Summary
Funnene og konklusjonene i denne rapporten er de av forfatterne, og ikke nødvendigvis representerer synspunktene til Centers for Disease Control and Prevention.
Abstract
De apikale og basolateral overflater luftveier epitelceller demonstrere retningsbestemt respons på patogen eksponering in vivo. Dermed ideell in vitro modeller for å undersøke cellulære responser til luftveispatogener polarisere, forming apikale og basolateral overflater. En slik modell er differensiert normale humane bronchial epitelceller (NHBE). Imidlertid krever dette systemet lunge vevsprøver, kompetanse isolere og dyrke epitelceller fra vev, og tid til å generere en luft-væske-grensesnittet kultur.
Calu-3 celler, avledet fra et menneske bronkial adenokarsinom, er en alternativ modell for å undersøke responsen proksimale luftveier epitelceller luftveiene fornærmelse 1, farmakologiske forbindelser 2-6, og bakteriell 7-9 og virale patogener, inkludert influensa virus, rhinovirus og alvorlig akutt respiratorisk syndrom - tilknyttet coronavirus 10-14. Nylig, we viste at Calu-3 celler er utsatt for respiratorisk syncytial virus (RSV) hos en måte som er forenlig med NHBE 15,16. Her vi detalj etablering av et polarisert, væske-dekket kultur (LCC) i Calu-3 celler, med fokus på de tekniske detaljene for å vokse og dyrking Calu-3 celler, opprettholde celler som har blitt dyrket i LCC, og vi presenterer Metoden for å utføre respiratorisk virus infeksjon av polariserte Calu-3-celler.
Å konsekvent få polarisert Calu-3 LCC, Calu-3 celler må nøye subkultiveres før dyrking i Transwell innsatser. Calu-3 monolagskulturer bør ligge under 90% konfluens, bør subkultiveres færre enn 10 ganger fra frossen lager, og bør med jevne leveres med friskt medium. Når dyrket i Transwells, må Calu-3 LCC håndteres med forsiktighet. Uregelmessig medier endringer og mekanisk eller fysisk forstyrrelse av cellelagene eller plater negativ innvirkning polarisering forflere timer eller dager. Polarisering er overvåket ved å evaluere trans-epitelial elektrisk motstand (Teer) og er bekreftet ved å evaluere den passive likevekt av natrium fluorescein mellom apikale og basolateral avdelinger 17,18. Når Teer platåer på eller over 1000 Ω × cm 2, Calu-3 LCC er klar til å bruke til å undersøke cellulære responser til respiratoriske patogener.
Protocol
1. Dyrking Calu-3 celler for bruk i Transwell kulturer
Sikkerhetstiltak: Utfør alle prosedyrer i en biosafety skap med steril kultur teknikk.
- Å tine celler fra fryselagring:
- Forbered Eagles Minimum Essential Medium inneholdende 20% varmeinaktivert føtalt bovint serum (FBS), 0,1 mM ikke-essensielle aminosyrer, 2 mM L-glutamin, and10 mM HEPES pH 7,4 (EMEM-20% + S). Steril-filteret den preparerte medium ved hjelp av en 0,2 mikrometer pore-størrelse filter, og varme i et vannbad til 37 ° C. For å være mer reflektert av in situ luftveiene epitel miljø, medium ikke supplert med antibiotika eller antimykotika.
- Tin en frossen cryovial av Calu-3-celler raskt (<1 min) i en 37 ° C vannbad.
- Overfør tinte celler til en 50 ml steril konisk rør og tilsett 30 ml oppvarmet EMEM-20% + S.
- Pellet cellene ved sentrifugering i 5 min ved 1,000-1,200 x g,uten kjøling, og med lav brems hastighet.
- Dekanter supernatanten forsiktig og resuspender cellene i 5 ml varmet EMEM-20% + S ved forsiktig pipettering opp og ned. Seed 2-5 x 10 6 celler per brønn i en 6-brønns vevskulturplaten og inkuber ved 37 ° C, 7% CO2 i luftatmosfære inntil cellene er 75% - 80% konfluent. Sjekk daglig, opptil 7 dager kan være nødvendig. Hver 3-4 dager aspirer mediet fra cellene og erstatte det med frisk EMEM-20% + S.
- Til subkultur celler:
- Varm 0,05% trypsin - 0,02% EDTA i en 37 ° C vannbad. Aspirer mediet fra cellene, og vaske cellene en gang med warmed 0,05% trypsin - 0,02% EDTA for å fjerne overskudd medium og serum. Fjern vask og tilsett 1 ml varmet trypsin per brønn til cellene.
- Inkuber ved 37 ° C og 7% CO 2 og skjermen under et mikroskop hver 5 min inntil minst 75% av cellene løsner fra brønnen (e) av vevskulturplaten. Dette kanta mellom 5 og 30 min.
- Vask celler i EMEM-20% + S for å fjerne overskudd trypsin. Overfør trypsinert cellene til en 50 ml steril konisk tube. Flere brønner av celler fra en 6-brønns dyrkingsplate kan samles inn en 50 ml sterilt konisk tube. Tilsett 30 ml EMEM-20% + S og pellet cellene ved sentrifugering ved 1,000-1,200 x g, uten kjøling, og med lav brems hastighet.
- Dekanter supernatanten forsiktig og resuspender cellene i frisk EMEM-20% + S ved forsiktig pipettering opp og ned. Ved å følge trinn 1.2.1 gjennom 1.2.3 ovenfor for å trypsinize celler, fortsetter å subkultur celler til vev kultur retter som beskrevet i trinn 1.2.5 gjennom 1.2.7 når de er mellom 75 - 80% confluent.
- Subkultur fra en brønn i en 6-brønns plate opptil en T-25 cm 2 kolbe i et endelig volum på 5 ml EMEM-20% + S, såing mellom 0,5 til 1 x 10 6 celler / kolbe.
- Anvendelse av 5 ml varmet trypsin pr T-25 cm 2 kolbe å løsne cellene, subkulturfra en T-25 cm 2 kolbe opptil en T-75 cm 2 kolbe i et endelig volum på 10 ml EMEM-20% + S, såing mellom 1-5 x 10 6 celler / kolbe.
- Bruker 8 ml varmet trypsin per T-75 cm 2 kolbe til å koble celler, subkultur fra en T-75 cm 2 kolbe i 2 T-75 cm 2 flasker. For optimal cellevekst, ikke subkultur celler i kolber større enn T-75 cm 2 eller subkultur i forholdet større enn 1 forelder kolbe: 3 nye kolber.
- Når cellene er blitt subkultivert, fjerne og erstatte medium hver 2 til 3 dager før de når 75-90% samløpet. Celler kan ta opptil tre uker å komme 75-90% samløpet. For optimal generasjon av polariserte kulturer, subkultur celler før de vokser utover 90% samløpet som et enkeltlag.
- Fortsett å subkultur celler til nok celler har vokst til frø ønsket antall Transwell innsatser. Hver Transwell innsats krever 2 × 10 5 celler. For optimal ytelse generere polariserte kulturer, bruker celler som har gjennomgått mer enn 10 subkulturer.
2. Økende Polarisert Calu-3 flytende dekket kulturer (LCC)
Sikkerhetstiltak: Utfør alle prosedyrer i en biosafety skap med steril kultur teknikk.
- Forbered EMEM inneholdende 10% FBS (EMEM-10%) og varm i et vannbad til 37 ° C.
- Forbered en 24-brønners Transwell plate for seeding. Ved hjelp av steril tang, flytter Transwell setter fra indre til ytre rader av platen uten å berøre innsatsen membran. Celler bør bare subkultiveres i brønner på de ytre rader av plate. Å hindre innføring av luft i basolateral avdelinger, tilsett 600 ul EMEM-10% til hver en ved å vinkle pipetten mot veggen av hvert kammer og sakte slippe mediet og inn i brønnen.
- Koble celler fra T-75 cm 2 vev. SubcuLTURE kolber bruker warmed trypsin, og vask i 30 ml EMEM-20% + S per hver 2 flasks trypsinert celler, som beskrevet i trinn 1.2.
- Grundig resuspender de vaskede celler i 5 ml EMEM-10% ved å forsiktig pipettere opp og ned.
- Bestem levedyktige og total celletall ved trypan blå utelukkelse metoden. Fortsett kun om 80% - 90% er levedyktig.
- I en 50 ml steril konisk tube, fortynne cellene til en konsentrasjon av 2 x 10 6 levedyktige celler / ml med EMEM-10%.
- Legg celler til den apikale kupé av hver Transwell. Til brønner A1 og D1, som vil være celle-frie kontroll brønner, det vil si blanks, tilsett 100 pl EMEM-10% uten celler. Til hver av de gjenværende brønnene, tilsett 100 pl av resuspenderte Calu-3-celler, forsiktig fiske pipetten mot det indre føringskanal av innsatsen veggen og langsomt frigjøre cellene. Ikke berør pipetten til innsatsen membran. For å opprettholde en homogen suspensjon av Calu-3-celler, forsiktig agitere cellesuspensjonenunder denne seeding trinnet.
- Inkuber Transwell plate ved 37 ° C og 7% CO 2 i luftatmosfære. Sett platen i en inkubator der fysisk forstyrrelse vil være minimal. For å forbedre effektiviteten av polariseringen, ikke stable platene oppå hverandre.
- For å opprettholde kulturer inntil polarisert og klar til bruk i eksperimenter, helt erstatte medium i Transwells, som beskrevet i trinn 2.10 gjennom 2.13 under. Medium skal erstattes helt tre dager etter å ha blitt subkultiveres inn Transwells, og deretter på en syklus veksler mellom den fjerde og deretter tredje dag etter at den forrige fôring, til cellene er fullt polarisert.
- Varm EMEM-10% i et vannbad til 37 ° C.
- Forsiktig aspirer medium fra Transwell innsatser. Med en kapillær pipette festet til et vakuum felle med en mild vakuum, eller med en standard 1 ml pipette aspirat medium fra cellefrie brønner A1 og D1, deretter fra seeded brønner, først å fjerne apikal medium fra alle brønner, og thøne fjerne basolateral medium fra alle brønnene. Ikke berør insert membraner mens aspirere medium.
- Tilsett 200 pl av EMEM-10% til den apikale kupé av cellefrie brønner A1 og D1, deretter til kimsatte brønnene, dirigere mediet inn den apikale kupé med siden av innsatsen for å lede pipettespissen. Ikke legg medium direkte på cellene, og ikke rør innsatsen membran.
- Legg 600 pl EMEM-10% til de basolateral kupeene. Å hindre innføring av luft i basolateral avdelinger, legge medium til hver enkelt ved fiske pipetten mot veggen av hvert kammer og sakte slippe mediet og inn i brønnen.
3. Evaluering av Resistance Utvikling av Calu-3 LCC
Sikkerhetstiltak: Utfør alle prosedyrer i en biosafety skap med steril kultur teknikk.
- Vurdere trans-epitelial elektrisk motstand (Teer) av Calu-3 LCC 30 min ettermiddels endringer; evalueringen kan utføres etter hvert medium endres hvis ønskelig. Utføre målinger under sterile betingelser. Begynn målinger med cellefri kontroll brønner A1 og D1 (emnene) for å oppnå grunnverdimålingene, og fortsette med målinger for hver brønn.
- Under sterile betingelser, overføre STX2 elektroden til en 50 ml sentrifugerør inneholdende 70% etanol i sterilt vann, og sterilisere 15 min.
- Kalibrere og teste voltohmmeter for bruk i henhold til produsentens anvisninger.
- Fjern elektroden fra etanol, lufttørke 5-10 sek, og skyll elektroden med sterilt EMEM-10%.
- Sett modusbryteren av voltohmmeter til RESISTANCE innstillingen, og slå på strømmen.
- Forsiktig plassere elektroden i en av de tre porter som tillater tilgang til det basolateral kupé av en Transwell kultur. Plass elektroden slik at jo lenger ledningen bare lett berører bunnen av den ytre brønn og forblir vertikal,og jo kortere bly er i vevskulturmedium av apikal kupeen, uten å berøre innsatsen membran.
- Trykk "Mål R"-knappen, og vent til lesing å stabilisere seg. Gjenta for de andre to porter for hver brønn og registrere målinger fra alle tre porter, for totalt tre målinger per brønn. Fortsette å måle motstanden til alle brønner av celler.
- Rengjør elektroden ved soaking 5-10 min i 70% etanol, skylling i sterilt dH 2 O, og tørking grundig. Oppbevares i den originale emballasjen.
- Beregne motstanden fra hver brønn, ved hjelp av ligning 1.
Ω faktiske = Ω sample - Ω blank, Equation en
hvor Ω prøven er gjennomsnittlig måling fra en brønn og seeded Ω blank er gjennomsnittlig måling fra 2 brønner, A1 og D1, inneholdende innstikk og middels, men ingen celler. - Beregn arealenhet motstand, ved hjelp av likningsjon 2.
Ω avvike × effektive membranareale = Ω × cm 2, ligning 2
hvor effektiv membran området er 0,33 cm 2 for 24-brønners Transwell innsatser.
- Kontroller at polariseringen er fullført ved å utføre en sekundær analyse, måling passiv natrium fluorescein diffusjon mellom apikale og basolateral avdelinger, på 02:59 Transwell kulturer. Brønnene brukes for natrium fluorescein analysen bør kastes umiddelbart etter fullføring av analysen.
- Forbered ikke-fluorescerende buffer (118 mM NaCl, 4,75 mM KCl, 2,53 mM CaCl 2 0.2 H 2 O; 2,44 mM MgSO 4, 1,19 mM KH 2 PO 4, 25 mM NaHCO 3 i sterilt vann, sterilt filter med 0,45 mikrometer filtrering enhet ). Forbered natrium fluorescein på 1 mg / ml i ikke-fluorescerende buffer, sterilt filter, pakk i aluminiumsfolie, og oppbevar ved 4 ° C, beskyttet mot lys. Varme til rommet temperare før bruk.
- Etter å ha fullført motstandsmålinger, fjern forsiktig medium fra både basolateral og apikal avdelinger av 2:59 individuelle Transwell kulturer.
- Skyll Transwell kulturer. Tilsett 600 pl romtemperatur sterilt Dulbeccos PBS (D-PBS) til basolateral avdelinger og 100 ul romtemperatur sterile D-PBS til den apikale kupeene.
- Fjern forsiktig D-PBS fra brønner. Legg 600 ul sterilt, ikke-fluoriserende buffer til basolateral avdelinger. Tilsett 100 pl sterilt 1 mg / ml natrium fluorescein til den apikale kupeene.
- Inkuber platen ved 37 ° C i 1 time. CO 2 er ikke nødvendig i denne inkubasjon.
- Under inkubering, forberede en natrium fluorescein standardkurve varierer mellom 20 pg / ml og 0 ug / ml, ved hjelp av ikke-fluorescerende buffer å fortynne natrium fluorescein. Forberede minst 8 forskjellige konsentrasjoner av natrium fluorescein, hver i et endelig volum på minst 600 pl. Holdstandardkurve fortynninger beskyttet mot lys før du er klar til å måle absorbans.
- Overføre den ikke-fluorescerende buffer prøve fra basolateral kupé av hver test Transwell til en separat rent rør for analyse. Fjern testen Transwells brukes til å undersøke passiv natrium fluorescein diffusjon fra platen og kast. Returnere platen med gjenværende Transwells til inkubatoren.
- Plasser 100 ul av hver standardløsning i triplikat i en 96-brønns flatbunnet plate.
- Forbered tre fortynninger av hver prøve basolateral (1:2, 1:20, og 1:50) i ikke-fluorescerende buffer, og tilsett 100 ul av hver prøve og ufortynnet av hver fortynning, i duplikat, til et 96-brønners flat- bunnplaten.
- Mål prøve absorbans på en ELISA plate leseren på 486 nm eller 490 nm.
- Bestemme konsentrasjonen av natrium fluorescein i basolateral kammeret ved å sammenligne absorbans av prøvene mot absorbansverdier for natrium fluorescein stAndard kurve.
4. Infisere Polarized Calu-3 LCC med Respiratory Virus
Sikkerhetstiltak: Utfør alle prosedyrer i en biosafety skap med steril kultur teknikk, på et biosafety nivå som passer for viruset som brukes.
- Fortynn virus i serumfritt EMEM slik at ønsket inokula ville være i 100 ul.
- Vask celler i serumfritt EMEM. Forsiktig aspirer medium fra alle brønnene, fjerne den apikale mediet så basolateral medium. Med en kapillær pipette festet til et vakuum felle med en mild vakuum, eller med en standard 1 ml pipette aspirat medium fra cellefrie brønner A1 og D1, deretter fra seeded brønner, først å fjerne den apikale mediet fra alle brønner, og deretter fjerne det basolateral medium fra alle brønnene. Ikke berør insert membraner mens aspirere medium.
- Legg 100 pl serumfritt EMEM til den apikale kupé av cellefrie brønner A1 og D1, og deretter til than seeded brønner, dirigere mediet inn den apikale kupé med siden av innsatsen for å lede pipettespissen. Ikke legg medium direkte på cellene, og ikke rør innsatsen membran.
- Legg 600 pl serumfritt EMEM til basolateral kupeene. Legg medium til hver Transwell ved å vinkle pipetten mot veggen av kammeret og sakte slippe mediet og inn i brønnen.
- Forsiktig Aspirer serumfritt medium fra brønner.
- Fra og med friske eller mock-infiserte brønner, legge til passende virus fortynninger til den apikale kupé av Transwells. For uinfiserte brønner, tilsett 100 ul serumfritt EMEM til den apikale segment hensiktsmessige Transwells, for mock-infiserte brønner, tilsett 100 pl av virusfri preparat fortynnet i serumfritt EMEM til den apikale segment hensiktsmessige Transwells, og for virusinfeksjon, fortynne virus i serum-fri EMEM og tilsett 100 ul til apikale avdelinger av aktuelle Transwells.
- Legg 600 pl serumfritt EMEM til alle basolateral kupeene.
- Inkuber ved 37 ° C og 7% CO 2 i 2 timer.
- Aspirere medium fra brønner, først fra infisert og mock-infiserte brønner, og deretter fra infiserte brønner. Fjern apikale supernatanter først, etterfulgt av basolateral supernatanter.
- Erstatt medium med 200 pl EMEM-10% i de apikale avdelinger og 600 ul EMEM-10% i de basolateral kupeene.
Representative Results
Når dyrket som væske-dekket kulturer (LCC) i Transwell dyrkingssystemer, som illustrert i figur 1, Calu-3-celler polariserer, utvikle distinkte apikale og basolateral overflater. Følge metoden beskrevet her, når den trans-epiteliale elektrisk motstand (teer) av Calu-3 LCC et platå på eller over 1.000 Ω × cm 2 innen 3 uker etter såing, et eksempel som er vist i figur 2. De tett veikryss dannet mellom polariserte celler hindre passiv likevekt av små molekyler mellom apikale og basolateral avdelinger. Dermed er en modifisert natrium fluorescein ekvilibrering test som benyttes for å bekrefte polarisering av Calu-3 LCC 15,17,18. Som Teer av Calu-3 cellers monolayers i LCC øker, reduserer mengden av fluorescein som passivt equilibrates i basolateral kupé. Når teer er 1.000 Ω × 2 cm, mengden av fluorescein som equilibrates itil basolateral kupé ≤ 1%, som vist i Figur 3, og derfor er Calu-3 LCC betraktes å være fullt polarisert når teer er ≥ 1000 Ω × cm 2. Toppen Teer måling av Calu-3 LCC kan variere fra eksperimentet til å eksperimentere. Men når teer verdier platå for enhver gitt eksperiment, kan en fullt polarisert, uinfisert Calu-3 LCC være stabil for 5 gjennom 12 uker etter såing. Fravær av resistensutvikling i Transwell-kultivert Calu-3 kan være forårsaket av flere faktorer som er skissert i tabell 1.. Når teer av Calu-3 LCC platåer på eller over 1000 Ω × cm 2, er modellen klar til å bli brukt til å undersøke luftveier epiteliale celle responser til respiratoriske patogener, inkludert respiratorisk syncytial virus (RSV). Eksponering for RSV resulterer i en mer rask nedgang i polarisert kultur integritet i forhold til en mock-infeksjon av celler (figur 4).
Figur 1. Tverrsnitt representasjon av Transwell-dyrkede celler. Cellene dyrkes på den apikale overflate av innsatsen membran.
Figur 2. Utvikling av trans-epitelisk elektrisk motstand (teer) og polarisering av Calu-3-celler etter såing i Transwell innsatser. Ved hvert tidspunkt, er teer presentert som median Ω x cm 2 ± SEM av 32 uavhengige brønner fra en representativ eksperiment.
Figur 3. Passiv equili bration av natrium fluorescein i basolateral kupé av Calu-3 cellers monolayers hemmes som cellene blir polarisert. Kumulative data fra fire uavhengige eksperimenter er presentert. Hvert datapunkt representerer en individuell måling.
Figur 4. RSV-infeksjon av polarisert Calu-3 LCC akselererer en nedgang i monolag integritet. Polarisert Calu-3-celler ble infisert med RSV-A2 på en MOI = 1 på dag 0, og polariteten ble overvåket i 8 uker etter infeksjon. En representant eksperimentet vises. Data er presentert som median motstand 8 uavhengige brønner per infeksjon ± SEM per tidspunkt. * P <0,05 mellom mock-og RSV-A2-infiserte kulturer, som bestemmes av Student t-test.
- Fjern eventuelle luftbobler i brønnene
- Bruk Calu-3-celler som har blitt subkultivert fra frossen lager mindre enn 10 ganger
- Ikke la Calu-3 celler for å nå 100% samløpet i monolayer subkultur
- Kontroller at celler ikke vokser på plast godt under innsatsen (som indikerer at celler kan ha vokst gjennom porene av innsatsen)
- Ta 2-3 uker etter såing for full resistensutvikling
- Kontroller komposisjonen og porestørrelse av innstikk brukes, om nødvendig (anbefalt polyester innsats, 0,3 mikrometer porestørrelse, ingen belegg, se materialer for detaljer)
- Sjekk kvaliteten elektroden, sliping forsiktig for å fjerne akkumulert proteiner fra tuppen, og erstatte eventuelt
- Kontroller medium for bakterievekst
- Sette av ekstra tid for polarisering å utvikle (kan noen ganger ta opptil 4 uker)
- Bruk Calu-3-celler som har blitt subkultivert fra frossen lager mindre enn 10 ganger
- Ikke la Calu-3 celler for å nå 100% samløpet i monolayer subkultur
- Konsekvent erstatte medium i Transwell kulturer, alternerende mellom den tredje og deretter fjerde dagen etter forrige fôring
- Kun kultur celler i innstikk som er plassert i de ytre rader av plater
- Bruk en annen masse Transwell inserts
- Ikke forstyrre eller stable platene i kuvøse
- Ikke forårsake vibrasjoner i biosafety kabinettet mens Transwell plates blir håndtert
- Fjern eventuelle luftbobler i brønnene
- Ikke forstyrr cellelaget med pipettespissene ved skifte media eller utføre Teer avlesninger
- Bruke 200 ul medium i den apikale kupé, lavere volum kan føre til ustabile Teer målinger
- Sjekk kvaliteten elektroden, sliping forsiktig for å fjerne akkumulert proteiner fra tuppen, og skiftes om nødvendig
Tabell 1. Å løse problemer som kan oppstå når dyrking Calu-3 celler i Transwells. Flere faktorer bidrar til full polarisering av Calu-3 celler i flytende dekket kulturer, den mest sannsynlige av disse er uthevet i denne tabellen.
Discussion
Ved etablering Calu-3 LCC i Transwell innsatser, kan cellene ikke polarisere det hele tatt, eller kanskje ikke fullt polarisere, som definert av en Teer ≥ 1000 Ω × cm 2 og ≤ 1% natrium fluorescein fargestoff likevekt mellom apikale og basolateral avdelinger. I tillegg kan Calu-3-celler i LCC fullt polarisere, men teer kan være inkonsekvent mellom målinger. Selv svingninger i Teer målinger av Calu-3 LCC er normalt fra dag til dag, er nok en helt polarisert, dramatiske svingninger i Teer ikke forventet før kulturen naturlig avtar med alderen, noe som kan være så lite som 5 uker eller så lenge som 12 uker etter såing.
Evnen Calu-3 LCC å polarisere avhenger delvis av hvor celler vedlikeholdt og subkultivert før bruk i Transwell systemet. Celler som har vokst utover 90% konfluens som et enkeltlag under subculturing, som har blitt subkultivert mer enn 10 ganger fra frossen lager, eller som ikke har væreno forsynes med fersk medium regelmessig er mindre sannsynlig å fullt polarisere, og enhver polarisering er sannsynlig å avta raskt. Ufullstendig eller total mangel på polarisering kan også tilskrives variasjon i materialet og porestørrelsen av Transwells brukes for Calu-3 LCC, og varen til lot variasjon i Transwells med lignende sammensetning og porestørrelse kan også påvirke polarisering. Større porestørrelser kan tillate Calu-3 for å vokse gjennom Transwell membranen inn i basolateral kupé, hindrer kultur fra polariserende. Et fravær av polarisering kan også skyldes bakterievekst, angitt med tåkete kultur medium, noe som fører til påfølgende nedbryting av tett veikryss mellom Calu-3 celler.
Variable teer målinger av Calu-3 LCC kan være forårsaket av mekaniske forstyrrelser av Calu-3 LCC celle monolag, skivene eller platene selv. Medium endringer og Teer målinger bør utføres uten pipettespissene eller elektrode fører berøre cellene. Mens du utfører disse operasjonene, bør man sørge for å unngå å introdusere luftbobler inn i apikale og basolateral rom, hvilket vil forstyrre evnen til voltohmmeter å oppdage motstand. Muligheten av voltohmmeter å oppdage resistens i en kultur som er faktisk polarisert kan også begrenses av proteinbelegg på elektrodeavledningene. Dette oppbyggingen kan fjernes med milde sliping, eller kan bli korrigert ved å erstatte elektroden.
Gang Calu-3 LCC helt polarisere og Teer ikke lenger stiger, Calu-3 LCC er klare for bruk som en in vitro modell for å karakterisere vert lunge epithelial celle responser til luftveisinfeksjon. Dette systemet tillater bedre karakterisering av retningsbestemt respons på patogener i forhold til monolayer-dyrkede lunge cellelinjer som tradisjonelt er brukt til å studere respiratoriske patogener, som for eksempel A549 og HEP-2 celler, med de ekstra fordelene ved Calu-3 LCC being raskere å utvikle, lettere oppnås, og mindre kostbart å skape enn primær, polarisert, differensiert NHBE. I likhet med NHBE, polarisert Calu-3 demonstrere tett veikryss formasjon, og produserer mucins. Men i motsetning til NHBE, gjør polarisert Calu-3 celler ikke differensiere i lag med basal celler og ciliated columnar epitelceller, og få polariserte Calu-3 celler utvikle cilia-lignende anslag 19. Derfor, selv om nyttige for behandlingen polariserte reaksjoner i luftveiene epitelceller til luftveiene fornærmelse, polarisert Calu-3 LCC er ikke en ideell modell for å undersøke luftveiene utvikling eller ombygging i respons til luftveiene fornærmelse eller skade. Slimproduksjon av dyrkede celler in vitro kan påvirke cellulær smittsomhet, samt frigjøring av infeksiøst virus og virus oppslag i en polarisert modell, og en direkte sammenligning av slimproduksjon mellom polarisert Calu-3 LCC og polarisert, differensiert NHBE har ikke blitt rapportert . A549 og HEP-2 celler enre lettere å kultur enn Calu-3 celler, men i motsetning Calu-3 LCC, har de ikke danner polariserte kulturer når dyrket på Transwell innstikk, og er således ikke ideelle modeller for å undersøke in vitro svarene polariserte epitelceller i luftveiene virusinfeksjon .
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Elisabeth Blanchard for henne teknisk assistanse. Funnene og konklusjonene i denne rapporten er de av forfatterne, og ikke nødvendigvis representerer synspunktene til Centers for Disease Control and Prevention.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Calu-3 | ATCC | HTB-55 | |
| 0.05% Trypsin - 0.02% EDTA | Gibco/Invitrogen | 25300 | |
| Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) | Gibco/Invitrogen | 07-00100DK | |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | SH30070.03 | Heat-inactivate, 56 °C, 30 mins |
| Non-essential amino acids 100X (10 mM) | Gibco/Invitrogen | 11140 | Store at 4 °C in the dark |
| L-glutamine | Gibco/Invitrogen | 25030 | |
| HEPES | Gibco/Invitrogen | 15630 | |
| EMEM-10% FBS (EMEM-10%) | Supplement EMEM with heat-inactivated FBS to 10% serum, sterile-filter | ||
| EMEM-20% FBS + supplements (EMEM-20%+S) | Supplement EMEM to final concentrations: heat-inactivated FBS, 20%; 1X amino acids; 2 mM L-glutamine; 10 mM HEPES; sterile-filter | ||
| 24-well Transwell plates | Corning Costar | 3472 | 3 μm pore size, polyester |
| Trypan blue | Gibco/Invitrogen | 15250 | |
| Ethanol | Sigma | E7023 | Prepare to 70% using sterile dH2O |
| Dulbecco's PBS (D-PBS) | Invitrogen | 14040 | |
| Non-fluorescent buffer | 118 mM NaCl; 4.75 mM KCl; 2.53 mM CaCl2×H2O; 2.44 mM MgSO4; 1.19 mM KH2PO4; 25 mM NaHCO3 in sterile water; sterile-filter | ||
| Sodium fluorescein | Sigma | 6377 | 1 mg/ml in sterile non-fluorescent buffer; sterile-filter, protect from light; store at 4 °C up to 6 months |
| EQUIPMENT | |||
| Voltohmmeter | World Precision Instruments | ||
| STX2 electrode | World Precision Instruments | ||
| ELISA plate reader | Capable of measuring A486 or A490 | ||
References
- Zhu, Y., Chidekel, A., Shaffer, T. H. Cultured human airway epithelial cells (calu-3): a model of human respiratory function, structure, and inflammatory responses. Critical care research and practice. 2010, (2010).
- Mukherjee, M., Pritchard, D. I., Bosquillon, C. Evaluation of air-interfaced Calu-3 cell layers for investigation of inhaled drug interactions with organic cation transporters in vitro. International journal of pharmaceutics. 426, 7-14 (2012).
- Baginski, L., et al. Investigations into the fate of inhaled salmon calcitonin at the respiratory epithelial barrier. Pharmaceutical research. 29, 332-341 (2012).
- Vllasaliu, D., Alexander, C., Garnett, M., Eaton, M., Stolnik, S. Fc-mediated transport of nanoparticles across airway epithelial cell layers. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. , (2011).
- Vinhas, R., et al. Pollen proteases compromise the airway epithelial barrier through degradation of transmembrane adhesion proteins and lung bioactive peptides. Allergy. 66, 1088-1098 (2011).
- Hein, S., Bur, M., Schaefer, U. F., Lehr, C. M. A new Pharmaceutical Aerosol Deposition Device on Cell Cultures (PADDOCC) to evaluate pulmonary drug absorption for metered dose dry powder formulations. European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics : official journal of Arbeitsgemeinschaft fur Pharmazeutische Verfahrenstechnik e. 77, 132-138 (2011).
- Huttunen, S., Toivanen, M., Arkko, S., Ruponen, M., Tikkanen-Kaukanen, C. Inhibition activity of wild berry juice fractions against Streptococcus pneumoniae binding to human bronchial cells. Phytotherapy research: PTR. 25, 122-127 (2011).
- Elm, C., Rohde, M., Vaerman, J. P., Chhatwal, G. S., Hammerschmidt, S. Characterization of the interaction of the pneumococcal surface protein SpsA with the human polymeric immunoglobulin receptor (hpIgR). The Indian journal of medical research. 119, 61-65 (2004).
- Sutherland, T. C., Quattroni, P., Exley, R. M., Tang, C. M. Transcellular passage of Neisseria meningitidis across a polarized respiratory epithelium. Infection and immunity. 78, 3832-3847 (2010).
- Grantham, M. L., et al. Palmitoylation of the influenza A virus M2 protein is not required for virus replication in vitro but contributes to virus virulence. Journal of. 83, 8655-8661 (2009).
- Saedisomeolia, A., Wood, L. G., Garg, M. L., Gibson, P. G., Wark, P. A. Lycopene enrichment of cultured airway epithelial cells decreases the inflammation induced by rhinovirus infection and lipopolysaccharide. The Journal of nutritional biochemistry. 20, 577-585 (2009).
- Yoshikawa, T., Hill, T., Li, K., Peters, C. J., Tseng, C. T. Severe acute respiratory syndrome (SARS) coronavirus-induced lung epithelial cytokines exacerbate SARS pathogenesis by modulating intrinsic functions of monocyte-derived macrophages and dendritic cells. Journal of virology. 83, 3039-3048 (2009).
- Yoshikawa, T., et al. Dynamic innate immune responses of human bronchial epithelial cells to severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus infection. PloS one. 5, e8729 (2010).
- Hsu, A. C., et al. Critical role of constitutive type I interferon response in bronchial epithelial cell to influenza infection. PloS one. 7, e32947 (2012).
- Harcourt, J. L., Caidi, H., Anderson, L. J., Haynes, L. M. Evaluation of the Calu-3 cell line as a model of in vitro respiratory syncytial virus infection. Journal of virological methods. 174, 144-149 (2011).
- Zhang, L., Peeples, M. E., Boucher, R. C., Collins, P. L., Pickles, R. J. Respiratory syncytial virus infection of human airway epithelial cells is polarized, specific to ciliated cells, and without obvious cytopathology. Journal of virology. 76, 5654-5666 (2002).
- Geys, J., et al. In vitro study of the pulmonary translocation of nanoparticles: a preliminary study. Toxicology letters. 160, 218-226 (2006).
- Geys, J., Nemery, B., Hoet, P. H. Optimisation of culture conditions to develop an in vitro pulmonary permeability model. Toxicology in vitro : an international journal published in association with BIBRA. 21, 1215-1219 (2007).
- Grainger, C. I., Greenwell, L. L., Lockley, D. J., Martin, G. P., Forbes, B. Culture of Calu-3 cells at the air interface provides a representative model of the airway epithelial barrier. Pharmaceutical research. 23, 1482-1490 (2006).
