Summary
Resultaten och slutsatserna i denna rapport är författarnas egna och representerar inte nödvändigtvis åsikterna hos Centers for Disease Control and Prevention.
Abstract
Den apikala och basolaterala ytor epitelceller i luftvägarna visar riktade svar på patogen exponering in vivo. Således perfekt in vitro-modeller för att undersöka cellulära svar på respiratoriska patogener polarisera och bildar apikala och basolaterala ytor. En sådan modell är differentierad normala humana bronkialepitelceller (NHBE). Emellertid kräver detta system lung vävnadsprover, expertis isolering och odling epitelceller från vävnad, och tid för att generera ett luft-vätske-gränssnittet kultur.
Calu-3-celler, härledda från en human bronkial adenokarcinom, är en alternativ modell för att undersöka gensvaret hos proximala epitelceller i luftvägarna till respiratorisk förolämpning 1, farmakologiska föreningar 2-6, och bakteriella 7-9 och virala patogener, inklusive influensavirus, rhinovirus och svår akut respiratorisk sjukdom - associerad coronavirus 10-14. Nyligen, we visade att Calu-3-celler är känsliga för respiratoriskt syncytialvirus (RSV) infektion på ett sätt som överensstämmer med NHBE 15,16. Här har vi detalj inrättandet av en polariserad, flytande täckta kultur (LCC) i Calu-3-celler, med fokus på de tekniska detaljerna i växande och odling Calu-3-celler, underhåll celler som har odlats i LCC, och vi presenterar metod för att utföra respiratorisk virusinfektion av polariserade Calu-3-celler.
Att konsekvent erhålla polariserad Calu-3 LCC, Calu-3 celler måste noggrant subodlas före odling i Transwell skär. Calu-3 monoskiktkulturer bör förbli under 90% sammanflöde, bör subkultiveras färre än 10 gånger från frysta lager, och bör regelbundet förses med färskt medium. När odlas i Transwells måste Calu-3 LCC hanteras varsamt. Oregelbundna media förändringar och mekanisk eller fysisk störning av cellskikten eller plattor inverka negativt polarisering förflera timmar eller dagar. Polarisering övervakas genom att utvärdera trans-epitelial elektriskt motstånd (TEER) och verifieras genom att utvärdera den passiva utjämning av natriumfluorescein mellan de apikala och basolaterala fack 17,18. När TEER platåer vid eller över 1.000 Ω × cm 2, Calu-3 LCC är redo att använda för att undersöka cellulära svar på respiratoriska patogener.
Protocol
1. Odling Calu-3 celler för användning i Transwell kulturer
Säkerhetsåtgärder: Utför alla förfaranden i en biosäkerhet skåp med steril kultur teknik.
- Att tina celler från frysförvaring:
- Förbered Eagles Minimum Essential Medium innehållande 20% värmeinaktiverat fetalt bovint serum (FBS), 0,1 mM icke-essentiella aminosyror, 2 mM L-glutamin, och 10 mM HEPES pH 7,4 (EMEM-20% + S). Steril-filtrera det beredda mediet med användning av en 0,2 | im porstorlek filter och varmt i ett vattenbad till 37 ° C. För att vara mer reflekterande av in situ luftvägsepitel miljö, medium inte kompletteras med antibiotika eller antimykotika.
- Tina en frusen köldkärlet av Calu-3-celler snabbt (<1 minut) i en 37 ° C vattenbad.
- Överför de upptinade cellerna till en 50 ml sterilt koniskt rör och tillsätt 30 ml uppvärmd EMEM-20% + S.
- Pelletera cellerna genom centrifugering under 5 min vid 1000-1200 x g,utan kylning, och med låg hastighet broms.
- Dekantera supernatanten försiktigt och återsuspendera cellerna i 5 ml uppvärmd EMEM-20% + S genom att försiktigt pipettera upp och ned. Frö från 2 till 5 x 10 6 celler per brunn i en 6-brunnars vävnadsodlingsplatta och inkuberas vid 37 ° C, 7% CO 2 i luft atmosfär tills cellerna är 75% - 80% sammanflytande. Kontrollera dagligen, upp till 7 dagar kan krävas. Var 3-4 dagar aspirera mediet från cellerna och ersätta det med färsk EMEM-20% + S.
- Till subkultur celler:
- Varm 0,05% trypsin - 0,02% EDTA i en 37 ° C vattenbad. Aspirera mediet från cellerna, och tvätta cellerna en gång med uppvärmt 0,05% trypsin - 0,02% EDTA för att avlägsna överskott av medium och serum. Avlägsna tvätt och tillsätt 1 ml av uppvärmd trypsin per brunn till cellerna.
- Inkubera vid 37 ° C och 7% koldioxid 2 och monitorn under ett mikroskop var 5 min tills åtminstone 75% av cellerna lossnar från brunnen (er) av vävnaden odlingsplattan. Detta kanta mellan 5 och 30 minuter.
- Tvätta celler i EMEM-20% + S för att avlägsna överskott av trypsin. Överför trypsinerade cellerna till en 50 ml sterilt koniskt rör. Flera brunnar av celler från en 6-brunnars odlingsplatta kan poolas i en 50 ml sterilt koniskt rör. Tillsätt 30 ml EMEM-20% + S och pelletera cellerna genom centrifugering vid 1000-1200 x g, utan kylning, och med låg hastighet broms.
- Dekantera supernatanten försiktigt och återsuspendera cellerna i färskt EMEM-20% + S genom att försiktigt pipettera upp och ned. Använda steg 1.2.1 till 1.2.3 ovan för att Trypsinisera celler fortsätter att subkultur celler till vävnadsodlingsskålar som beskrivs i steg 1.2.5 till 1.2.7 när de är mellan 75 till 80% sammanflytande.
- Subodling från en brunn i en 6-brunnars platta upp till en T-25 cm 2-kolv i en slutlig volym av 5 ml EMEM-20% + S, ympning mellan 0,5 till 1 x 10 6 celler / flaska.
- Använda 5 ml uppvärmd trypsin per T-25 cm 2 kolv att lösgöra celler, subkulturfrån en T-25 cm 2 kolv upp till en T-75 cm 2-kolv i en slutlig volym av 10 ml EMEM-20% + S, ympning mellan 1 till 5 x 10 6 celler / flaska.
- Använda 8 ml uppvärmd trypsin per T-75 cm 2 kolv att lösgöra celler, subkultur från en T-75 cm 2-kolv i 2 T-75 cm 2 kolvar. För optimal celltillväxt, inte subkultur celler i kolvar större än T-75 cm 2 eller subkultur vid ett förhållande som är större än 1 överordnade kolv: 3 nya kolvar.
- När celler har subodlades, helt ta bort och ersätta medium var 2 till 3 dagar tills de når 75-90% konfluens. Celler kan ta upp till 3 veckor för att nå 75-90% konfluens. För optimal generation polariserade kulturer, celler subkultur innan de växer mer än 90% sammanflöde som ett monolager.
- Fortsätt att subkultur cellerna tills tillräckligt med celler har vuxit till frö önskat antal Transwell insatser. Varje Transwell insats kräver 2 x 10 5 celler. För optimal prestanda genererar polariserade kulturer, använda celler som har genomgått högst 10 subkulturer.
2. Växande Polariserade Calu-3 Flytande täckta kulturer (LCC)
Säkerhetsåtgärder: Utför alla förfaranden i en biosäkerhet skåp med steril kultur teknik.
- Bered EMEM innehållande 10% FBS (EMEM-10%) och varmt i ett vattenbad till 37 ° C.
- Förbered en 24-väl Transwell platta för sådd. Användning av sterila pincetter, flyttar Transwell skär från det inre till de yttre raderna av plattan utan att röra insatsen membranet. Cellerna bör endast subkultiveras i brunnar på de yttre raderna av plattan. Att förhindra införsel av luftbubblor i den basolaterala facken, tillsätt 600 pl EMEM-10% till var och en genom att vinkla pipetten mot väggen av varje fack och långsamt frigöra mediet i brunnen.
- Lösgöra celler från T-75 cm 2 vävnad. Subculture kolvar med uppvärmd trypsin, och tvätta i 30 ml EMEM-20% + S per varje 2 flaskor av trypsiniserade celler, såsom beskrivs i steg 1,2.
- Grundligt resuspendera de tvättade cellerna i 5 ml EMEM-10% genom att försiktigt pipettera upp och ned.
- Fastställa livskraftiga och totalt celler från trypanblåttexklusion metod. Fortsätt bara om 80% - 90% är livskraftiga.
- I en 50 ml sterilt koniskt rör, späd cellerna till en koncentration av 2 x 10 6 livsdugliga celler / ml med EMEM-10%.
- Lägg celler till apikala facket varje Transwell. Till brunnarna A1 och D1, som kommer att vara cellfria kontrollbrunnar, som, ämnen, tillsätt 100 pl EMEM-10% utan celler. Till var och en av de återstående brunnarna, tillsätt 100 pl av återsuspenderade Calu-3-celler, försiktigt vinkla pipetten mot den inre styrkanal av insatsen väggen och långsamt frigöra cellerna. Rör inte pipetten till insatsen membranet. För att upprätthålla en homogen suspension av Calu-3-celler, skaka försiktigt cellsuspensionenunder detta steg sådd.
- Inkubera Transwell platta vid 37 ° C och 7% CO 2 i luft atmosfär. Placera plattan i en inkubator där fysisk störning kommer att vara minimala. För att förbättra effektiviteten av polarisering, inte stapla inte plattor ovanpå varandra.
- För att bibehålla kulturer tills polariserad och klar att använda i experiment, helt ersätta medium i Transwells, som beskrivs i steg 2,10 till 2,13 nedan. Medium bör vara helt bytas tre dagar efter att subodlades i Transwells, och sedan på en cykel växlar mellan fjärde och tredje dagen efter föregående utfodring, tills cellerna är helt polariserade.
- Varm EMEM-10% i ett vattenbad till 37 ° C.
- Försiktigt Aspirera medium från Transwell skär. Med en kapillär pipett fäst till ett vakuum fälla med en mild vakuum, eller med en vanlig 1 ml pipett, aspirera mediet från cellfritt brunnarna A1 och D1, sedan från ympade brunnar, först avlägsna apikalmedium från alla brunnar, och thöna bort basolaterala mediet från samtliga brunnar. Rör inte infoga membran under aspirerande medium.
- Tillsätt 200 pl EMEM-10% till den apikala avdelningen av cellfritt brunnarna A1 och D1, sedan till ympade brunnarna, rikta mediet i den apikala facket med den sida av insatsen för att styra pipettspetsen. Lägg inte medel direkt på celler och inte röra insatsen membranet.
- Lägg 600 pl EMEM-10% till de basolaterala facken. Att förhindra införsel av luftbubblor i den basolaterala facken, lägg medium till var och en genom att vinkla pipetten mot väggen av varje fack och långsamt frigöra mediet i brunnen.
3. Utvärdera resistensutveckling i Calu-3 LCC
Säkerhetsåtgärder: Utför alla förfaranden i en biosäkerhet skåp med steril kultur teknik.
- Utvärdera trans-epitelial elektriskt motstånd (TEER) i Calu-3 LCC 30 minuter eftermedelstora förändringar, utvärdering kan utföras efter varje medelhög förändring om så önskas. Utföra mätningar under sterila betingelser. Börja mätningar med cellfria kontrollbrunnar A1 och D1 (ämnena) för att få baslinjemätningar och fortsätta med mätningar för varje brunn.
- Under sterila betingelser, överföra stx2 elektroden till en 50 ml centrifugrör innehållande 70% etanol i sterilt vatten, och sterilisera 15 minuter.
- Kalibrera och testa voltohmmeter för användning enligt tillverkarens anvisningar.
- Ta bort elektroden från etanol, lufttorka 5-10 sek och skölj elektroden med sterila EMEM-10%.
- Ställ lägesväljaren på voltohmmeter till MOTSTÅND inställning och slå på strömmen PÅ.
- Försiktigt placera elektroden i en av de 3 portar som ger tillgång till den basolaterala fack en Transwell kultur. Placera elektroden så att ju längre leder bara nuddar botten yttre väl och förblir vertikala,och den kortare ledningen är i vävnadsodlingsmediet av apikala facket, utan att röra insatsen membranet.
- Tryck på "Åtgärd R"-knappen och vänta på avläsningen stabiliseras. Upprepa för de andra 2 portar för varje brunn och registrera mätningarna från alla tre portar, för totalt tre mätningar per brunn. Fortsätt att mäta resistansen för alla brunnar av celler.
- Rengör elektroden genom blötläggning 5-10 minuter i 70% etanol, sköljning i sterilt dH 2 O och torkning grundligt. Förvaras i originalförpackningen.
- Beräkna motståndet hos varje brunn, med användning av ekvation 1.
Ω faktiska = Ω prov - Ω tom, Ekvation 1
där Ω prov är genomsnittet mätning från en seedade bra och Ω tom är den genomsnittliga mätningen från 2 brunnar, A1 och D1, som innehåller insatser och medel, men inga celler. - Beräkna motståndet ytenhet, med Equaning 2.
Ω faktiska × effektiva membranyta = Ω × cm 2, ekvation 2
där den effektiva membranarean är 0,33 cm 2 för 24-brunnars Transwell skär.
- Kontrollera att polarisering är komplett genom att utföra en sekundär analys, mätning passiv diffusion natriumfluorescein mellan de apikala och basolaterala fack, på 1-3 Transwell kulturer. De brunnar som används för natriumfluorescein analysen bör kasseras omedelbart efter fullbordande av analysen.
- Framställa icke-fluorescerande buffert (118 mM NaCl, 4,75 mM KCl, 2,53 mM CaClz 2 .2 H 2 O, 2,44 mM MgSO 4, 1,19 mM KH 2 PO 4, 25 mM NaHCOs 3 i sterilt vatten, sterilt filter med 0,45 fim filtreringsanordning ). Förbered natriumfluorescein vid 1 mg / ml i icke-fluorescerande buffert, sterilfilter, linda i aluminiumfolie och förvara vid 4 ° C, skyddat från ljus. Värm till rums temperaturerre före användning.
- Efter avslutad motstånd mätningar försiktigt bort medel från både basolaterala och apikala fack 1-3 individuella Transwell kulturer.
- Skölj Transwell kulturer. Försiktigt lägga 600 pl rumstemperatur steril Dulbeccos PBS (D-PBS) till basolaterala facken och 100 ul rumstemperatur sterila D-PBS till de apikala fack.
- Ta försiktigt bort D-PBS från brunnarna. Lägg 600 pl sterilt icke-fluorescerande buffert till de basolaterala facken. Tillsätt 100 pl steril 1 mg / ml natrium fluorescein till de apikala fack.
- Inkubera plattan vid 37 ° C under 1 timme. CO 2 krävs inte under denna inkubation.
- Under inkubationen förbereda en natriumfluorescein standardkurva i intervallet mellan 20 | ig / ml och 0 ng / ml, med användning av icke-fluorescerande buffert för att späda natriumfluorescein. Bered minst 8 olika koncentrationer av natriumfluorescein, vardera i en slutlig volym på minst 600 | il. Hållstandardkurva utspädningar skyddas från ljus tills att mäta absorbansen.
- Överför icke-fluorescerande buffert prov från det basolaterala facket för varje test Transwell till ett separat rent rör för analys. Ta testet Transwells användes för att undersöka passiv diffusion natriumfluorescein från plattan och kassera. Avkastning plattan med kvarvarande Transwells till inkubatorn.
- Placera 100 pl av varje standardlösning i triplikat till en 96-brunnars flatbottnad platta.
- Bered tre utspädningar av varje prov basolaterala (1:2, 1:20 och 1:50) i icke-fluorescerande buffert, och tillsätt 100 pl av varje outspätt prov och varje utspädning, i duplikat, till en 96-brunnars platta bottenplatta.
- Mät absorbansen prov på en ELISA-plattavläsare vid 486 nm eller 490 nm.
- Bestäm koncentrationen av natriumfluorescein i den basolaterala facket genom att jämföra absorbansen av prover mot absorbansvärdena för natriumfluorescein standard kurva.
4. Infektera Polarized Calu-3 LCC med respiratoriskt virus
Säkerhetsåtgärder: Utför alla förfaranden i en biosäkerhet skåp med steril kultur teknik, på en skyddsnivå lämplig för viruset som används.
- Späd virus i serumfritt EMEM så att önskad inokulat skulle vara i 100 pl.
- Tvätta celler i serum-fri EMEM. Försiktigt aspirera mediet från samtliga brunnar, ta bort apikalmediet då det basolaterala mediumet. Med en kapillär pipett fäst till ett vakuum fälla med en mild vakuum, eller med en vanlig 1 ml pipett, aspirera mediet från cellfritt brunnarna A1 och D1, sedan från ympade brunnar, först avlägsna den apikala mediet från alla brunnar, och därefter avlägsna det basolaterala mediumet från alla brunnar. Rör inte infoga membran under aspirerande medium.
- Tillsätt 100 | il av serum-fri EMEM till den apikala avdelningen av cellfritt brunnarna A1 och D1 och sedan till than ympade brunnar, rikta medium i den apikala facket med den sida av insatsen för att styra pipettspetsen. Lägg inte medel direkt på celler och inte röra insatsen membranet.
- Lägg 600 ul serum-fri EMEM till basolaterala facken. Lägg medium till varje Transwell genom att vinkla pipetten mot väggen av kammaren och långsamt frigöra mediet i brunnen.
- Försiktigt Aspirera serumfritt medium från brunnarna.
- Börjar med oinfekterade eller skeninfekterade brunnar, lägga lämpliga virus spädningar till den apikala fack Transwells. För oinfekterade brunnar, tillsätt 100 pl av serum-fri EMEM till den apikala avdelningen av lämpliga Transwells för skeninfekterade brunnar, tillsätt 100 pl virusfritt preparat utspätt i serumfritt EMEM till den apikala avdelningen av lämpliga Transwells, och för virusinfektion, utspädd virus i serumfritt EMEM och tillsätt 100 pl till de apikala fack lämpliga Transwells.
- Lägg 600 ul serum-fri EMEM till alla basolaterala fack.
- Inkubera vid 37 ° C och 7% koldioxid 2 under 2 timmar.
- Sug medium från brunnar, först från oinfekterade och mock-infekterade brunnar och sedan från infekterade brunnar. Ta apikala supernatanter först, följt av basolaterala supematanter.
- Ersätt mediet med 200 pl EMEM-10% i de apikala fack och 600 pl EMEM-10% i de basolaterala facken.
Representative Results
Vid odling som flytande täckta kulturer (LCC) i Transwell odlingssystem, såsom illustreras i figur 1, Calu-3-celler polariserar, utveckla distinkta apikala och basolaterala ytorna. Enligt metoden som beskrivs här, når trans-epitelial elektriskt motstånd (TEER) i Calu-3 LCC en platå vid eller över 1.000 Ω x cm 2 inom 3 veckor efter sådd, ett exempel på vilken visas i figur 2. De tight junctions bildade mellan polariserade celler förhindra passiv ekvilibrering av små molekyler mellan de apikala och basolaterala fack. Sålunda, är en modifierad natriumfluorescein jämvikt analys användes för att bekräfta polarisering av Calu-3 LCC 15,17,18. Eftersom TEER i Calu-3 cellmonoskikt i LCC ökar, minskar mängden av fluorescein som passivt jämvikt i basolaterala facket. När TEER är 1.000 Ω x cm 2, mängden fluorescein som jämvikt itill den basolaterala facket är ≤ 1%, såsom visas i figur 3, och därför är Calu-3 LCC anses vara helt polariserad när TEER är ≥ 1.000 Ω x cm 2. Toppens TEER mätning av Calu-3 LCC kan variera från experiment till experiment. Men när TEER värden platå för varje givet experiment, kan en helt polariserad, oinfekterade Calu-3 LCC vara stabila under 5 till 12 veckor efter sådd. Avsaknad av resistensutveckling i Transwell-odlade Calu-3 kan orsakas av flera faktorer som anges i tabell 1. Snart TEER i Calu-3 LCC planar vid eller över 1000 Ω x cm 2, är modellen färdig att användas för att undersöka luftvägsepitelceller cellsvar på respiratoriska patogener, däribland respiratoriskt syncytialvirus (RSV). Exponering för RSV resulterar i en snabbare nedgång i polariserat kultur integritet jämfört med en modell infektion av celler (Figur 4).
Figur 1. Tvärsnitt representation av Transwell-odlade celler. Celler odlas på den apikala ytan av insatsen membranet.
Figur 2. Utveckling av trans-epitelial elektriskt motstånd (TEER) och polarisering av Calu-3-celler efter sådd i Transwell skär. Vid varje tidpunkt, är TEER presenteras som median Ω x cm 2 ± SEM av 32 oberoende brunnar från ett representativt experiment.
Figur 3. Passiv jämvikten brering av natriumfluorescein till basolaterala fack Calu-3 cellmonoskikt hämmas som celler blir polariserade. Ackumulerade data från fyra oberoende experiment presenteras. Varje datapunkt representerar en enskild mätning.
Figur 4. RSV-infektion av polariserat Calu-3 LCC accelererar en nedgång i monoskikt integritet. Infekterades med RSV-A2 vid ett MOI = 1 dag 0, och polariteten övervakades under 8 veckor efter infektion Polariserade Calu-3-celler. Ett representativt experiment visas. Data presenteras som median motstånd 8 oberoende brunnar per infektion ± SEM per tidpunkt. * P <0,05 mellan mock-och RSV-A2-infekterade kulturer, som bestäms av Students t-test.
- Ta bort eventuella luftbubblor i brunnarna
- Använd Calu-3-celler som har subodlades från fryst lager mindre än 10 gånger
- Låt inte Calu-3-celler för att nå 100% konfluens i monoskikt subkultur
- Kontrollera att celler inte växer på plast väl under insatsen (indikerar att celler kan ha vuxit genom porerna i insatsen)
- Låt 2-3 veckor efter sådd för full resistensutveckling
- Kontrollera sammansättning och porstorlek skär används, ändra om det behövs (rekommenderas polyester insats, 0,3 um porstorlek, inga beläggningar, se material för detaljer)
- Kontrollera kvaliteten av elektroden, slipning försiktigt för att avlägsna ackumulerade proteiner från spetsen, och ersätta om nödvändigt
- Kontrollera medium för bakterietillväxt
- Medge ytterligare tid för polarisering för att utveckla (kan ibland ta upp till fyra veckor)
- Använd Calu-3-celler som har subodlades från fryst lager mindre än 10 gånger
- Låt inte Calu-3-celler för att nå 100% konfluens i monoskikt subkultur
- Konsekvent ersätta medium i Transwell kulturer, omväxlande mellan det tredje och sedan fjärde dagen efter tidigare utfodring
- Endast kultur celler på inlägg som placeras i de yttre raderna av plattor
- Använd en annan massa Transwell inlägg
- Stör inte eller stapla plattorna i inkubatorn
- Orsakar inte vibrationer i biosäkerhet skåp medan Transwell platES är hanteras
- Ta bort eventuella luftbubblor i brunnarna
- Stör inte cellskiktet med pipettspetsar när man byter medium eller utföra Teer avläsningar
- Använd 200 ul medium i den apikala facket, lägre volym kan resultera i instabila Teer avläsningar
- Kontrollera kvaliteten på elektroden, slipning försiktigt för att ta bort ackumulerade proteiner från spetsen, och byt vid behov
Tabell 1. Felsökning problem som kan uppstå vid odling Calu-3 celler i Transwells. Flera faktorer bidrar till full polarisering av Calu-3-celler i flytande täckta kulturer, den mest sannolika av dessa är markerade i tabellen.
Discussion
Vid fastställandet Calu-3 LCC i Transwell skär, kan celler polarisera inte alls, eller kanske inte helt polarisera, som definieras av en TEER ≥ 1000 Ω × cm 2 och ≤ 1% natriumfluorescein färgämne jämvikt mellan de apikala och basolaterala fack. Dessutom kan Calu-3-celler i LCC polarisera fullständigt, men TEER kan vara inkonsekvent mellan mätningarna. Även variationer i Teer mätningar av Calu-3 LCC är normala från dag till dag, är en gång helt polariserade, dramatiska svängningar i TEER förväntas inte förrän kulturen naturligt avtar med åldern, vilket kan vara så lite som fem veckor eller så länge som 12 veckor efter ympning.
Förmågan hos Calu-3 LCC att polarisera beror delvis på hur cellerna upprätthålls och subodlades före användning i Transwell-systemet. Celler som har vuxit mer än 90% sammanflöde som monolager under subodling, som har subodlas mer än 10 gånger från frysta lager, eller som inte har attsv levereras med färskt medium på ett regelbundet schema är mindre benägna att helt polarisera, och varje polarisering kommer sannolikt att sjunka snabbt. Ofullständig eller total avsaknad av polarisering kan också tillskrivas variationer i materialet och porstorlek Transwells används för Calu-3 LCC, och mycket till parti variation i Transwells av liknande sammansättning och porstorlek kan också påverka polarisering. Större porstorlekar kan tillåta Calu-3 för att växa genom Transwell membranet till basolaterala facket, hindrar kulturen från polariserande. En avsaknad av polarisation också kan bero på bakteriell tillväxt, indikeras av grumlade odlingsmedium, vilket leder till efterföljande nedbrytning av de täta förbindelserna mellan Calu-3-celler.
Variabla TEER mätningar av Calu-3 LCC kan orsakas av mekaniska störningar av Calu-3 LCC cellmonoskikt, insatserna, eller plattorna själva. Medium förändringar och mätningar Teer bör utföras utan pipettspetsar eller elektrode leder vidröra cellerna. När de utför dessa operationer, bör man för att undvika att införa luftbubblor i de apikala och basolaterala fack, vilket kommer att störa förmåga voltohmmeter att upptäcka motstånd. Förmågan hos voltohmmeter att detektera resistens i en kultur som är faktiskt polariserad kan också begränsas av proteinbeläggningar på elektroden leder. Detta uppbyggnad kan avlägsnas med mild slipning eller kan korrigeras genom att ersätta elektroden.
När Calu-3 LCC fullständigt polariserar och TEER inte längre ökar, Calu-3 LCC är färdiga för användning som en in vitro-modell för att karakterisera värd lung epithelial cellsvar till luftvägsinfektion. Detta system tillåter bättre karakterisering av riktade svar på patogener jämfört med monoskikt-odlade linjer lung cellinjer traditionellt används för att studera respiratoriska patogener, såsom A549 och HEp-2-celler, med de ytterligare fördelarna med Calu-3 LCC being snabbare att utveckla, mera lätt erhållas, och billigare att generera än primär, polariserad, differentierad NHBE. I likhet med NHBE, polariserade Calu-3 visar tät korsningen bildning, och producera muciner. Men till skillnad från NHBE, inte skilja polariserade Calu-3-celler inte in lager av basala celler och cilierade kolumnära epitelceller, och få polariserade Calu-3 celler utvecklas flimmerhår-liknande projektioner 19. Även om användbara för att undersöka polariserade svar epitelceller i luftvägarna till respiratorisk förolämpning, polariserade Calu-3 LCC är inte en idealisk modell för att undersöka luftvägarna utveckling eller ombyggnad som svar på andningsorganen förolämpning eller skada. Slem produktion av odlade celler in vitro kan påverka cellulär smittsamhet, samt utsläpp av infektiöst virus och virus sprids i en polariserad modell och en direkt jämförelse av slem produktionen mellan polariserat Calu-3 LCC och polariserad, differentierad NHBE har inte rapporterats . A549 och HEp-2-celler enre lättare att kultur än Calu-3-celler, men till skillnad från Calu-3 LCC, bildar de inte polariserade kulturer när de odlas på Transwell skär, och är således inte idealmodeller för att undersöka in vitro svaren på polariserade epitelceller till respiratorisk virusinfektion .
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Elisabeth Blanchard för hennes hjälp. Resultaten och slutsatserna i denna rapport är författarnas egna och representerar inte nödvändigtvis åsikterna hos Centers for Disease Control and Prevention.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Calu-3 | ATCC | HTB-55 | |
| 0.05% Trypsin - 0.02% EDTA | Gibco/Invitrogen | 25300 | |
| Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) | Gibco/Invitrogen | 07-00100DK | |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | SH30070.03 | Heat-inactivate, 56 °C, 30 mins |
| Non-essential amino acids 100X (10 mM) | Gibco/Invitrogen | 11140 | Store at 4 °C in the dark |
| L-glutamine | Gibco/Invitrogen | 25030 | |
| HEPES | Gibco/Invitrogen | 15630 | |
| EMEM-10% FBS (EMEM-10%) | Supplement EMEM with heat-inactivated FBS to 10% serum, sterile-filter | ||
| EMEM-20% FBS + supplements (EMEM-20%+S) | Supplement EMEM to final concentrations: heat-inactivated FBS, 20%; 1X amino acids; 2 mM L-glutamine; 10 mM HEPES; sterile-filter | ||
| 24-well Transwell plates | Corning Costar | 3472 | 3 μm pore size, polyester |
| Trypan blue | Gibco/Invitrogen | 15250 | |
| Ethanol | Sigma | E7023 | Prepare to 70% using sterile dH2O |
| Dulbecco's PBS (D-PBS) | Invitrogen | 14040 | |
| Non-fluorescent buffer | 118 mM NaCl; 4.75 mM KCl; 2.53 mM CaCl2×H2O; 2.44 mM MgSO4; 1.19 mM KH2PO4; 25 mM NaHCO3 in sterile water; sterile-filter | ||
| Sodium fluorescein | Sigma | 6377 | 1 mg/ml in sterile non-fluorescent buffer; sterile-filter, protect from light; store at 4 °C up to 6 months |
| EQUIPMENT | |||
| Voltohmmeter | World Precision Instruments | ||
| STX2 electrode | World Precision Instruments | ||
| ELISA plate reader | Capable of measuring A486 or A490 | ||
References
- Zhu, Y., Chidekel, A., Shaffer, T. H. Cultured human airway epithelial cells (calu-3): a model of human respiratory function, structure, and inflammatory responses. Critical care research and practice. 2010, (2010).
- Mukherjee, M., Pritchard, D. I., Bosquillon, C. Evaluation of air-interfaced Calu-3 cell layers for investigation of inhaled drug interactions with organic cation transporters in vitro. International journal of pharmaceutics. 426, 7-14 (2012).
- Baginski, L., et al. Investigations into the fate of inhaled salmon calcitonin at the respiratory epithelial barrier. Pharmaceutical research. 29, 332-341 (2012).
- Vllasaliu, D., Alexander, C., Garnett, M., Eaton, M., Stolnik, S. Fc-mediated transport of nanoparticles across airway epithelial cell layers. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. , (2011).
- Vinhas, R., et al. Pollen proteases compromise the airway epithelial barrier through degradation of transmembrane adhesion proteins and lung bioactive peptides. Allergy. 66, 1088-1098 (2011).
- Hein, S., Bur, M., Schaefer, U. F., Lehr, C. M. A new Pharmaceutical Aerosol Deposition Device on Cell Cultures (PADDOCC) to evaluate pulmonary drug absorption for metered dose dry powder formulations. European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics : official journal of Arbeitsgemeinschaft fur Pharmazeutische Verfahrenstechnik e. 77, 132-138 (2011).
- Huttunen, S., Toivanen, M., Arkko, S., Ruponen, M., Tikkanen-Kaukanen, C. Inhibition activity of wild berry juice fractions against Streptococcus pneumoniae binding to human bronchial cells. Phytotherapy research: PTR. 25, 122-127 (2011).
- Elm, C., Rohde, M., Vaerman, J. P., Chhatwal, G. S., Hammerschmidt, S. Characterization of the interaction of the pneumococcal surface protein SpsA with the human polymeric immunoglobulin receptor (hpIgR). The Indian journal of medical research. 119, 61-65 (2004).
- Sutherland, T. C., Quattroni, P., Exley, R. M., Tang, C. M. Transcellular passage of Neisseria meningitidis across a polarized respiratory epithelium. Infection and immunity. 78, 3832-3847 (2010).
- Grantham, M. L., et al. Palmitoylation of the influenza A virus M2 protein is not required for virus replication in vitro but contributes to virus virulence. Journal of. 83, 8655-8661 (2009).
- Saedisomeolia, A., Wood, L. G., Garg, M. L., Gibson, P. G., Wark, P. A. Lycopene enrichment of cultured airway epithelial cells decreases the inflammation induced by rhinovirus infection and lipopolysaccharide. The Journal of nutritional biochemistry. 20, 577-585 (2009).
- Yoshikawa, T., Hill, T., Li, K., Peters, C. J., Tseng, C. T. Severe acute respiratory syndrome (SARS) coronavirus-induced lung epithelial cytokines exacerbate SARS pathogenesis by modulating intrinsic functions of monocyte-derived macrophages and dendritic cells. Journal of virology. 83, 3039-3048 (2009).
- Yoshikawa, T., et al. Dynamic innate immune responses of human bronchial epithelial cells to severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus infection. PloS one. 5, e8729 (2010).
- Hsu, A. C., et al. Critical role of constitutive type I interferon response in bronchial epithelial cell to influenza infection. PloS one. 7, e32947 (2012).
- Harcourt, J. L., Caidi, H., Anderson, L. J., Haynes, L. M. Evaluation of the Calu-3 cell line as a model of in vitro respiratory syncytial virus infection. Journal of virological methods. 174, 144-149 (2011).
- Zhang, L., Peeples, M. E., Boucher, R. C., Collins, P. L., Pickles, R. J. Respiratory syncytial virus infection of human airway epithelial cells is polarized, specific to ciliated cells, and without obvious cytopathology. Journal of virology. 76, 5654-5666 (2002).
- Geys, J., et al. In vitro study of the pulmonary translocation of nanoparticles: a preliminary study. Toxicology letters. 160, 218-226 (2006).
- Geys, J., Nemery, B., Hoet, P. H. Optimisation of culture conditions to develop an in vitro pulmonary permeability model. Toxicology in vitro : an international journal published in association with BIBRA. 21, 1215-1219 (2007).
- Grainger, C. I., Greenwell, L. L., Lockley, D. J., Martin, G. P., Forbes, B. Culture of Calu-3 cells at the air interface provides a representative model of the airway epithelial barrier. Pharmaceutical research. 23, 1482-1490 (2006).
