Summary
Ved at kombinere metoder til RNA hele mount
Abstract
Marine bruskfisk værdiansættes dyremodeller for biomedicinske og genomiske studier, da de er de mest primitive hvirveldyr, der har adaptive immunitet og har unikke mekanismer til osmoregulering 1-3. Som de mest primitive levende stålkæber-hvirveldyr med parrede vedhæng, er bruskfisk en evolutionært vigtig model, især for studier i evolution og udvikling. Marine bruskfisk er også blevet brugt til at studere akvatisk toksikologi og stress fysiologi i relation til klimaændringer 4. Således er udvikling og tilpasning af metoder er nødvendige for at lette og udvide brugen af disse primitive hvirveldyr til flere biologiske discipliner. Her vil jeg præsentere en vellykket tilpasning af RNA hele mount in situ hybridisering og histologiske teknikker til at studere genekspression og celle histologi i bruskfisk.
Overvågning genekspression er kendetegnende værktøj af udviklingstoksicitet biologists, og er i vid udstrækning anvendes til at undersøge udviklingsmæssige processer 5. RNA hele mount in situ hybridisering muliggør visualisering og lokalisering af specifikke gen-transkripter i væv i det udviklende embryo. Udtrykket mønster af et gen budskab kan give indblik i, hvad udviklingsprocesser og celle skæbne beslutninger et gen kan styre. Ved at sammenligne ekspressionsmønsteret af et gen på forskellige udviklingstrin, kan opnås indsigt i, hvordan den rolle, et gen ændres under udviklingen.
Medens hele mount in situ 's tilvejebringer et middel til at lokalisere genekspression til væv, histologiske teknikker muliggøre identifikation af differentierede celletyper og væv. Histologiske pletter har mangfoldige funktioner. Generelle pletter benyttes til at fremhæve cellemorfologi, fx hematoxylin og eosin til generel farvning af kerner og cytoplasma, hhv. Andre pletter kan fremhæve bestemt celletyper. For eksempel plette Alcian blå rapporteret i dette papir er et meget anvendt kationisk pletten til at identificere mucosaccharides. Farvning af fordøjelseskanalen med Alcian Blue kan identificere fordelingen af slimceller, der producerer mucosaccharides. Variationer i mucosaccharide bestanddele på korte peptider skelne slimceller efter funktion som fordøjelseskanalen 6. Ved at bruge RNA hele mount in situ 's og histokemiske metoder samtidigt, kan celle skæbne beslutninger knyttet til gen-ekspression.
Selv RNA in situ 's og histokemi er meget brugt af forskere, har deres tilpasning og brug i marine bruskfisk mødt begrænset og varieret succes. Her vil jeg præsentere protokoller udviklet for bruskfisk og bruges på en regelmæssig basis i mit laboratorium. Selv om en yderligere modifikation af RNA in situ 's hybridiseringsmetode kan være nødvendigt at tilpasse sig forskellige arter, de protokoller, der beskrives her provide et stærkt udgangspunkt for forskere, der ønsker at tilpasse anvendelsen af marine bruskfisk til deres videnskabelige undersøgelser.
Protocol
I. RNA Whole Mount in situ hybridisering i Marine bruskfisk
1. Embryo Fiksering og klargøring
- Skate embryoner kan iscenesættes i henhold til Ballard 7. Optimale trin til påvisning af genekspression afhænger af vævet af interesse. Sådan sporer genekspression i skate fordøjelseskanalen, stadier 27-30 er optimale 7.
- Dissekere embryoner i PBS, adskillelse af embryoner fra blommesækken.
- Fix i 30 ml frisk fremstillet 4% paraformaldehyd (PFA) i et 50 ml konisk rør ved 4 ° C under forsigtig vipning. Fix i 24 timer.
- Vask embryoner i PBT, to gange i 15 minutter, roterende ved stuetemperatur. Alle løsning opskrifter til RNA hele mount in situ 's er medtaget (Tabel 1).
- Dehydratisere embryoner ved vask i en methanol serie af 25%, 50% og 75% methanol: PBT rocking ved stuetemperatur. Varigheden af vaskene afhænger af det stadium af embryonerne. For pre-neurulation trinvis embryoner, 5 min for hver vask i methanol serien er tilstrækkelig. For embryoner ældre end stadie 30, kan vaske vare op til 30 min. At afgøre, om fostre er tilstrækkeligt gennemtrængt og akklimatiseret til hver vask, skal du holde røret lodret i hånden. Hvis embryonerne synke til bunden af røret, så er du klar til næste vask. Hvis embryonerne flyder mod toppen af opløsningen, ændre opløsningen og gentage denne særlige dehydratiseringstrin.
- Vaskes to gange i 100% methanol i 10 minutter ryst forsigtigt.
- Når først dehydratiseret til 100% methanol, bør embryoner opbevares ved -20 ° C i mindst 24 timer før man går videre med protokollen. Embryonerne er blevet opbevaret ved -20 ° C og anvendt til RNA hele underlag i op til 1 år.
2. Syntese af RNA-probe
- Generere et lineært fragment af genet, hvis ekspression man ønsker at detektere. Dette kan gøres enten ved PCR-amplifikation eller linearisering af et plasmid med genetaf interesse. At amplificere ved hjælp af PCR ved at vælge primere, hvis binding sites flankerer genet indsætte og bibeholde RNA-polymerase bindingssteder i den amplificerede region. For almindeligt anvendte plasmider, såsom PBS eller pGEM, M15 frem og reverse primere er ideelle. Alternativt linearisere et plasmid ved fordøjelse 15 pi af QIAGEN Miniprep DNA med et enzym, der spalter ved 5'-enden af genet. Gel udvinde og oprense anvendelse af det passende QIAquick kit.
- Reverse transskription af RNA-proben under anvendelse af 8 pi lineært plasmid eller 100 ng af PCR-produkt som template anvendelse af den passende RNA-polymerase (se tabel 2 for transkriptionsreaktion).
- Inkuber revers transcription reaktion i 2 timer ved 37 ° C.
- For at bekræfte reaktion, løber 1 pi af transcription reaktionen på en 1% agarose / TAE-gel. Køre gel ved 100 mVolts indtil farvefronten lige er løbet ind i gelen. Et enkelt fremtrædende bånd skal være synlig. Det lineære DNA template fragment kan være svagt synlig ved en højere molekylærelar vægt.
- Tilsæt 1 pi RNAse-fri DNAse I til transkriptionsreaktion og inkuber ved 37 ° C i 15 minutter.
- At præcipitere, 100 pi TE pH 8, 10 pi 4 M LiCl, 300 pi 100% EtOH og inkuberes tilsættes ved -20 ° C i mindst 60 minutter eller natten over.
- Spin i 10 minutter i et 4 ° C mikrocentrifuge ved 14.000 rpm.
- Vask pellet med 70% EtOH og lufttørre.
- Resuspender RNA-probe i 20 ul dH 2 O. Der tilsættes 80 pi hybridiserings-puffer (hybridiseringsbuffer bør forvarmes til 70 ° C). Sonden kan opbevares i 80% hybridiseringspuffer i flere måneder ved -20 ° C eller længere ved -80 ° C.
3. Embryo Forbehandling og hybridisering
- Fjern embryoner lagret i 100% methanol i -20 ° C. For yngre embryoner Fortsæt med trin (3,2). For senere iscenesatte embryoner (stadie 29/30 <) kan du se en epidermis lag, der har "løftet" ud af kroppen af embryoet. Under mikroskopet, diss omhyggeligtect fra epidermislaget at maksimere probe penetration.
- Placer embryoner i rene glas scintillationsglas. Rehydrere embryoerne i omvendt methanol serien beskrevet ovenfor: (75%, 50%, 25% methanol: PBT) ved vugger hver opløsning for 5-30 minutter hver ved stuetemperatur. Komplet rehydrering med to vaske af PBT i 10 minutter hver, blidt vuggende.
- For at fjerne pigment, blege embryoer med 6% hydrogenperoxid i PBT i 1 time ved stuetemperatur, rocking.
- Fjerne hydrogenperoxid ved vask tre gange i PBT, (rocking ved stuetemperatur, 10 min).
- Behandling af embryoer med proteinase K for at muliggøre indtrængning af sonden under hybridisering. Mængden af proteinase K og varigheden af behandlingen afhænger af det væv der skal undersøges, og alderen af fostret. Mere overfladiske væv og yngre fostre kræver kortere og mindre proteinase K, mens dybere væv og ældre embryoner kræver en højere koncentration og længere behandling time fuldt permeabilisere embryo for probehybridisering. For eksempel at detektere Shh i tarmen endoderm af trin 29 skate embryoner, 30 ug / ml proteinase K / PBT inkuberet i 20 minutter ved stuetemperatur.
- Hurtigt skylle embryoner i PBT at vaske væk proteinase K.
- At deaktivere proteinase K, postfix embryoer med 4% PFA, 0,2% glutaraldehyd i PBT i 20 min, ryst forsigtigt.
- Vaskes to gange i 10 minutter med PBT.
- For præ-hybridisering, tilsættes 2-3 ml forvarmet hybridiseringsopløsning til embryonerne, lige nok til at dække dem. Rokke roligt i et opvarmet vandbad ved 70 ° C i 1 time.
- Til fremstilling hybridiseringsopløsning, forvarmes RNA-probe til 70 ° C i 10 minutter og afkøles på is. Fortynd 15-20 pi RNA-probe til 2 ml frisk forvarmet hybridiseringsopløsning, til opnåelse af en slutkoncentration på 0,5-1,0 mg / ml. Fjern pre-hybe og der tilsættes fortyndet RNA-probe til embryoer. Embryoer skal bare dækket af opløsning, endd mere hybridiseringsopløsning hvis det er nødvendigt. Stramt sikker låg scintillationshætteglas. Hybridiserer ved vugger i et opvarmet vandbad ved 70 ° C natten over.
4. Indlæg Hybridiseringsbetingelser vaske og antistof Hybridiserings
- Fjern hybridiseringsopløsning med probe fra embryoner og anbringes i en frisk scintillationsflaske eller Eppendorf rør. Sonden kan opbevares ved -20 ° C og genanvendes i fremtiden. Til post-hybridiserings-vaske, siddende sted embryoner i en Netwell i en 6-brønds vævskulturplade.
- Vask 3 gange i 30 minutter hver i foropvarmede Solution # 1, rokkende ved 70 ° C.
- Vask 3 gange i 30 minutter hver i foropvarmede Solution # 2, rokkende ved 70 ° C.
- Vask 3 gange i 5 minutter hver i TBST, rokkende ved stuetemperatur.
- Pre-blok med 10% varmeinaktiveret fåreserum i TBST i 1 time, rokkende ved stuetemperatur.
- Overfør embryoner fra Netwell til en frisk glasscintillationshætteglas. Tilføj anti-DIGFab-fragmenter (1:5000) i 1% varmeinaktiveret fåreserum / TBST til embryoner. Rock natten over ved 4 ° C.
5. Indlæg Antibody Hybridisering Vasker
- Fjern antistof og kassér. Placer embryoner tilbage i Netwell for vaske.
- Vask 3 gange i 5 min hver i TBST, vipper ved stuetemperatur
- Vask mindst 6 gange i 1 time hver, rokkende ved stuetemperatur.
- Vask natten over i TBST, vuggende ved 4 ° C. Som post-antistof vaskninger hjælpe skære ned på baggrundsfarvning, maksimering af antallet og varigheden af vask foretrækkes. Embryoer rutinemæssigt vasket i TBST ved 4 ° C, i løbet af weekenden.
6. Påvisning af Probe
- Der fyldes op frisk NTMT opløsning og filtreres steriliseres.
- Kassér TBST vaskeopløsning og sted embryoner i en ren glasscintillationshætteglas. Vask embryoner 3 gange i frisk NTMT i 10 min ved stuetemperatur, rocking.
- Fjern NTMT vask og tilføje reaktionsblandingaf 1 x NBT / 1 x BCIP i NTMT. Da disse reaktanter er lysfølsomme, omfatter scintillationshætteglas i folie og rock ved stuetemperatur.
- Overvåge farvereaktion hvert 15. minut, indtil den ønskede genekspression er klart synlig. Stærke prober kan tage så lidt som 10 min at udvikle. Svage prober kan tage 1-2 timer. Lad ikke reaktionen gå for længe eller baggrundsfarvning vil begynde at dukke op (hele foster begynder at forvandle en kedelig lilla eller brun farve).
- Vask 2 gange i 10 minutter hver i PBT ved stuetemperatur, rocking.
- Postfix embryoner i 4% paraformaldehyd, 0,1% glutaraldehyd i 1 time ved stuetemperatur. Embryoner kan lagre ubestemt tid i fiksativ ved 4 ° C.
- Visualisere embryoner med et dissekerende stereomikroskop. Til frembringelse af en lyseblå baggrund for billeder, sted embryoner i en skål med præ-hærdede 1% agarose / PBS.
7. Repræsentative resultater I. RNA Hel Mount in situ hybridisering i marine bruskfisk
RNA hele mount in situ 's afbilder ekspression af Sonic hedgehog (Shh) og Hoxa13 i skate embryoer er vist i figur 1.. Ekspression af Shh i højere hvirveldyr findes i rygstrengen og gut endoderm og dette ekspressionsmønster er konserveret i skøjten (figur 1a) 8,9. Marine bruskfisk har en unik fremgangsmåde til osmoregulering der bruger den rektale kirtel at secernere salte. Hoxa13 ekspression er høj i udviklingslandene rektal kirtel (figur 1b) 10. Hoxa13 genprodukt rolle i mønsterdannelse den rektale kirtel er stadig ukendt.
II. Paraffin Embedding og Sektionsinddeling bruskfisk Tissue
1. Høst og klargøring af væv
- Dissekere ønsket væv og reparere i 10% formalin i 24-48 timer, vuggende ved stuetemperatur. 4% paraformaldehyd (PFA) kan også anvendes som fikseringsmiddel(Se diskussion).
- Udvaske fiksativ ved vask i PBS, 3 gange i 30 minutter hver. Afhængig af størrelsen af vævet, kan vasketider nedsættes til 10 min eller forøget til 1 time.
- Dehydratisere embryoner ved vask i en ethanolserie på 25%, 50% og 75% ethanol: PBS rocking ved stuetemperatur. Igen vil tiden for hver vask afhænger af størrelsen af vævet. I 0,5 cm3 væv inkuberes hver vask i 15 min. Forøg tid for større stykker. Hvis langvarig opbevaring af væv ønskes, vaskes yderligere to gange i 75% ethanol og opbevares i -20 ° C i op til et år. Ellers fortsæt til næste trin.
- Yderligere dehydrere ved vask 3 gange i 100% ethanol i 15 minutter hver, rocking.
2. Paraffin Indlejring og Sektionsinddeling
- Tydeliggøre væv ved vask 2 gange i xylen i 5 minutter hver i glasscintillationshætteglas med skruelåg låg. Xylen vil gøre vævet skørt, så du skal ikke overstige i alt 10 min for varhes. Vævet skal se gennemskinnelige når du holder den op til et lys. Hvis vævet stadig er meget opak efter de to vaske, gør en yderligere vask i xylen i 5 minutter og derefter fortsætte med protokollen. Kun håndtere xylen inde et stinkskab med handsker.
- Fjern xylen og fyld scintillationshætteglas 2/3 fuld med smeltet paraffin. Inkuber i en 60 ° C ovn i 30 minutter. Når der lægges paraffin i hætteglasset, vil du bemærke den paraffin størkne langs siderne af hætteglasset. Placer hætteglasset i ovnen og lad paraffin at genopløse i et par minutter. Tag hætteglasset ud af ovnen og give opløsningen en hurtig swirl at blande og erstatte i ovnen i resten af inkubation.
- Gentag paraffin inkubationer to gange mere i 30 minutter.
- Inkuber i paraffin to gange en time hver. Ændre paraffin en sidste gang og inkuberes natten over i 60 ° C ovnen.
- Den følgende dag anbringe vævet i et opvarmet paraffin badkammeret og anbringes under vakuum i 2-3 timer. Dette vil lette indtrængning af paraffin i vævet og fjerne eventuelle luftbobler. For nogle typer af tynde væv, kan et vakuum skridt ikke påkrævet, men det er nødvendigt for hele embryoer eller fordøjelseskanalen og andre organer med luminale rum.
- Efter vacuum-lettet infiltration af væv, sted væv i en metalform med smeltet paraffin, og afkøles på en is plade. Efterlad på is eller ved 4 ° C natten over før forsøg på at fjerne væv fra formen. Paraffinblokke af væv kan opbevares på ubestemt tid ved 4 ° C.
- Sted paraffin blok på en mikrotom og skær 8 um snit. Strækninger bør flyde på et vandbad opvarmet til 48 ° C og monteret på glas SuperFrost * Plus slides.
- Dry slides natten over i en 37 ° C ovn.
- Store sektioner ved 4 ° C indtil brug.
III. Alcian Blue / Nuclear Fast Red Stain af bruskfisk Tissue
1. Alcian Blue Stain for Muciner
- Anbring objektglassene med sektioner vender opad på et dias varmere. Smelte i 45 minutter.
- Place glider ind i en diasholderen. Alle deraf følgende opløsninger er indeholdt i kar inde i et stinkskab. Objektglas vaskes ved at overføre dem fra et badekar med en opløsning til en anden. Sørg for, at løsningen niveauer i karrene dækker de dias, væv på dias er helt neddykket. Opløs paraffin ved at vaske objektglassene 2 gange i xylen i 5 minutter hver.
- Skylning af objektglas to gange med 100% ethanol i 1 minut hver.
- Rehydrere objektglassene i en ethanolserie (75%, 50%, 25% ethanol) vask i hver opløsning i 1 min. Vask i dH2O i 1 min.
- Plet i Alcian blå, pH 2,5 i 15 minutter.
- Udvikle pletten ved vask i rindende vand i 3 minutter. Dyp en gang i dH 2 O.
- Kontrastfarve i Nuclear Fast Red kontrastfarve løsning i 10 min.
- Vask med rindende vand i 3 minutter og dyppes i dH2O én gang.
- Dehydrerededrate i en ethanolserie (25%, 50%, 75%, 100%, 100%) i 20 dips hver eller 1 min hver. Vask 2 gange i xylen i 5 minutter hver. Montere med DPX monteringsmedium og dækglas. Tillad monteringsmedium tørre og hærde i 48 timer i stinkskabet før manipulere objektglas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Eksempler på Alcian Blue farvning i forskellige regioner af L. erinacea fordøjelseskanalen er vist i figur 2. Acid mucin indeholdende globlet celler er klart synlige ved Alcian Blue farvning i hele fordøjelseskanalen. Fordelingen af sure muciner forskellig i de forskellige regioner i fordøjelseskanalen, hvilket afspejler forskelle i funktion. Sure muciner er tyndt produceres i spiral tarmen og cloaca, medens en høj koncentration af sure muciner påvises i den distale tarmen (sammenlign figur 2a og 2c med 2b).
| PBT | 1 x PBS |
| 0,1% Tween-20 | |
| Filter-steriliseres i Nalgene-typen vævskultur filterenheder. | |
| 20 x SSC, pH 4,5 </ Td> | 3 M NaCl |
| 0,3 M Na-citrat | |
| Indstil pH med citronsyre. | |
| Hybridiseringsopløsning | 50% formamid |
| 1,3 x SSC, pH 4,5 | |
| 5 mM EDTA, pH 8 | |
| 50 mg / ml tRNA | |
| 0,2% Tween-20 | |
| 0,5% CHAPS | |
| 100 mg / ml heparin | |
| Alikvot og opbevares ved -20 ° C i op til et år. | |
| Proteinase K | 10 mg / ml stamopløsning |
| 20 pi alikvoter i 0,5 gl Eppendorf-lignende rør og opbevares ved -20 ° C. | |
| Løsning # 1 | 50% formamid |
| 1,3 x SSC, pH 4,5 | |
| 0,2% Tween-20 | |
| Opbevar ved -20 ° C | |
| Løsning # 2 | 50% formamid |
| 1 x SSC, pH 4,5 | |
| 0,2% Tween-20 | |
| Opbevar ved -20 ° C | |
| Fåreserum | Inaktivering ved opvarmning til 55 ° C i 1 time, og opbevares i alikvoter ved -20 ° C. |
| 10 x TBS | 80 g NaCl |
| 2 g KCI | |
| 250 ml, 1 M Tris-HCI, pH 7,5 | |
| Tilsæt vand til 1 L | |
| 1 x TBST | 1 x TBS |
| 0,1% Tween-20 | |
| NTMT | 100 mM NaCI |
| 100 mM Tris-HCI, pH 9,5 | |
| </ Td> | 50 mM MgCl2 |
| 0,1% Tween-20 | |
| Gør cirka 100 ml frisk før du bruger og filter. | |
| 200 x NBT stock | 50 mg / ml NBT i 70% dimethylformamid |
| Opbevares i -20 ° C i portioner på 1 ml. | |
| 200 x BCIP stock | 25 mg / ml BCIP i vand |
| Opbevares i -20 ° C i portioner på 1 ml. |
Tabel 1. RNA hele mount in situ opløsninger.
| Lineariseret plasmid | 8 pi |
| 10 x transcription buffer | 4 pi |
| DIG-UTP nukleotid-blanding | 2 ul |
| RNAse inhibitor | 0,5 gl |
| RNApolymerase (SP6, T3 eller T7) | 1 pi |
| RNAse-fri sterilt H 2 0 | 4,5 gl |
| Totalvolumen | 20 pi |
Tabel 2. Transkriptionsreaktion at generere RNA-probe.
Fig. 1. Shh og Hoxa13 ekspression i Leucoraja erinacea embryoer er visualiseret af RNA hele mount in situ hybridisering. (A) Shh ekspression detekteres i et trin 29 skate embryo. (A ') Højere forstørrelse af (a) viser Shh ekspression i notochord (pilespidser) og gut endoderm (pile). (b) Hoxa13 expression er lokaliseret til rektal kirtel (pil) af et trin 29 skate embryo (b ') dissekeret fordøjelseskanalen fra embryoet i (b) viser specificitet Hoxa13 transkriptet udtryk til rektal kirtel e, endoderm.. n, notochord . rg, rektal kirtel Klik her for at se større figur .
Figur 2. Fordeling af sure mucin-producerende slimceller i skøjten fordøjelseskanalen. (A, c) Lavt antal sure mucin-producerende slimceller registreres af Alcian Blue farvning i spiral tarmen og cloaca, henholdsvis (pile). (B)Den distale tarm indeholder en højere tæthed af sure mucin slimceller (pile). I alle paneler er kerner tydeligt af den nukleare hurtige røde plet. Klik her for at se større figur .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De præsenterede protokoller er klassiske metoder til overvågning af genekspression og identifikation af differentierede celletyper, og er indrettet til brug i marine bruskfisk. Yderligere modifikationer af disse protokoller kan det være nødvendigt at tilpasse sig forskellige selachier.
Den mest almindelige bekymring RNA hele mount in situ s er risikoen for RNase kontaminering og dermed nedbrydning af RNA-proben og endogene meddelelser. To aspekter skal tages i betragtning: syntesen af riboprobe og dens hybridisering til embryonale beskeder, og generelle teknikker til at håndtere RNA. I almindelighed kan forurening med ribonucleaser undgås ved hjælp af plastvarer fra uåbnede og hidtil ubrugt glas. Hvis den nye glas er tilgængelig, behandle alle glasvarer med RNase-AWAY (VWR # 17.810-491). Vaskninger udføres ved forsigtigt at hælde opløsninger gennem en perforeret ske og tilsætning af frisk opløsning til hætteglasset.Alternativt kan meget små embryoer eller organer / væv anbringes i en Netwell som passer ind i en 6-brønds vævsdyrkningsskål. Vævet kan flyttes fra den ene opløsning til den anden simpelthen ved at løfte Netwell fra én brønd til den næste. Dette medvirker til at forhindre tab af væv ved at hælde, og bevarer også arkitekturen af vævet. Yderligere forslag til håndtering af RNA og forhindre RNase forurening kan findes i Molecular Cloning, A Laboratory Manual, og på flere farmaceutiske hjemmesider, herunder Roche ( http://www.roche-applied-science.com/labfaqs/p2_1.htm ) 11 .
Generering af RNA-proben og forbehandling og hybridisering af embryoer er de mest sårbare trin til forurening med ribonucleaser. Antisense RNA-prober, der supplerer nativt mRNA-transkript syntetiseres ved in vitro revers transkription i presence af digoxigenin-UTP. Kort fortalt er cDNA-plasmider lineariseret med et unikt restriktionsenzym, hvis site er placeret i 5'-enden af genet. Dette gør det muligt for RNA-polymerasen til at falde af ved enden af genet. Vælge en RNA-polymerase ved at identificere RNA-polymerasepromotor findes i plasmidet, umiddelbart 3 'til stopkodonen. Mens T3-og T7 RNA-polymeraser ofte anvendes til pBluescript, SP6 er valget for gener subklonet ind i retningsbestemte pGEM plasmider. Foruden RNase-inhibitor, er DEPC-behandlet vand, der anvendes i transkriptionsreaktion og rensning af sonden. Hybridiseringsopløsning og trin med PBT i forbehandlingen af embryoner, bør alle udføres med DEPC vand. Til DEPC behandle vand, 1 ml DEPC tilsættes til 1 liter vand i en stor kolbe og bland godt. Efterlad natten over i et stinkskab og autoklaver den næste dag. Opløsninger, såsom 10 x PBS og SSC kan også fremstilles med DEPC-behandlet vand. Efter hybridisering med det riboprobe, således at anvendelse af RNase-friløsninger og lignende forholdsregler er ikke længere nødvendige.
Yderligere variabler værd at overveje, er koncentrationen og længden af proteinase K-behandling, som kan påvirke indtrængningen af sonden. En omhyggelig titrering af proteinase K bestanden anbefales at optimere behandlingen for forskellige fosterstadiet. Protokollen er beskrevet her er blevet rutinemæssigt og held anvendes med embryoner i trin 20 til 31 i henhold til Ballard 7. For fostre, der er meget unge eller væv, der er særlig "sticky", kan detergentet Tween-20, erstattes med Triton-X. Desuden kan gen-specifikke modifikationer af protokollen være nødvendig afhængigt af den overflod af transkriptet. For at reducere baggrunden, er 10% dimethylformamid rutinemæssigt blevet tilsat til udvikling løsning (NTMT) af flere grupper 12.
I modsætning til den følsomme karakter af RNA in situ 's, er glæden ved histologi atden er hurtig og temmelig idiotsikker! Enhver variation i farvningen skyldes sandsynligvis utilstrækkelig fiksering. At sikre, at vævet er helt fastgjort, anbefales det, at meget store væv (såsom fordøjelseskanalen af et voksent dyr) udskæres i mindre stykker og frisk fiksativ opløsning erstattes hver 10 timer over en 48 timers periode. Det kan være nødvendigt at optimere betingelserne for fiksering, kan både under og over-fikserede væv resultere i dårlig sektionering eller ujævn farvning. Derudover arbejder forskellige histokemiske pletter optimalt med forskellige fikseringsmidler. Således er det værd at modificere fiksativet ifølge den histokemisk plet anvendte 13. 4% paraformaldehyd anbefales ved fastsættelsen bløddele organer eller unge embryoner. For ældre embryoner eller hele dyr, 10% formalin foretrækkes. Når væv er paraffin indlejret og snit, kan det anvendes til flere formål, herunder RNA in situ 's. Dette giver mulighed for løsning af genekspression på det cellulære level. Alternativt kan sektionerne farves med forskellige histokemiske pletter at identificere differentierede celletyper.
Den Alcian blå og nukleare hurtigt rødfarvning er lykkedes udført i skate (Leucoraja erinacea), pighaj (Squalas acanthias), slimål (Myxine glutinosa) og flodlampret (Petromyzon marinus), (upublicerede resultater) 10,14. Ud over den Alcian Blue pH 2,5 plet beskrevet her, ændring af pH af Alcian Blue opløsning kan skelne forskellige mucosaccharides (dvs. sialo-versus sulfomucins) 13. Forskellige mucosaccharide bestanddele kan skelne slimceller efter funktion og lokaliseret i fordøjelseskanalen 15,16. Alcian Blue farvning i fordøjelseskanalen er blevet anvendt til at diagnosticere sygdomme som Barretts øsofagus og øge farvning af pankreatiske beta-celler granulat 17,18.
Sammenfattendemary, histokemi og RNA hele mount in situ 's, når de anvendes sammen kan føre til en bedre forståelse af sammenhængen mellem, hvor et gen udtrykkes under udvikling og den deraf følgende differentieret celletype. Ekspression af posterior Hox-gener er blevet forbundet med specifikation af sure mucin slimceller i udviklingen fordøjelseskanalen 10,19. Here I et eksempel på ekspressionen af Shh og et Hox-gen sammen med nærvær af syre mucin-producerende slimceller i L. erinacea fordøjelseskanalen. Disse teknikker kan i vid udstrækning anvendes til forskellige arter af bruskfisk, forskellige udviklingsmæssige mønster gener og forskellige histologiske pletter. Den fortsatte anvendelse og tilpasning af teknikker til marine bruskfisk er vigtigt at holde trit med den brede anvendelse af disse dyr for biomedicinsk forskning modeller i fysiologi, endokrinologi, toksikologi og genomik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Jeg har intet at afsløre.
Acknowledgments
Jeg vil gerne takke de mange studerende, der har arbejdet i mit laboratorium og bidrog til udviklingen af disse protokoller. NAT har modtaget støtte fra Skidmore-Union Network, et projekt etableret med en NSF forskud tilskud.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 x transcription buffer | Roche | 11-465-384-001 | |
| DIG-RNA labeling mix | Roche | 11-277-073-910 | |
| RNAse inhibitor | Roche | 03-335-399-001 | |
| RNA polymerase - SP6 | Roche | 10-810-274-001 | |
| DNAseI, RNAse-free | Roche | 10-776-785-001 | |
| Yeast RNA | Invitrogen | 15401-029 | |
| CHAPS | EMD-Millipore | 220201 | |
| heparin | Sigma-Aldrich | H4784 | |
| DEPC (diethyl pyrocarbonate) | Research Organics | 2106D | |
| Moria Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | |
| Netwell inserts | Electron Microscopy Sciences | 64713-00 | Netwells for use in 6-well tissue culture dishes |
| 6-well tissue culture plate | Corning | 3516 | |
| Glass scintillation vials with screw-cap lids | Weaton Science Products | 986540 | |
| formamide | Fisher | BP227500 | |
| Proteinase K | Invitrogen | 59895 (AM2542) | |
| NBT | 11585029001 | ||
| BCIP | Roche | 11585002001 | |
| Hydrogen peroxide, 30% | EMD | HX0635-1 | |
| Sheep serum | VWR | 101301-478 | |
| glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| tRNA | Roche | 10-109-541-001 | |
| Anti-DIG Fab Fragments | Roche | 1137-6623 | |
| Table 3. Reagents and equipment for RNA whole mount in situ's. | |||
| 1% Alcian Blue 8GS, pH 2.5 | Electron Microscopy Sciences | 26323-01 | |
| Nuclear Fast Red | Electron Microscopy Sciences | 26078-05 | |
| DPX Mountant | Electron Microscopy Sciences | 13510 | |
| Paraffin (Paraplast X-tra) | McCormick Scientific | 39503002 | |
| 10% Formalin, NBF | VWR | 95042-908 | |
| Glass scintillation vials with screw-cap lids | Weaton Science Products | 986540 | |
| Stainless steal base molds | Tissue-Tek | 4161-4165 | Multiple sizes available. |
| Cassettes | Tissue-Tek | 4170 | |
| Slide warmer | Fisher-Scientific | 12-594Q | |
| Tissue Embedder | Leica Microsystems | EG1160 | |
| Microtome, rotary | Leica Microsystems | RM2235 | |
| Tissue-Tek Slide Staining Set | Electron Microscopy Sciences | 62540-01 | |
| Tissue-Tek 24-Slide Holder | Electron Microscopy Sciences | 62543-06 | |
| Superfrost*Plus slides | Fisherbrand | 12-550-17 | |
| Table 4. Reagents and equipment for Alcian Blue stain. | |||
References
- Forester, R., Goldstein, L. Intracellular osmoregulatory role of amino acids and urea in marine elasmobranchs. Am. J. Physiol. 230, 925-931 (1976).
- Shuttleworth, T. Physiology of elasmobranch fishes. Shuttleworth, R. , Springer-Verlag. 171-194 (1988).
- Yancey, P. H., Clark, M. E., Hand, S. C., Bowlus, R. D., Somero, G. N. Living with water stress: evolution of osmolyte systems. Science. 217, 1214-1222 (1982).
- Ballatori, N., Villalobos, A. Defining the molecular and cellular basis of toxicity using comparative models. Toxicl. Appl. Pharmacol. 183, 207-220 (2002).
- Nieto, M. A., Patel, K., Wilkinson, D. G. In situ hybridization analysis of chick embryos in whole mount and tissue sections. Methods Cell Biol. 51, 219-235 (1996).
- Jass, J. R., Walsh, M. D. Altered mucin expression in the gastrointestinal tract: a review. J Cell Mol Med. 5, 327-351 (2001).
- Ballard, W. W., Mellinger, J., Lechenault, H. A series of normal stages for development of Scyliorhinus canicula, the lesser spotted dogfish (Chondrichthyes; Scyliorhinidae). J. Exp. Zool. 267, 318-336 (1993).
- Echelard, Y., et al. Sonic hedgehog, a member of a family of putative signaling molecules, is implicated in the regulation of CNS polarity. Cell. 75, 1417-1430 (1993).
- Riddle, R. D., Johnson, R. L., Laufer, E., Tabin, C. Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA. Cell. 75, 1401-1416 (1993).
- Theodosiou, N. A., Hall, D. A., Jowdry, A. L. Comparison of acid mucin goblet cell distribution and Hox13 expression patterns in the developing vertebrate digestive tract. J. Exp. Zool. B. Mol. Dev. Evol. 308, 442-453 (2007).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Ch. 7. Molecular Cloning; A Laboratory Manual. 1, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 7.82 (2001).
- Zhang, G., Miyamoto, M. M., Cohn, M. J. Lamprey type II collagen and Sox9 reveal an ancient origin of the vertebrate collagenous skeleton. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3180-3185 (2006).
- Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. Theory and practice of histotechnology. , 2, Battelle Press. (1980).
- Theodosiou, N. A., Simeone, A. Evidence of a rudimentary colon in the elasmobranch, Leucoraja erinacea. Dev. Genes Evol. 222, 237-243 (2012).
- Filipe, M. I. Mucins in the human gastrointestinal epithelium: a review. Invest. Cell Pathol. 2, 195-216 (1979).
- Corfield, A. P., Wagner, S. A., Clamp, J. R., Kriaris, M. S., Hoskins, L. C. Mucin degradation in the human colon: production of sialidase, sialate O-acetylesterase, N-acetylneuraminate lyase, arylesterase, and glycosulfatase activities by strains of fecal bacteria. Infect. Immun. 60, 3971-3978 (1992).
- Reid, B. J., et al. Flow-cytometric and histological progression to malignancy in Barrett's esophagus: prospective endoscopic surveillance of a cohort. Gastroenterology. 102, 1212-1219 (1992).
- Mowry, R. Selective staining of pancreatic beta-cell granules. Evolution and present status. Arch. Pathol. Lab Med. 107, 464-468 (1983).
- Roberts, D. J., Smith, D. M., Goff, D. J., Tabin, C. J. Epithelial-mesenchymal signaling during the regionalization of the chick gut. Development. 125, 2791-2801 (1998).
