Summary
Результаты и выводы в настоящем докладе, принадлежат авторам и не обязательно отражают точку зрения Центра по контролю и профилактике заболеваний.
Abstract
Апикальной и базолатеральной поверхности эпителиальных клеток дыхательных путей продемонстрировать направленный ответ на воздействия болезнетворных микроорганизмов в естественных условиях. Таким образом, идеальный в пробирке моделей для изучения клеточных реакций на возбудителей инфекций дыхательных путей поляризуются, образуя апикальной и базальной поверхностей. Одной из таких моделей отличается нормальным человеческим бронхиальные эпителиальные клетки (NHBE). Тем не менее, эта система требует образцы легочной ткани, опыт выделения и культивирования эпителиальных клеток из тканей, и время для создания воздух-жидкость культуры.
Calu-3 клетки, полученные из человеческих бронхиальной аденокарциномы, являются альтернативной моделью для изучения реакции проксимального эпителия дыхательных путей клетки дыхательных оскорбление 1, фармакологических соединений 2-6, 7-9 и бактериальных и вирусных патогенов, включая вирус гриппа, риновирусы и тяжелого острого респираторного синдрома - ассоциированный коронавирус 10-14. Недавно Wэлектронной показал, что Calu-3 клетки чувствительны к респираторно-синцитиальный вирус (РСВ) инфекцией в соответствии с NHBE 15,16. Здесь мы подробно создание поляризованным, покрытые жидкой культуры (LCC) из Calu-3 клетки, ориентируясь на технические подробности выращивания и культивирования Calu-3 клетки, сохраняя клетки, культивированные в LCC, и мы представляем Способ выполнения респираторная вирусная инфекция поляризованного Calu-3 клетки.
Чтобы постоянно получать поляризованные Calu-3 LCC, Calu-3 клетки должны быть тщательно субкультивируют до культивирования в Transwell вставками. Calu-3 однослойные культуры должна оставаться ниже 90% слияния, должны быть субкультивируют менее 10 раз из замороженных акций, и должны регулярно снабжаться свежей среде. После культивировали в Transwells, Calu-3 LCC должны быть обработаны с осторожностью. Нерегулярные изменения средствах массовой информации и механические или физические нарушения клеточных слоев или пластин негативно сказаться поляризациинесколько часов или дней. Поляризация контролируется оценки транс-эпителиального электрического сопротивления (TEER) и проверяется путем оценки пассивного уравновешивания флуоресцеина натрия между апикальной и базолатеральной отсеков 17,18. После TEER плато на уровне или выше 1000 Ω × см 2, Calu-3 LCC готовы использовать для изучения клеточных реакций на возбудителей инфекций дыхательных путей.
Protocol
1. Культивирование Calu-3 Ячейки для использования в культурах Transwell
Меры безопасности: Выполнить все процедуры в кабинете биологической безопасности с использованием стерильной техники культуры.
- Таять клеток из замороженной хранения:
- Подготовка минимальную поддерживающую среду Игла, содержащей 20% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), 0,1 мМ не-незаменимых аминокислот, 2 мМ L-глутамина, и10 мМ HEPES рН 7,4 (EMEM-20% + S). Стерильный фильтр подготовленной среде с помощью 0,2 мкм размеров пор фильтра, и теплая на водяной бане до 37 ° C. Чтобы быть более отражать на месте окружающую среду эпителия дыхательных путей, среднего не дополняется с помощью антибиотиков или противогрибковых.
- Оттепель замороженных криопробирку из Calu-3 клетки быстро (<1 мин) при 37 ° С водяной бане.
- Передача талой клеток в 50 мл стерильной коническую трубку и добавить 30 мл подогретого EMEM-20% + S.
- Осаждения клеток путем центрифугирования в течение 5 мин при 1000-1200 × г,без охлаждения, так и с низкой скоростью тормоза.
- Слейте супернатант осторожно и ресуспендирования клеток в 5 мл подогретого EMEM-20% + S, осторожно пипеткой вверх и вниз. Семенной 2 до 5 × 10 6 клеток на лунку в 6-луночный планшет для культивирования тканей и инкубировать при 37 ° C, 7% CO 2 в атмосфере воздуха до клетки 75% - 80% вырожденная. Проверьте ежедневно, до 7 дней может потребоваться. Каждые 3-4 дня аспирации среды от клеток и заменить его свежим EMEM-20% + S.
- Для субкультуры клеток:
- Теплый 0,05% трипсина - 0,02% ЭДТА при 37 ° C водяной бане. Аспирируйте среды из клеток, клетки и мыть один раз с подогретой 0,05% трипсина - 0,02% ЭДТА для удаления избытка среды и сыворотки. Снимите стирки и добавляют 1 мл нагревают трипсина на хорошо клеток.
- Инкубировать при 37 ° C и 7% CO 2 и монитор под микроскопом каждые 5 минут по крайней мере до 75% клетки отделяются от хорошо (ы) пластины культуре ткани. Это можетзанять от 5 до 30 мин.
- Вымойте клетки в EMEM-20% + S, чтобы удалить лишний трипсин. Передача трипсинизированных клеток в 50 мл стерильной коническую трубку. Несколько скважин клеток из одного 6-а культура пластины могут быть объединены в один 50 мл стерильной коническую трубку. Добавить 30 мл EMEM-20% + S и осаждения клеток центрифугированием при 1000-1200 × г, без охлаждения, так и с низкой скоростью тормоза.
- Слейте супернатант осторожно и ресуспендирования клеток в свежей EMEM-20% + S, осторожно пипеткой вверх и вниз. Использование шаги 1.2.1 через 1.2.3 выше trypsinize клетки, продолжают субкультуры клеток в культуре тканей блюда как описано в пунктах 1.2.5 через 1.2.7, когда они находятся в пределах от 75 - 80% вырожденная.
- Субкультура из одной ямы в 6-луночный планшет до одного Т-25 см 2 колбы в конечном объеме 5 мл EMEM-20% + S, посев от 0,5 до 1 × 10 6 клеток / колбу.
- Используя 5 мл нагревают трипсина на Т-25 см 2 колбы чтобы отделить клетки, субкультураот одного Т-25 см 2 колбы до одного Т-75 см 2 колбы в конечном объеме 10 мл EMEM-20% + S, посева от 1 до 5 × 10 6 клеток / колбу.
- Использование 8 мл нагревают трипсина на Т-75 см 2 колбы чтобы отделить клетки, субкультура от одного Т-75 см 2 колбы на 2 T-75 см 2 колбы. Для оптимального роста клеток, не субкультуру клеток в колбах больше, чем Т-75 см 2 или субкультуры в соотношении больше, чем 1 родитель колбы: 3 новых колб.
- Как только клетки были субкультивируют, полностью удалить и заменить среду каждые 2 до 3 дней, пока они не достигают 75-90% слияния. Клетки может занять до 3 недель, чтобы достичь 75-90% слияния. Для оптимального поколение поляризованных культуры, субкультуры клеток, прежде чем они выходят за пределы 90% слияния в виде монослоя.
- Продолжайте субкультуре клеток, пока достаточное количество клеток выросли на семена нужного количества вставками Transwell. Каждая вставка Transwell требует 2 × 10 5 клеток. Для достижения оптимальной производительности генерации поляризованной культуры, использовать клетки, которые подверглись не более 10 субкультур.
2. Выращивание поляризованный Calu-3 Жидкий покрытые культур (LCC)
Меры безопасности: Выполнить все процедуры в кабинете биологической безопасности с использованием стерильной техники культуры.
- Подготовка EMEM, содержащей 10% FBS (EMEM-10%) и теплые на водяной бане до 37 ° C.
- Подготовка 24-а Transwell пластины для посева. Использование стерильного пинцета, переместить Transwell вставки с внутренней на внешнюю строк пластины, не касаясь вставки мембраны. Клетки должны быть только субкультивируют в скважины на внешние ряды пластины. Для предотвращения введения пузырьков воздуха в базолатеральной отсеков, добавить 600 мкл EMEM-10%, до каждого из них рыбалка пипетки к стенке каждого отделения и медленно выпуская среды в скважину.
- Отсоедините клетки из Т-75 см 2 ткани. Subculture колбы нагревают использованием трипсина, и мыть в 30 мл EMEM-20% + S на каждые 2 флакона трипсинизированных клеток, как описано в пункте 1.2.
- Тщательно промытые ресуспендирования клеток в 5 мл EMEM-10%, мягко пипетки вверх и вниз.
- Определить жизнеспособной и общее количество клеток по методу исключения трипанового синего. Продолжайте только если 80% - 90% являются жизнеспособными.
- В 50 мл стерильной коническую трубку, развести клеток в концентрации 2 × 10 6 жизнеспособных клеток / мл с EMEM-10%.
- Добавить клеток в апикальной отсеке каждого Transwell. Для скважин A1 и D1, который будет бесклеточной управления скважинами, то есть пробелы, добавьте 100 мкл EMEM-10% без клеток. Для каждого из остальных скважин, добавить 100 мкл ресуспендированных Calu-3 клетки, мягко рыбалка пипетки против внутренний канал руководство вкладыша стене и медленно выпуская клетки. Не касайтесь пипеткой вставки мембраны. Для поддержания однородной суспензии Calu-3 клетки, мягко агитировать клеточной суспензиив течение этого посева шаг.
- Инкубируйте Transwell пластины при температуре 37 ° C и 7% CO 2 в атмосфере воздуха. Место пластины в инкубатор, где физическое воздействие будет минимальным. Для повышения эффективности поляризации, не складываются плит друг на друга.
- Для поддержания культуры до поляризованным и готовы к использованию в экспериментах, полностью заменить среду в Transwells, как описано в шагах 2,10 через 2,13 ниже. Средний должны быть полностью заменены три дня после того, как субкультивируют в Transwells, а затем в цикле поочередно четвертая, а затем третий день после предыдущего кормления, пока клетки полностью поляризованным.
- Теплый EMEM-10% на водяной бане до 37 ° C.
- Аккуратно аспирации среды от вставки Transwell. С капиллярной пипетки прикреплены к вакуумной ловушки с нежным вакуум, или со стандартным 1 мл пипетки, аспират среды от бесклеточной скважин A1 и D1, то из посеянных скважин, в первую удаление апикальной среде от всех скважин, и тКурица удаления базолатеральную среду из всех лунок. Не прикасайтесь вставки мембран при аспирационных среды.
- Добавить 200 мкл EMEM-10% к апикальной отсек бесклеточной скважин A1 и D1, то к семенами скважин, направляя среды в апикальной отсека использованием стороны вставки для руководства пипетки. Не добавляйте среды непосредственно на клетки, и не прикасайтесь к вставкой мембраны.
- Добавить 600 мкл EMEM-10% к базолатеральной отсеков. Для предотвращения введения пузырьков воздуха в базолатеральной отсеков, добавить средне каждого из них рыбалка пипетки к стенке каждого отделения и медленно выпуская среды в скважину.
3. Оценка сопротивления развития Calu-3 LCC
Меры безопасности: Выполнить все процедуры в кабинете биологической безопасности с использованием стерильной техники культуры.
- Оцените транс-эпителиального электрического сопротивления (TEER) из Calu-3 LCC через 30 минут послесредние изменения; оценка может быть выполнена после каждой среде изменения, если это необходимо. Выполните измерения в стерильных условиях. Начало измерений с бесклеточной контрольные лунки А1 и D1 (заготовок) для получения базовых измерений, и продолжить измерения для каждой скважины.
- В стерильных условиях, передает Stx2 электродом в 50 мл центрифужные пробирки, содержащие 70% этанола в стерильной воде и стерилизуют 15 мин.
- Калибровка и тестирование voltohmmeter для использования в соответствии с инструкциями производителя.
- Выньте электрод из этанола, воздух сухой 5-10 сек, и промыть электрод с стерильной EMEM-10%.
- Установите переключатель режима в voltohmmeter к сопротивлению настройки и включить питание.
- Аккуратно поместите электрод в одном из 3-х портов, которые обеспечивают доступ в базолатеральной отделение одной культуры Transwell. Место электрода так, что чем больше свинца только слегка касается нижней части внешнего хорошо и остается в вертикальном положении,и короче свинца в среде тканевой культуры апикальной отсеке, не касаясь вставки мембраны.
- Нажмите "Мера R" кнопку, и дождаться стабилизации показаний. Повторите эти действия для других 2 портами для каждой скважины и записывать измерения всех трех портах, в общей сложности трех измерений на лунку. Продолжить для измерения сопротивления для всех скважин клеток.
- Очистите электроды путем замачивания 5-10 мин в 70% этаноле, промывка в стерильных дН 2 O и сушки тщательно. Хранить в оригинальной упаковке.
- Рассчитать сопротивление каждой скважины, с помощью уравнения 1.
Ω = Ω фактической выборки - Ω пустым, уравнение 1
где Ω образца измерения средней из посеянных хорошо и Ω бланка средний измерения от 2 скважины, A1 и D1, содержащие вставки и среднего, но не клетки. - Рассчитать сопротивление на единицу площади, используя Equaния 2.
Ω × фактическая эффективная площадь мембраны = Ω × см 2, уравнение 2
где эффективная площадь мембраны составляет 0,33 см 2 в течение 24-и вставки Transwell.
- Убедитесь, что поляризация является полным путем проведения вторичного анализа, измерения пассивной диффузии флуоресцеина натрия между апикальной и базолатеральной отсеках, на 2:59 Transwell культур. Скважин, используемых для анализа флуоресцеина натрия должна быть отброшена сразу же после завершения анализа.
- Подготовка нефлуоресцентного буфера (118 мМ NaCl, KCl 4,75 мм, 2,53 мМ CaCl 2 · 2H 2 O, 2,44 мМ MgSO 4; 1,19 мм KH 2 PO 4, 25 мМ NaHCO 3 в стерильной воде, стерильный фильтр с устройством фильтрации 0,45 мкм ). Подготовка флуоресцеина натрия в дозе 1 мг / мл в нефлуоресцентного буфере, стерильный фильтр, завернуть в алюминиевую фольгу и хранить при 4 ° C, в защищенном от света. Нагреться до комнатной temperatuповторно перед использованием.
- После завершения измерения сопротивления, осторожно снимите средние и от базолатеральной и апикальной отделения от одного до трех отдельных культур Transwell.
- Промыть Transwell культур. Аккуратно добавить 600 мкл при комнатной температуре стерильной PBS Дульбекко (D-PBS) в базолатеральной отделений и 100 мкл при комнатной температуре стерильной D-PBS к апикальной отсеков.
- Аккуратно удалите D-PBS из скважин. Добавить 600 мкл стерильной нефлуоресцентного буфера в базолатеральной отсеков. Добавить 100 мкл стерильной 1 мг / мл натрия флуоресцеина к апикальной отсеков.
- Инкубировать при 37 ° С в течение 1 часа. CO 2 не требуется во время этой инкубации.
- Во время инкубации подготовить флуоресцеина натрия стандартной кривой в диапазоне от 20 мкг / мл и 0 мкг / мл, с использованием не-флуоресцентный буфера для разбавления натрия флуоресцеина. Подготовка по крайней мере 8 различных концентраций натрия флуоресцеина, каждый в конечном объеме не менее 600 мкл. Держатьстандартном разведении кривой защищенном от света до полной готовности для измерения оптической плотности.
- Передача нефлуоресцентного буфера для образцов с базолатеральной отсеке каждого теста Transwell в отдельную чистую пробирку для анализа. Извлеките тест-Transwells используется для изучения пассивной диффузии флуоресцеина натрия из пластины и выбросить. Вернуться пластины с остальными Transwells в инкубатор.
- Поместите 100 мкл каждого стандартного раствора в трех экземплярах в 96-и плоским дном тарелку.
- Подготовить три разведения каждого образца базолатеральной (1:2, 1:20 и 1:50) в нефлуоресцентного буфера, и добавить 100 мкл каждого неразбавленного образца и каждого разведения в двух экземплярах, в 96-и плоским Нижняя пластина.
- Измерение поглощения образца на читателя ИФА на 486 нм и 490 нм.
- Определить концентрацию натрия флуоресцеина в базолатеральной отсек путем сравнения оптической плотности образцов от значения абсорбции для флуоресцеина натрия йAndard кривой.
4. Заражение поляризованный Calu-3 LCC с дыхательными Вирус
Меры безопасности: Выполнить все процедуры в кабинете биологической безопасности с использованием стерильной техники культуры, на уровне биобезопасности подходит для вирусов используется.
- Развести вируса в сыворотке крови без EMEM, так что желаемого посевной бы в 100 мкл.
- Вымойте клетки в бессывороточной EMEM. Аккуратно аспирации среды из всех скважин, удаление апикальной среды, то базолатеральной среде. С капиллярной пипетки прикреплены к вакуумной ловушки с нежным вакуум, или со стандартным 1 мл пипетки, аспират среды от бесклеточной скважин A1 и D1, то из посеянных скважин, в первую удаление апикальной среднего из всех лунок, а затем удаление базолатеральную среду из всех лунок. Не прикасайтесь вставки мембран при аспирационных среды.
- Добавить 100 мкл бессывороточной EMEM к апикальной отсек бесклеточной скважин A1 и D1, а затем тОн посеян скважин, направляя среды в апикальной отсека использованием стороны вставки для руководства пипетки. Не добавляйте среды непосредственно на клетки, и не прикасайтесь к вставкой мембраны.
- Добавить 600 мкл бессывороточной EMEM к базолатеральной отсеков. Добавить среднего друг Transwell на рыбалку пипетки к стенке купе и медленно выпуская среды в скважину.
- Аккуратно аспирации бессывороточной среды из скважин.
- Начиная с незараженных или макет-инфицированных скважин, добавить соответствующие разведения вируса к апикальной отсек Transwells. Для неинфицированных скважин, добавить 100 мкл бессывороточной EMEM к апикальной отсек соответствующих Transwells, для макета-инфицированных скважин, добавить 100 мкл вирусов подготовки разводят в бессывороточной EMEM к апикальной отсек соответствующих Transwells, так и для вирусной инфекции, разбавить вирус в бессывороточной EMEM и добавить 100 мкл к апикальной отделений соответствующих Transwells.
- Добавить 600 мкл бессывороточной EMEM для всех базолатеральной отсеков.
- Инкубировать при 37 ° C и 7% CO 2 в течение 2 часов.
- Аспирируйте среды из скважин, первая из неинфицированных и макет-инфицированных скважины, то из зараженных колодцев. Удалить апикальной супернатантов первой, а затем базолатеральной супернатантах.
- Заменить среде с 200 мкл EMEM-10% в апикальной отделений и 600 мкл EMEM-10% в базолатеральной отсеков.
Representative Results
При выращивании в жидкой покрытой культур (LCC) в системе Transwell культуры, как показано на рисунке 1, Calu-3 клетки поляризуются, развитие различных апикальной и базальной поверхностей. В соответствии с методом, описанным здесь, транс-эпителиального электрического сопротивления (TEER) из Calu-3 LCC достигает плато на уровне или выше 1000 Ω × см 2 в течение 3 недель после посева, пример которой показан на рисунке 2. Плотные соединения образуются между поляризованные клетки предотвращения пассивного уравновешивания малых молекул между апикальной и базолатеральной отсеков. Таким образом, изменение флуоресцеина натрия уравновешивания анализ используется для подтверждения поляризации Calu-3 LCC 15,17,18. Как TEER из Calu-3 монослоя клетки увеличивается в LCC, количество флуоресцеина, что пассивно уравновешивает в базолатеральной отсеке уменьшается. После того, TEER составляет 1000 Ω × см 2, количество флуоресцеина, что уравновешивает вв базолатеральной отсек ≤ 1%, как показано на рисунке 3, поэтому Calu-3 LCC считается полностью поляризован, когда TEER является ≥ 1000 Ω × см 2. Пик измерения TEER из Calu-3 LCC могут отличаться от эксперимента к эксперименту. Однако, как только TEER значения плато для любой эксперимент, полностью поляризован, неинфицированных Calu-3 LCC могут быть стабильными в течение 5 через 12 недель после посева. Отсутствие сопротивления развития в Transwell-культурный Calu-3 может быть вызвано несколькими факторами, как указано в таблице 1. Когда TEER из Calu-3 LCC плато на уровне или выше 1000 Ω × см 2, модель готова быть использован для изучения эпителия дыхательных путей клеточного ответа на возбудителей инфекций дыхательных путей, в том числе респираторно-синцитиальный вирус (RSV). Воздействие RSV приводит к более быстрому снижению в поляризованном целостности культуры по сравнению с макетом заражения клетки (рис. 4).
Рисунок 1. Сечение представление Transwell-культуре клеток. Клетки, выращенные на апикальной поверхности пластины мембраны.
Рисунок 2. Развитие транс-эпителиального электрического сопротивления (TEER) и поляризации Calu-3 после посева клеток в Transwell вставками. В каждый момент времени, TEER представлены как медиана Ω х см 2 ± SEM из 32 независимых скважин одного из представителей эксперимент.
Рисунок 3. Пассивный равновесия расслоения натрия флуоресцеина в базолатеральной отсек Calu-3 монослоя клетки подавляется, как клетки становятся поляризованными. полезных данных из четырех независимых экспериментов представлены. Каждая точка данных представляет собой отдельное измерение.
Рисунок 4. RSV инфекции поляризованного Calu-3 LCC ускоряет снижение монослоя целостности. Поляризованных Calu-3 клетки были инфицированы RSV-A2 в МВД = 1 на 0 день, и полярность следили в течение 8 недель после инфицирования. Один из представителей эксперимента. Данные представлены как среднее сопротивление 8 независимых скважин на инфекцию ± SEM в момент времени. * Р <0,05 между макетом и RSV-A2-инфицированных культур, как это определено Стьюдента-тест.
- Удалите пузырьки воздуха в скважины
- Используйте Calu-3 клетки, которые были субкультивируют из замороженных складе менее 10 раз
- Не допускайте Calu-3 клетки до достижения 100% слияния в монослой субкультуры
- Убедитесь, что клетки не растут на пластиковые значительно ниже вставки (о том, что клетки могут выросли через поры вставка)
- Позвольте 2-3 недели после посева для полноценного развития сопротивления
- Проверьте состав и размер пор вставки, измените, если это необходимо (рекомендуется вставки полиэстер, 0,3 мкм, размер пор, никаких покрытий, см. материалы для деталей)
- Проверьте качество электрода, шлифование осторожно, чтобы удалить накопившийся белки от кончика, и заменить при необходимости
- Проверьте средой для роста бактерий
- Разрешить дополнительное время для поляризации на разработку (иногда может занять до 4 недель)
- Используйте Calu-3 клетки, которые были субкультивируют из замороженных складе менее 10 раз
- Не допускайте Calu-3 клетки до достижения 100% слияния в монослой субкультуры
- Последовательно заменить среды в культурах Transwell, чередующихся между третьим и четвертый день после предыдущего кормления
- Только клетки культуры на вставки, которые размещаются в наружных рядов пластинок
- Используйте другой много вставок Transwell
- Не нарушать или стек пластин в инкубаторе
- Не вызывают вибрацию в кабинет биобезопасности при Transwell платформыES решаются
- Удалите пузырьки воздуха в скважины
- Не беспокоить слой клеток с наконечников при изменении среды или при выполнении TEER чтениях
- Используйте 200 мкл среды в апикальной отсека; меньший объем может привести к нестабильной показания TEER
- Проверьте качество электрода, шлифование осторожно, чтобы удалить накопившийся белки от кончика, и при необходимости замените
Таблица 1. Устранение неисправностей проблемы, которые могут возникнуть при культивировании Calu-3 клеток в Transwells. Несколько факторов способствуют полной поляризации Calu-3 клеток в жидкой покрытой культур, наиболее вероятный из которых выделены в таблице.
Discussion
При установлении Calu-3 LCC вставки в Transwell, клетки не могут поляризовать вообще, либо не могут в полной мере поляризации, как это определено TEER ≥ 1000 Ω × см 2 и ≤ 1% натрия красителя флуоресцеина равновесия между апикальной и базолатеральной отсеков. Кроме того, Calu-3 клеток в LCC может полностью поляризовать, но TEER могут быть несовместимы между измерениями. Хотя колебания TEER измерений Calu-3 LCC нормальные изо дня в день, один раз полностью поляризован, драматические колебания в TEER не ожидается до культура естественно снижается с возрастом, которое может быть всего лишь 5 недель или до тех пор, как 12 недель после посева.
Способность Calu-3 LCC для поляризации зависит отчасти от того, как клетки сохраняются и субкультивируют перед использованием в системе Transwell. Клетки, которые выросли за 90% слияния в виде монослоя во время пересева, которые были субкультивируют более чем в 10 раз от замороженных акций, или, что еще не будетан поставляется с свежей среды на регулярной основе, менее вероятно, чтобы полностью поляризуются, и любой поляризации, скорее всего, быстро снижаться. Неполное или полное отсутствие поляризации может также быть связано с изменением материала и размера пор Transwells используется для Calu-3 LCC, и многие-к-много изменений в Transwells аналогичного состава и размера пор также может влиять на поляризацию. Большие размеры пор могут позволить Calu-3 расти через мембрану Transwell в базолатеральной отсека, предотвращая культуры с поляризационным. Отсутствие поляризации может быть также связано с бактериального роста, с указанием дымчатый культуральной среде, что приводит к последующей разбивкой плотных контактов между Calu-3 клетки.
Переменная измерений TEER из Calu-3 LCC может быть вызвано механическим нарушений Calu-3 LCC клетки монослоя, вставки, или сами таблички. Средние изменения и TEER измерения должны быть выполнены без наконечников пипеток или электроде приводит касаясь клетки. При выполнении этих операций, следует позаботиться, чтобы избежать введения пузырьков воздуха в апикальной и базолатеральной отсеков, которые будут нарушать способность voltohmmeter обнаружить сопротивление. Способность voltohmmeter для выявления сопротивления в культуре, которая на самом деле поляризованные также может ограничиваться белка отложений на электроде ведет. Этот нарост может быть удалена с нежной шлифовки, или может быть исправлена путем замены электрода.
После Calu-3 LCC полностью поляризовать и TEER больше не растет, Calu-3 LCC готовы для использования в качестве модели в пробирке для характеристики хозяин легочного эпителия клеточный ответ на респираторные инфекции. Эта система позволяет лучше характеристику направленности ответов на возбудителей по сравнению с однослойной-культурный легких клеточных линий, традиционно используемые для изучения возбудителей инфекций дыхательных путей, таких как A549 и Нер-2 клеток, с дополнительными преимуществами Calu-3 LCC-байнг более быстрого развиваться, получить легче, и дешевле, чем генерировать первичный, поляризованные, дифференцированные NHBE. Как и в NHBE, поляризованный Calu-3 продемонстрировать плотным строем перехода, и производить муцина. Однако, в отличие NHBE, поляризованный Calu-3 клетки не дифференцируются в слоях базальных клеток и мерцательного цилиндрического эпителия клеток, и несколько поляризованные Calu-3 клетки развиваются реснички выступы 19. Таким образом, хотя полезен для изучения поляризованной реакции дыхательных путей, клетки эпителия дыхательных оскорбление, поляризованные Calu-3 LCC не являются идеальной моделью для изучения развития дыхательных путей или реконструкции в ответ на дыхательную оскорбление или травмы. Слизь производство культивируемых клеток в пробирке могут повлиять на сотовый инфекционной, а также выпуск инфекционного вируса и распространения вируса в поляризованном модели, и прямое сравнение слизи между поляризованными Calu-3 LCC и поляризованные, дифференцированные NHBE не сообщалось . A549 и Нер-2 клеткахповторно легче культуры, чем Calu-3 клетки, однако, в отличие от Calu-3 LCC, они не образуют поляризованные культур при выращивании на вставками Transwell, и, таким образом, не идеальными моделями для изучения в пробирке ответы поляризованных эпителиальных клеток респираторной вирусной инфекцией .
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Элизабет Blanchard за техническую помощь. Результаты и выводы в настоящем докладе, принадлежат авторам и не обязательно отражают точку зрения Центра по контролю и профилактике заболеваний.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Calu-3 | ATCC | HTB-55 | |
| 0.05% Trypsin - 0.02% EDTA | Gibco/Invitrogen | 25300 | |
| Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) | Gibco/Invitrogen | 07-00100DK | |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | SH30070.03 | Heat-inactivate, 56 °C, 30 mins |
| Non-essential amino acids 100X (10 mM) | Gibco/Invitrogen | 11140 | Store at 4 °C in the dark |
| L-glutamine | Gibco/Invitrogen | 25030 | |
| HEPES | Gibco/Invitrogen | 15630 | |
| EMEM-10% FBS (EMEM-10%) | Supplement EMEM with heat-inactivated FBS to 10% serum, sterile-filter | ||
| EMEM-20% FBS + supplements (EMEM-20%+S) | Supplement EMEM to final concentrations: heat-inactivated FBS, 20%; 1X amino acids; 2 mM L-glutamine; 10 mM HEPES; sterile-filter | ||
| 24-well Transwell plates | Corning Costar | 3472 | 3 μm pore size, polyester |
| Trypan blue | Gibco/Invitrogen | 15250 | |
| Ethanol | Sigma | E7023 | Prepare to 70% using sterile dH2O |
| Dulbecco's PBS (D-PBS) | Invitrogen | 14040 | |
| Non-fluorescent buffer | 118 mM NaCl; 4.75 mM KCl; 2.53 mM CaCl2×H2O; 2.44 mM MgSO4; 1.19 mM KH2PO4; 25 mM NaHCO3 in sterile water; sterile-filter | ||
| Sodium fluorescein | Sigma | 6377 | 1 mg/ml in sterile non-fluorescent buffer; sterile-filter, protect from light; store at 4 °C up to 6 months |
| EQUIPMENT | |||
| Voltohmmeter | World Precision Instruments | ||
| STX2 electrode | World Precision Instruments | ||
| ELISA plate reader | Capable of measuring A486 or A490 | ||
References
- Zhu, Y., Chidekel, A., Shaffer, T. H. Cultured human airway epithelial cells (calu-3): a model of human respiratory function, structure, and inflammatory responses. Critical care research and practice. 2010, (2010).
- Mukherjee, M., Pritchard, D. I., Bosquillon, C. Evaluation of air-interfaced Calu-3 cell layers for investigation of inhaled drug interactions with organic cation transporters in vitro. International journal of pharmaceutics. 426, 7-14 (2012).
- Baginski, L., et al. Investigations into the fate of inhaled salmon calcitonin at the respiratory epithelial barrier. Pharmaceutical research. 29, 332-341 (2012).
- Vllasaliu, D., Alexander, C., Garnett, M., Eaton, M., Stolnik, S. Fc-mediated transport of nanoparticles across airway epithelial cell layers. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. , (2011).
- Vinhas, R., et al. Pollen proteases compromise the airway epithelial barrier through degradation of transmembrane adhesion proteins and lung bioactive peptides. Allergy. 66, 1088-1098 (2011).
- Hein, S., Bur, M., Schaefer, U. F., Lehr, C. M. A new Pharmaceutical Aerosol Deposition Device on Cell Cultures (PADDOCC) to evaluate pulmonary drug absorption for metered dose dry powder formulations. European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics : official journal of Arbeitsgemeinschaft fur Pharmazeutische Verfahrenstechnik e. 77, 132-138 (2011).
- Huttunen, S., Toivanen, M., Arkko, S., Ruponen, M., Tikkanen-Kaukanen, C. Inhibition activity of wild berry juice fractions against Streptococcus pneumoniae binding to human bronchial cells. Phytotherapy research: PTR. 25, 122-127 (2011).
- Elm, C., Rohde, M., Vaerman, J. P., Chhatwal, G. S., Hammerschmidt, S. Characterization of the interaction of the pneumococcal surface protein SpsA with the human polymeric immunoglobulin receptor (hpIgR). The Indian journal of medical research. 119, 61-65 (2004).
- Sutherland, T. C., Quattroni, P., Exley, R. M., Tang, C. M. Transcellular passage of Neisseria meningitidis across a polarized respiratory epithelium. Infection and immunity. 78, 3832-3847 (2010).
- Grantham, M. L., et al. Palmitoylation of the influenza A virus M2 protein is not required for virus replication in vitro but contributes to virus virulence. Journal of. 83, 8655-8661 (2009).
- Saedisomeolia, A., Wood, L. G., Garg, M. L., Gibson, P. G., Wark, P. A. Lycopene enrichment of cultured airway epithelial cells decreases the inflammation induced by rhinovirus infection and lipopolysaccharide. The Journal of nutritional biochemistry. 20, 577-585 (2009).
- Yoshikawa, T., Hill, T., Li, K., Peters, C. J., Tseng, C. T. Severe acute respiratory syndrome (SARS) coronavirus-induced lung epithelial cytokines exacerbate SARS pathogenesis by modulating intrinsic functions of monocyte-derived macrophages and dendritic cells. Journal of virology. 83, 3039-3048 (2009).
- Yoshikawa, T., et al. Dynamic innate immune responses of human bronchial epithelial cells to severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus infection. PloS one. 5, e8729 (2010).
- Hsu, A. C., et al. Critical role of constitutive type I interferon response in bronchial epithelial cell to influenza infection. PloS one. 7, e32947 (2012).
- Harcourt, J. L., Caidi, H., Anderson, L. J., Haynes, L. M. Evaluation of the Calu-3 cell line as a model of in vitro respiratory syncytial virus infection. Journal of virological methods. 174, 144-149 (2011).
- Zhang, L., Peeples, M. E., Boucher, R. C., Collins, P. L., Pickles, R. J. Respiratory syncytial virus infection of human airway epithelial cells is polarized, specific to ciliated cells, and without obvious cytopathology. Journal of virology. 76, 5654-5666 (2002).
- Geys, J., et al. In vitro study of the pulmonary translocation of nanoparticles: a preliminary study. Toxicology letters. 160, 218-226 (2006).
- Geys, J., Nemery, B., Hoet, P. H. Optimisation of culture conditions to develop an in vitro pulmonary permeability model. Toxicology in vitro : an international journal published in association with BIBRA. 21, 1215-1219 (2007).
- Grainger, C. I., Greenwell, L. L., Lockley, D. J., Martin, G. P., Forbes, B. Culture of Calu-3 cells at the air interface provides a representative model of the airway epithelial barrier. Pharmaceutical research. 23, 1482-1490 (2006).
