. L., et al. Palmitoylation of the influenza A virus M2 protein is not required for virus replication in vitro but contributes to virus virulence. Journal of. 83, 8655-8661 (2009).
- Saedisomeolia, A., Wood, L. G., Garg, M. L., Gibson, P. G., Wark, P. A. Lycopene enrichment of cultured airway epithelial cells decreases the inflammation induced by rhinovirus infection and lipopolysaccharide. The Journal of nutritional biochemistry. 20, 577-585 (2009).
- Yoshikawa, T., Hill, T., Li, K., Peters, C. J., Tseng, C. T. Severe acute respiratory syndrome (SARS) coronavirus-induced lung epithelial cytokines exacerbate SARS pathogenesis by modulating intrinsic functions of monocyte-derived macrophages and dendritic cells. Journal of virology. 83, 3039-3048 (2009).
- Yoshikawa, T., et al. Dynamic innate immune responses of human bronchial epithelial cells to severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus infection. PloS one. 5, e8729 (2010).
- Hsu, A. C., et al. Critical role of constitutive type I interferon response in bronchial epithelial cell to influenza infection. PloS one. 7, e32947 (2012).
- Harcourt, J. L., Caidi, H., Anderson, L. J., Haynes, L. M. Evaluation of the Calu-3 cell line as a model of in vitro respiratory syncytial virus infection. Journal of virological methods. 174, 144-149 (2011).
- Zhang, L., Peeples, M. E., Boucher, R. C., Collins, P. L., Pickles, R. J. Respiratory syncytial virus infection of human airway epithelial cells is polarized, specific to ciliated cells, and without obvious cytopathology. Journal of virology. 76, 5654-5666 (2002).
- Geys, J., et al. In vitro study of the pulmonary translocation of nanoparticles: a preliminary study. Toxicology letters. 160, 218-226 (2006).
- Geys, J., Nemery, B., Hoet, P. H. Optimisation of culture conditions to develop an in vitro pulmonary permeability model. Toxicology in vitro : an international journal published in association with BIBRA. 21, 1215-1219 (2007).
- Grainger, C. I., Greenwell, L. L., Lockley, D. J., Martin, G. P., Forbes, B. Culture of Calu-3 cells at the air interface provides a representative model of the airway epithelial barrier. Pharmaceutical research. 23, 1482-1490 (2006).
