Summary
על ידי שילוב של כל שיטות להר רנ"א
Abstract
elasmobranchs הימי מוערכים מודלים של בעלי חיים למחקרים ביו וגנומית כפי שהם החוליות הפרימיטיביות ביותר שיש חסינות אדפטיבית ויש מנגנונים ייחודיים לויסות לחץ האוסמוטי 1-3. כאמן חוליות לסת החיים הפרימיטיביים ביותר עם ספיחים לזווג, elasmobranchs הוא מודל אבולוציונית חשוב, במיוחד ללימודים באבולוציה ובהתפתחות. elasmobranchs הימי יש גם שמש ללמוד טוקסיקולוגיה הימית ופיזיולוגיה של לחץ במערכת יחסים עד 4 שינויי האקלים. לפיכך, פיתוח וההתאמה של מתודולוגיות נדרשים כדי להקל ולהרחיב את השימוש בחוליות הפרימיטיביות האלה לתחומים ביולוגיים רבים. כאן אני מציג את ההסתגלות המוצלחת של כל הר רנ"א כלאה באתר וטכניקות היסטולוגית ללמוד ביטוי גנים והיסטולוגיה תא בelasmobranchs.
ניטור ביטוי גנים הוא כלי היכר של Biol התפתחותיתogists, ונמצא בשימוש נרחב כדי לחקור תהליכים התפתחותיים 5. כל הר רנ"א כלאה באתר מאפשר להדמיה והלוקליזציה של תעתיקי גנים ספציפיים ברקמות של העובר המתפתח. דפוס הביטוי של המסר של גן יכול לספק תובנה לגבי מה תהליכים התפתחותיים והחלטות גורל תא גן יכולים לשלוט. על ידי השוואת דפוס הביטוי של גן בשלבי התפתחות שונים, תובנה ניתן להשיג בכמה תפקידים של שינויים גנטיים במהלך התפתחות.
בעוד כל ההר באתר של מספק אמצעים לאיתור ביטוי גנים ברקמות, טכניקות היסטולוגית תאפשרנה זיהוי של סוגי תאים מובחנים ורקמות. כתמי היסטולוגית יש פונקציות מגוונות. כתמים כלליים משמשים כדי להדגיש מורפולוגיה של תאים, למשל hematoxylin וeosin לצביעה כללית של גרעינים וציטופלסמה, בהתאמה. כתמים אחרים יכולים לסמן תאים ספציפייםסוגים. לדוגמה, alcian כתם הכחול דיווח במאמר זה הוא בשימוש נרחב כתם קטיוני לזהות mucosaccharides. הכתמה של מערכת העיכול עם alcian כחול יכולה לזהות את חלוקת תאי גביע המייצרים mucosaccharides. שינויים במרכיבי mucosaccharide על פפטידים קצרים להבחין תאי גביע בתפקידו במסגרת מערכת העיכול 6. באמצעות כל הר RNA בשל אתרו וhistochemical שיטות בו זמנית, החלטות גורל תא יכולות להיות מקושרות לביטוי גנים ספציפיים.
אמנם RNA בים וhistochemistry "אתר נמצאים בשימוש נרחב על ידי חוקרים, ההסתגלות והשימוש בם בelasmobranchs הימי נפגשו הצלחה מוגבלת ומגוונת. כאן אני מציג את הפרוטוקולים שפותח עבור elasmobranchs והשתמשו על בסיס קבוע במעבדה שלי. למרות שינויים נוספים של RNA בשיטת הכלאה של אתר עשויים להיות נחוצים כדי להסתגל למינים שונים, הפרוטוקולים מתוארים כאן עמrovide נקודת התחלה חזקה עבור חוקרים המבקשים להתאים את השימוש בelasmobranchs הימי לשאלות המדעיות שלהם.
Protocol
הר י רנ"א כל כלאה באתר בElasmobranchs הימי
1. קיבוע עובר והכנה
- עוברי סקייט יכולים להיות מבוימים פי 7 באלארד. שלבים אופטימליים לזיהוי של ביטוי גנים תלויים ברקמות של עניין. כדי לעקוב אחר התבטאות גנים במערכת העיכול להחליק, שלבים 27-30 הם אופטימליים 7.
- לנתח עוברים לתוך PBS, מפריד את העוברים מצק החלמון.
- תקן ב30 מ"ל של 4% paraformaldehyde טרי (PFA) בצינור חרוטים 50 מ"ל ב 4 ° C עם נדנדה עדינה. תקן עבור 24 שעות.
- שטוף את העוברים בPBT, פעמים למשך 15 דקות, מסתובבות בטמפרטורת חדר. כל מתכוני פתרון לכל הר רנ"א באתר של כלולים (טבלה 1).
- מייבש עוברים על ידי שטיפה בסדרת מתנול של 25%, 50% ו 75% מתנול: PBT נדנדה בטמפרטורת חדר. משך הכביסות שתלויות בשלב של העוברים. קדם-neurulation מבוים עוברים, 5 דקות מכל שטיפה בסדרת מתנול מספיקות. לעוברים מעל גיל 30 במה, מתרחץ יכול להימשך עד 30 דקות. כדי לקבוע אם עוברים הם חדרו מספיק והתאקלמו לכל שטיפה, החזק את הצינור זקוף ביד שלך. אם העוברים לשקוע לתחתית של התחתית, אז אתה מוכן לכביסה הבאה. אם העוברים לצוף לראש הפתרון, לשנות את הפתרון ולחזור על זה צעד התייבשות מסוים.
- לשטוף פעמים במתנול 100% למשך 10 דקות בעדינות נדנדה.
- לאחר ההתייבשות למתנול 100%, עוברים צריכים להיות מאוחסנים ב -20 ° C לפחות 24 שעות לפני שימשיך בפרוטוקול. עוברים כבר מאוחסנים בהצלחה ב -20 ° C ומשמשים לmounts השלם RNA עד לשנת 1.
2. סינתזה של RNA Probe
- צור בר יניארית של ביטוי הגנים שברצונך לאתר. ניתן לעשות זאת גם על ידי הגברת PCR או linearizing פלסמיד עם הגן שלךשל עניין. כדי להגביר באמצעות PCR, בחר פריימרים שאתרי אגף מחייבים את הגן להוסיף ולשמור על אתרי קישור RNA פולימראז באזור המוגבר. לפלסמידים נפוצים כגון PBS או pGEM, M15 קדימה ופריימרים הפוכים הם אידיאליים. לחלופין, linearize פלסמיד ידי לעכל 15 μl של DNA miniprep Qiagen עם אנזים שחותך בקצה 5 'של הגן. ג'ל לחלץ ולטהר את השימוש בערכת QIAquick המתאימה.
- הפוך לתמלל את החללית באמצעות רנ"א 8 μl של ng פלסמיד או 100 ליניארית של מוצר PCR כתבנית באמצעות RNA פולימראז המתאים (ראה טבלה 2 לתגובת שעתוק).
- דגירת תגובה הפוכה לשעתוק 2 שעות ב 37 ° C.
- כדי לאשר את התגובה, הפעל μl 1 לתגובת השעתוק על 1% agarose ג'ל / TAE. הפעל ג'ל ב 100 mVolts עד הצבע יש רק נתקל בג'ל. להקה בולטת יחידה צריכה להיות גלויה. בר תבנית ה-DNA יכול להיות ליניארי קלוש גלוי בmolecu גבוהlar משקל.
- הוסף μl 1 מתוך RNAse ללא DNAse לתגובת השעתוק ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
- למשקע, להוסיף 100 TE pH μl 8, 10 μl ז 4 LiCl, μl% EtOH 300 100 ו דגירה ב -20 ° C במשך לפחות 60 דקות או הלילה.
- ספין למשך 10 דקות ב4 מעלות צלזיוס בmicrofuge 14000 סל"ד.
- שטוף את הכדור עם 70% EtOH ואוויר יבש.
- Resuspend רנ"א חללית ב20 μl של DH 2 O. הוסף 80 μl של חיץ הכלאה (חיץ הכלאה יש מראש חמם-עד 70 ° C). הבדיקה יכולה להיות מאוחסנת ב80% חיץ הכלאה במשך כמה חודשים ב -20 ° C או יותר ב-80 ° C.
3. עובר טרום טיפול והכלאה
- הסר עוברים מאוחסנים במתנול 100% מ-20 ° C. לעוברים צעירים להמשיך בצעדים (3.2). מאוחר יותר ביים עוברים (שלב 29/30 <) ייתכן שתראה שכבת האפידרמיס ש'הרים 'מעל גופו של העובר. מתחת למיקרוסקופ, להרגיז זהירותECT את שכבת האפידרמיס על מנת למקסם את חדירת חללית.
- עוברי מקום בבקבוקוני scintillation זכוכית נקיות. Rehydrate את העוברים בסדרת מתנול ההפוכה לתאר לעיל: (75%, 50%, 25% מתנול: PBT) על ידי מתנדנד בעדינות כל פתרון עבור 5-30 דקות כל בטמפרטורת חדר. התייבשות מוחלטת עם שתי כביסות של PBT עבור 10 דקות כל אחת, מתנדנד קל.
- כדי להסיר כל פיגמנט, עוברי אקונומיקה עם 6% מי חמצן בPBT לשעת 1 בטמפרטורת חדר, מתנדנד.
- הסר מי חמצן על ידי שטיפת שלוש פעמים בPBT, (נדנדה בטמפרטורת חדר, 10 דקות כל אחד).
- פנק את העוברים בעלי proteinase K כדי לאפשר חדיר של חללית במהלך הכלאה. כמות proteinase K ואת משך הזמן של הטיפול תלוי ברקמה שברצונך לבדוק וגיל העובר. רקמה שטחית יותר ועוברים צעירים ידרשו K קצר יותר ופחות proteinase, בעוד רקמות עמוקות יותר ועוברים מבוגרים דורשות ריכוז גבוה ועוד טיפול timדואר לpermeabilize מלוא העובר להכלאת חללית. לדוגמה, כדי לזהות ששישה באנדודרם המעיים של 29 עוברים להחליק במה, 30 מיקרוגרם / מ"ל של proteinase K / PBT הוא מודגרות למשך 20 דקות בטמפרטורת חדר.
- מהר לשטוף עוברים בPBT כדי לשטוף proteinase ק
- לביטול proteinase K, עוברי Postfix עם PFA, glutaraldehyde 0.2% בPBT במשך 20 דקות, 4% מתנדנדים בעדינות.
- שטוף פעמים למשך 10 דקות עם PBT.
- עבור מראש הכלאה, להוסיף 2-3 מ"ל של פתרון ההכלאה שחומם מראש לעוברים, מספיק כדי לכסות אותם. רוק בעדינות באמבט מים מחומם על 70 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
- כדי להכין תמיסת הכלאה, מחמם רנ"א חללית עד 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ומצננים על קרח. דלל μl 15-20 בדיקה של RNA עד 2 מ"ל של פתרון הכלאה חומם מראש טרי, כדי להשיג ריכוז סופי של 0.5-1.0 ק"ג / מ"ל. הסר מראש hybe ולהוסיף בדיקת רנ"א מדוללת לעוברים. עוברים צריכים להיות מכוסים על ידי פתרון פשוט,פתרון dd הכלאה יותר במידת צורך. מכסה הדוק ומאובטח של בקבוקון נצנץ. להכליא ידי מתנדנד בעדינות באמבט מים מחומם 70 מעלות צלזיוס בלילה.
4. הודעה שוטפת הכלאה והכלאת נוגדן
- הסר פתרון הכלאה עם חללית מעוברים ומקום בבקבוקון נצנץ טרי או צינור אפנדורף. הבדיקה יכולה להיות מאוחסנת ב -20 ° C ולשימוש חוזר בעתיד. לשטיפות לאחר הכלאה, עוברי מקום בNetwell יושבים בצלחת תרבית רקמת 6-כן.
- לשטוף 3 פעמים למשך 30 דקות כל אחד בפתרון מראש התחמם # 1, מתנדנד על 70 ° C.
- לשטוף 3 פעמים למשך 30 דקות כל אחד בפתרון מראש התחמם # 2, מתנדנד על 70 ° C.
- לשטוף 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחד בTBST, מתנועעות בטמפרטורת חדר.
- טרום בלוק עם סרום 10% חום מומת כבשים בTBST לשעה 1, מתנדנד בטמפרטורת חדר.
- העברת עוברים מNetwell לבקבוקון זכוכית נצנץ טרי. הוסף אנטי DIGרסיסים (Fab 1:5,000) בסרום 1% חום מומת כבשים / TBST לעוברים. רוק הלילה ב 4 ° C.
5. הכלאת נוגדן הודעת שוטף
- הסר נוגדן וזורקים. עוברים למקם אותו בחזרה לתוך Netwell לכביסות.
- לשטוף 3 פעמים למשך 5 דקות כל אחד בTBST, מתנדנד בטמפרטורת חדר
- שטוף לפחות 6 פעמים לשעה 1 בכל, מתנדנד בטמפרטורת חדר.
- רחץ לילה בTBST, נדנדה ב 4 ° C. כלעזור לצמצם את כביסות שהודעת הנוגדנים על רקע מכתים, למקסם את המספר ומשך הזמן של שוטף עדיף. עוברים נשטפים באופן שגרתי בTBST ב 4 ° C, בסוף השבוע.
6. זיהוי של חללית
- המצא פתרון NTMT טרי ולסנן לעקר.
- השלך פתרון TBST לשטוף ועוברי מקום בבקבוקון נצנץ מזכוכית נקיה. שטוף את העוברים 3 פעמים בNTMT הטרי למשך 10 דקות כל אחד בטמפרטורת חדר, נדנדה.
- הסר NTMT לשטוף ולהוסיף תערובת תגובהשל x NBT 1 / x BCIP 1 בNTMT. כמגיבים האלה הם רגישים לאור, לכסות בנייר הכסף בקבוקון נצנץ ורוק בטמפרטורת חדר.
- לפקח תגובת צבע כל 15 דקות עד שביטוי הגן רצוי נראה בבירור. בדיקות חזקות עלולות לקחת קצת כמו 10 דקות כדי להתפתח. בדיקות חלשות עלולות לקחת 1-2 שעות. אל תתנה לתגובה לכי על מדי מכתים רקע ארוך או יתחיל להופיע (כל העובר מתחיל להפוך צבע סגול או חום עמום).
- לשטוף 2 פעמים למשך 10 דקות כל אחד בPBT בטמפרטורת חדר, נדנדה.
- עוברי Postfix בparaformaldehyde 4%, glutaraldehyde 0.1% לשעה 1 בטמפרטורת חדר. עוברים יכולים להיות זמן בלתי מוגבל בחנות מקבעים ב 4 ° C.
- דמיינו עוברים עם stereomicroscope לנתח. כדי לייצר רקע כחול בהיר לתמונות, עוברי מקום בצלחת עם 1% מראש מוקשים agarose / PBS.
7. נציג תוצאות להר א רנ"א כל כלאה באתר בelasmobranchs הימי
כל הר RNA בשל אתר ביטוי של סוניק קיפוד מתאר (שש) וHoxa13 בעוברים להחליק מוצגים באיור 1. ביטוי של שישה בחוליות גבוהות יותר נמצא באנדודרם notochord ומעיים ודפוס ביטוי זה ניתן לחסוך בסקייט (האיור 1 א) 8,9. elasmobranchs הימי יש שיטה ייחודית לויסות לחץ האוסמוטי המשתמשת בבלוטה רקטלית למלחים מפרישים. Hoxa13 הביטוי הוא גבוה בבלוטה רקטלית הפיתוח (האיור 1b) 10. תפקיד מוצר הגן Hoxa13 בדפוסי הבלוטה רקטלית נותרת עלומה.
השני. פרפין והטבעה של קטגוריות קיים רקמות Elasmobranch
1. מסיק והכנה של רקמות
- לנתח ולתקן רקמות רצויות ב10% פורמלין ל24-48 שעות, מתנדנד בטמפרטורת חדר. paraformaldehyde 4% (PFA) יכול לשמש גם כחומר מייצב(ראה דיון).
- לשטוף את מקבע על ידי השטיפה בPBS, 3 פעמים למשך 30 דקות כל אחד. בהתאם לגודל של הרקמה, זמני כביסה יכולים להיות ירידה עד 10 דקות או עלו ל 1 שעה.
- מייבש עוברים על ידי שטיפה בסדרת אתנול של 25%, 50% ו 75% אתנול: PBS נדנדה בטמפרטורת חדר. שוב, הזמן לכל שטיפה יהיה תלוי בגודל של הרקמה. במשך 3 רקמות סנטימטר 0.5, דגירה כל שטיפה במשך 15 דקות. הגדל את משך זמן לחתיכות גדולות. אם אחסון לטווח ארוך של רקמה הוא רצוי, לשטוף פעמים נוספות באתנול וחנות 75% ב-20 מעלות צלזיוס למשך עד שנה אחת. אחרת להמשיך לשלב הבא.
- בהמשך מייבש על ידי שטיפת 3 פעמים באתנול 100% במשך 15 דקות כל אחת, מתנדנדת.
2. פרפין והטבעה של קטגוריות קיימים
- להבהיר רקמות על ידי שטיפת 2 פעמים בקסילן למשך 5 דקות כל אחד בבקבוקוני זכוכית scintillation עם מכסים מתברגים. קסילן יהפוך את הרקמה שבירה, ולכן לא תעלה על סך של 10 דקות להיוהס. הרקמה צריכה להיראות שקופה כשמחזיקים אותו עד אור. אם הרקמה היא עדיין מאוד אטומה אחרי שתי הכביסות, לעשות שטיפה נוספת בקסילן למשך 5 דקות ולאחר מכן להמשיך בפרוטוקול. לטפל רק קסילן בתוך מנדף עם כפפות.
- הסר קסילן ולמלא את בקבוקון נצנץ מלא 2/3 עם פרפין המותך. דגירה בתנור ° C 60 למשך 30 דקות. כאשר לשים פרפין לתוך הבקבוקון, תבחין פרפין לחזק צדי הבקבוקון. הנח את הבקבוקון בתנור ולאפשר לפרפין מחדש להתמוסס לכמה דקות. קח את הבקבוקון מהתנור ולתת הפתרון מהירה למערבולת לערבב ולהחליף בתנור למשך שארית דגירה.
- פרפין חזור incubations עוד פעמים למשך 30 דקות.
- הדגירה בפרפין פעמים לשעה כל אחד. שינוי פרפין פעם אחרונה, ודגירת הלילה בתנור ° C 60.
- למחרת, הנח את הרקמה בחדר מחומם פרפין אמבטיה ומקום תחת ואקום ל2-3 שעות. זה יקל על החדירה של פרפין לתוך הרקמות ולהסיר את כל בועות אוויר. עבור סוגים מסוימים של רקמה דקה, צעד ואקום לא ייתכן שיידרש, אבל זה הכרחי לעוברים שלמים או במערכת עיכול ואיברים אחרים עם תאים של אור.
- לאחר ואקום הקל חדירה של רקמות, רקמות מקום בתבנית מתכת עם פרפין מומס, ומצנן על צלחת קרח. השאר על קרח או ב 4 ° C למשך הלילה לפני שאתה מנסה להסיר את הרקמה מהעובש. בלוקי פרפין של רקמה ניתן לאחסן ללא הגבלה ב 4 ° C.
- בלוק המקום פרפין על microtome ולחתוך 8 סעיפי מיקרומטר. סעיפים צריכים להיות צף על אמבט מים המחוממים ל 48 מעלות צלזיוס ומותקנת על גבי זכוכית Superfrost * שקופיות פלוס.
- מגלשות יבשות לילה בתנור ° C 37.
- סעיפי חנות ב 4 ° C עד צורך.
ג. Alcian כחול / אדום מהיר גרעיני כתם של רקמות Elasmobranch
1. Alcian כתם הכחול לMucins
- מקום מחליק עם קטעים פונים כלפי מעלה בשקופית חמה יותר. ממסים למשך 45 דקות.
- מקום מחליק לתוך החזיק שקופיות. כל הפתרונים הנובעים מכך, כלולים באמבטיות בתוך מנדף. שקופיות נשטפות בהעברתם מאמבטיה אחד עם פתרון לאחר. ודא כי רמות הפתרון באמבטיות מכסות את השקופיות; הרקמות על השקופיות שקועות לחלוטין. להמס פרפין על ידי שטיפת שקופיות 2 פעמים בקסילן למשך 5 דקות כל אחד.
- שטוף את השקופיות פעמים עם אתנול 100% לכל 1 דקות.
- Rehydrate שקופיות בסדרת אתנול (75%, 50%, אתנול 25%) כביסה בכל פתרון לדקות 1. שטוף בDH 2 O לדקות 1.
- כתם הכחול בפתרון Alcian, 2.5 pH למשך 15 דקות.
- לפתח כתם על ידי שטיפה במים זורמים לברז 3 דקות. לטבול פעם אחת בDH 2 O.
- Counterstain בפתרון Counterstain גרעיני המהיר אדום למשך 10 דקות.
- לשטוף במים זורמים לברז 3 דקות ולטבול בזמן DH 2 O 1.
- Dehydrate בסדרת אתנול (25%, 50%, 75%, 100%, 100%) במשך 20 מטבלים כל אחד, או 1 דקות כל אחד. לשטוף 2 פעמים בקסילן למשך 5 דקות כל אחד. הר עם מדיום וcoverslips הרכבת dpx. לאפשר הרכבה בינונית עד יבש ולהתקשות ל48 שעות במנדף לפני מניפולצית שקופיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
דוגמאות לכתמים כחולים alcian באזורים שונים של L. מערכת עיכול erinacea מוצגת באיור 2. mucin חומצה המכיל תאי globlet הם נראים בבירור על ידי alcian כתם הכחול לאורך מערכת העיכול. חלוקת mucins חומצה שונה באזורים השונים של מערכת העיכול, ובכך הוא משקפת הבדלים בתפקוד. mucins חומציים מיוצרים בדלילות במעי הספירלה והביב, ואילו ריכוז גבוה של החומצה mucins מזוהה במעי דיסטלי (האיור 2a להשוות ו2c עם 2b).
| PBT | 1 x PBS |
| 0.1% Tween-20 | |
| סנן-לעקר ביחידות Nalgene סוג תרבית רקמת סינון. | |
| 20 x SSC, 4.5 pH </ Td> | M 3 NaCl |
| 0.3 NaCitrate M | |
| התאם pH עם חומצת לימון. | |
| פתרון הכלאה | 50% פוראמיד |
| 1.3 x SSC, 4.5 pH | |
| 5 המ"מ EDTA, 8 pH | |
| 50 מ"ג / המ"ל tRNA | |
| 0.2% Tween-20 | |
| בחורי 0.5% | |
| 100 מ"ג / המ"ל הפרין | |
| Aliquot ולאחסן ב -20 ° C עד לשנה אחת. | |
| Proteinase K | 10 מ"ג / מיליליטר פתרון מניות |
| 20 aliquots μl לתוך צינורות 0.5 μl אפנדורף הדמוי ולאחסן ב -20 ° C. | |
| פתרון # 1 | 50% פוראמיד |
| 1.3 x SSC, 4.5 pH | |
| 0.2% Tween-20 | |
| חנות ב -20 ° C | |
| פתרון # 2 | 50% פוראמיד |
| 1 x SSC, 4.5 pH | |
| 0.2% Tween-20 | |
| חנות ב -20 ° C | |
| כבשי סרום | להשבית ידי חימום עד 55 מעלות צלזיוס במשך שעה 1, וחנות בaliquots ב -20 ° C. |
| 10 x TBS | 80 גרם NaCl |
| 2 גרם KCl | |
| 250 מ"ל, 1 ז טריס-HCl, 7.5 pH | |
| מוסיף מים עד 1 ליטר | |
| 1 x TBST | 1 x TBS |
| 0.1% Tween-20 | |
| NTMT | 100 המ"מימ NaCl |
| 100 מ"מימ טריס-HCl, pH 9.5 | |
| </ Td> | 50 המ"מ MgCl 2 |
| 0.1% Tween-20 | |
| הפוך כ 100 מ"ל טרי לפני השימוש ולסנן. | |
| 200 מניות x NBT | 50 מ"ג / המ"ל NBT בפוראמיד דימתיל 70% |
| חנות ב-20 מעלות צלזיוס ב1 aliquots מ"ל. | |
| 200 מניות x BCIP | 25 מ"ג / המ"ל BCIP במים |
| חנות ב-20 מעלות צלזיוס ב1 aliquots מ"ל. |
טבלת 1. RNA כל הר בפתרונות באתרו.
| לינארית פלסמיד | 8 μl |
| 10 חיץ שעתוק x | 4 μl |
| DIG-UTP תערובת נוקלאוטיד | 2 μl |
| RNAse מעכב | 0.5 μl |
| רנ"אפולימראז (SP6, T3 או T7) | μl 1 |
| RNAse ללא סטרילי H 2 0 | 4.5 μl |
| נפח כולל | 20 μl |
טבלה 2. תמלול תגובה ליצירת רנ"א חללית.
איור 1. שהשישה וHoxa13 ביטוי בעוברי Leucoraja erinacea הם דמיינו ידי כל הר רנ"א כלאה באתר. () ביטוי ששישה מתגלה בעובר להחליק שלב 29. (') גדלה גבוהה של (א) מגלה ביטוי שבשישה notochord (ראשי חץ) והבטן האנדודרם (חיצים). (ב) Hoxa13 לשעברהדיכאון הוא מקומי לבלוטה רקטלית (חץ) של עובר להחליק שלב 29 (ב ') מערכת עיכול גזור מהעובר ב( ב) ממחישה את הספציפיות של ביטוי התמליל Hoxa13 לבלוטה רקטלית דואר, האנדודרם;.. n, notochord ;. Rg, בלוטה רקטלית לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 2. התפלגות תאי גביע mucin לייצור חומצי במערכת העיכול להחליק. (ג) מספרים נמוכים של תאי גביע mucin לייצור חומצי מזוהית על ידי alcian כתם הכחול במעי הספירלה והביב, בהתאמה (חיצים). (ב)המעי הדיסטלי מכיל ריכוז גבוה של תאי גביע mucin חומציים (חיצים). בכל הלוחות, גרעינים הם נראים בבירור על ידי אדומים במהירות הגרעינית כתם. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקולים שהוצגו הם שיטות קלסיות לניטור ביטוי גנים וזיהוי סוגי תאים מובחנים, והותאמו לשימוש בelasmobranchs הימי. שינויים נוספים של פרוטוקולים אלה עשויים להיות נחוצים כדי להסתגל למיני elasmobranch שונים.
הדאגה הנפוצה ביותר לגבי כל הר רנ"א באתר שלו את הסיכון של זיהום RNase ובכך השפלה של בדיקת רנ"א והודעות אנדוגניים. שני היבטים צריכים להילקח בחשבון: סינתזה של riboprobe והכלאתה להודעות עובריות, וטכניקות כלליות לטיפול ברנ"א. באופן כללי, על ידי הזיהום ribonucleases יכול להימנע על ידי שימוש במכולות שלא נפתחו plasticware ומזכוכית בעבר שאינו בשימוש. אם זכוכית החדשה אינה זמינה, לטפל בכל כלי הזכוכית עם RNase-AWAY (VWR # 17810-491). כביסות נעשות על ידי שפיכת עדינות את הפתרונים באמצעות כף מחוררת והוספת פתרון טרי לבקבוקון.לחלופין, עוברים או איברים / רקמות קטנים מאוד יכולים להיות ממוקמים בNetwell שמתאים למנת תרבות רקמות 6-כן. הרקמה ניתן להעביר מפתרון אחד למשנו, פשוט על ידי הרמת Netwell מבאר אחת למשנו. זה מסייע למנוע אובדן של כל רקמה שימזוג, וגם משמר את הארכיטקטורה של הרקמה. ניתן למצוא הצעות נוספות לטיפול בזיהום ומניעת רנ"א RNase בשיבוט מולקולרי; מעבדה ידנית, ועל כמה אתרי אינטרנט תרופות, כולל רוש (http://www.roche-applied-science.com/labfaqs/p2_1.htm) 11 .
דור של רנ"א הבדיקה וטיפול מראש והכלאה של עוברים הם השלבים הפגיעים ביותר לזיהום על ידי ribonucleases. בדיקות antisense RNA המשלימים תעתיק mRNA מסונתזים על ידי ילידים בשעתוק לאחור המבחנה ביחסי הציבורesence של digoxigenin-UTP. בקצרה, פלסמידים cDNA הם לינארית עם אנזים הגבלה ייחודית באתר שממוקם בקצה 5 'של הגן. זה מאפשר לרנ"א פולימרז לנפול בסופו של הגן. בחר RNA פולימראז על ידי זיהוי אמרגן RNA פולימראז הזמין בפלסמיד, רק 3 'לקודון העצירה. בעוד polymerases RNA T3 וT7 משמש לעתים קרובות לpBluescript, SP6 הוא הבחירה לגני subcloned לתוך פלסמידים pGEM כיווניים. בנוסף לRNase מעכב, מי DEPC טופל משמשים בתגובת השעתוק והטיהור של החללית. פתרון הכלאה וצעדים באמצעות PBT בטיפול מראש של עוברים כל צריכים להיעשות במי DEPC. למי פינוק DEPC, להוסיף 1 מ"ל של DEPC ל1 ליטר של מים בבקבוק גדול ומערבב היטב. השאר לילה במכסת מנוע וחיטוי ביום למחרת. פתרונות כגון 10 x SSC PBS וגם יכולים להתבצע עם מי DEPC טופל. לאחר הכלאה עם riboprobe, השימוש בRNase-חופשי כךlutions ואזהרות דומות כבר לא נחוצים.
משתנים נוספים שווים בהתחשב הם ריכוז ואורך טיפול K proteinase, שיכול להשפיע על החדירה של החללית. טיטרציה זהירה של מניית K proteinase מומלץ למטב את זמן טיפול בשלבים עובריים שונים. הפרוטוקול מתואר כאן נעשה שימוש שגרתי והצלחה עם עוברים בשלבים 20-31 פי 7 באלארד. לעוברים שהן מאוד צעירים או לרקמות שהן בעיקר "דביק", אבקת כביסת Tween-20 יכולה להיות מוחלפת עם טריטון-X. בנוסף, שינויים גנטיים ספציפיים לפרוטוקול עשויים להיות נחוצים בהתאם לשפע של תמליל. כדי להפחית את הרקע, dimethylformamide 10% נוסף באופן שגרתי לפתרון הפיתוח (NTMT) על ידי מספר קבוצות 12.
בניגוד לאופי הרגיש של RNA בs 'באתרו, את השמחה של היסטולוגיה היא כיהוא מהיר ודי חסין תקלות! כל השתנות בהכתמה היא כנראה עקב קיבעון לקוי. כדי להבטיח שהרקמה קבועה באופן מלא, מומלץ שרקמות גדולות מאוד (כגון מערכת העיכול של בעל חיים בוגרים) להיות מבותרות לחתיכות קטנות יותר ופתרון מקבע טרי הוחלף כל 10 שעות במשך שעתי 48. זה עשוי להיות נחוץ כדי לייעל את התנאים לקיבעון, שתי הרקמות מתחת ומעל קבועות יכולות לגרום לחתך עני או צביעה לא אחידה. בנוסף, כתמי histochemical שונים לפעול באופן מיטבי עם fixatives שונה. לכן, זה שווה את השינוי מקבע פי כתם histochemical שימוש 13. paraformaldehyde 4% מומלץ כאשר תיקון איברים או רקמות רכות עוברים צעירים. לעוברים מבוגרים או חיטת בעלי חיים, 10% פורמלין הוא מועדפים. ברגע שרקמה היא פרפין המוטבע ונותח, הוא עשוי לשמש למטרות רבות, כולל של RNA באתר '. זה מאפשר לרזולוציה של ביטוי גנים בלב הסלולריאל. לחלופין, חלקים עשויים להיות מוכתמים בכתמי histochemical שונים כדי לזהות סוגי תאים מובחנים.
הכתמים הכחולים והאדומים גרעיניים alcian המהירים שבוצעו בהצלחה בסקייט (Leucoraja erinacea), הכריש (acanthias Squalas), דבקן (Myxine glutinosa) וצמד הים (Petromyzon מרינוס), (תוצאות לא פורסמו) 10,14. בנוסף לחומציות הכחולה alcian 2.5 כתם שתואר כאן, שינוי pH של התמיסה הכחולה alcian יכול להבחין mucosaccharides השונה (sialo-לעומת כלומר sulfomucins) 13. מרכיבי mucosaccharide שונים יכולים להבחין תאי גביע על ידי פונקציה ולוקליזציה בתוך מערכת העיכול 15,16. Alcian הכתם כחול במערכת העיכול נעשה שימוש כדי לאבחן מצבים כגון הוושט של בארט וכדי לשפר את הצביעה של גרגרי לבלב בטא סלולארי 17,18.
בסכוםמרי, histochemistry וRNA שלם בהר של 'אתר כאשר נעשה שימוש יחד יכול להוביל להבנה טובה יותר של הקשר בין שם גן מתבטא במהלך התפתחות וסוג התא שנוצר. ביטוי של גני Hox אחוריים נקשר למפרט של תאי גביע mucin חומצה במערכת עיכול הפיתוח 10,19. כאן אני מספק דוגמה לביטוי של שישה וגן Hox יחד עם הנוכחות של תאי גביע mucin לייצור חומצה בL. מערכת העיכול erinacea. טכניקות אלו יכולות להיות מיושמות באופן נרחב למינים שונים של elasmobranchs, גני דפוסי התפתחות שונים וכתמים ההיסטולוגיים שונים. היישום המתמשך וההתאמה של טכניקות לelasmobranchs הימי חשוב לשמור על קצב עם השימוש הרחב של בעלי חיים אלה למודלי מחקר ביו בפיזיולוגיה, אנדוקרינולוגיה, טוקסיקולוגיה וגנומיקה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין לי מה לחשוף.
Acknowledgments
אני רוצה להודות לסטודנטים לתואר הראשון הרבים שעבדו במעבדה שלי ותרמו להתפתחות של פרוטוקולים אלה. NAT קבל תמיכה מסקידמור-איחוד הרשת, פרויקט שהוקם עם ADVANCE NSF שולם מענק.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 x transcription buffer | Roche | 11-465-384-001 | |
| DIG-RNA labeling mix | Roche | 11-277-073-910 | |
| RNAse inhibitor | Roche | 03-335-399-001 | |
| RNA polymerase - SP6 | Roche | 10-810-274-001 | |
| DNAseI, RNAse-free | Roche | 10-776-785-001 | |
| Yeast RNA | Invitrogen | 15401-029 | |
| CHAPS | EMD-Millipore | 220201 | |
| heparin | Sigma-Aldrich | H4784 | |
| DEPC (diethyl pyrocarbonate) | Research Organics | 2106D | |
| Moria Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | |
| Netwell inserts | Electron Microscopy Sciences | 64713-00 | Netwells for use in 6-well tissue culture dishes |
| 6-well tissue culture plate | Corning | 3516 | |
| Glass scintillation vials with screw-cap lids | Weaton Science Products | 986540 | |
| formamide | Fisher | BP227500 | |
| Proteinase K | Invitrogen | 59895 (AM2542) | |
| NBT | 11585029001 | ||
| BCIP | Roche | 11585002001 | |
| Hydrogen peroxide, 30% | EMD | HX0635-1 | |
| Sheep serum | VWR | 101301-478 | |
| glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| tRNA | Roche | 10-109-541-001 | |
| Anti-DIG Fab Fragments | Roche | 1137-6623 | |
| Table 3. Reagents and equipment for RNA whole mount in situ's. | |||
| 1% Alcian Blue 8GS, pH 2.5 | Electron Microscopy Sciences | 26323-01 | |
| Nuclear Fast Red | Electron Microscopy Sciences | 26078-05 | |
| DPX Mountant | Electron Microscopy Sciences | 13510 | |
| Paraffin (Paraplast X-tra) | McCormick Scientific | 39503002 | |
| 10% Formalin, NBF | VWR | 95042-908 | |
| Glass scintillation vials with screw-cap lids | Weaton Science Products | 986540 | |
| Stainless steal base molds | Tissue-Tek | 4161-4165 | Multiple sizes available. |
| Cassettes | Tissue-Tek | 4170 | |
| Slide warmer | Fisher-Scientific | 12-594Q | |
| Tissue Embedder | Leica Microsystems | EG1160 | |
| Microtome, rotary | Leica Microsystems | RM2235 | |
| Tissue-Tek Slide Staining Set | Electron Microscopy Sciences | 62540-01 | |
| Tissue-Tek 24-Slide Holder | Electron Microscopy Sciences | 62543-06 | |
| Superfrost*Plus slides | Fisherbrand | 12-550-17 | |
| Table 4. Reagents and equipment for Alcian Blue stain. | |||
References
- Forester, R., Goldstein, L. Intracellular osmoregulatory role of amino acids and urea in marine elasmobranchs. Am. J. Physiol. 230, 925-931 (1976).
- Shuttleworth, T. Physiology of elasmobranch fishes. Shuttleworth, R. , Springer-Verlag. 171-194 (1988).
- Yancey, P. H., Clark, M. E., Hand, S. C., Bowlus, R. D., Somero, G. N. Living with water stress: evolution of osmolyte systems. Science. 217, 1214-1222 (1982).
- Ballatori, N., Villalobos, A. Defining the molecular and cellular basis of toxicity using comparative models. Toxicl. Appl. Pharmacol. 183, 207-220 (2002).
- Nieto, M. A., Patel, K., Wilkinson, D. G. In situ hybridization analysis of chick embryos in whole mount and tissue sections. Methods Cell Biol. 51, 219-235 (1996).
- Jass, J. R., Walsh, M. D. Altered mucin expression in the gastrointestinal tract: a review. J Cell Mol Med. 5, 327-351 (2001).
- Ballard, W. W., Mellinger, J., Lechenault, H. A series of normal stages for development of Scyliorhinus canicula, the lesser spotted dogfish (Chondrichthyes; Scyliorhinidae). J. Exp. Zool. 267, 318-336 (1993).
- Echelard, Y., et al. Sonic hedgehog, a member of a family of putative signaling molecules, is implicated in the regulation of CNS polarity. Cell. 75, 1417-1430 (1993).
- Riddle, R. D., Johnson, R. L., Laufer, E., Tabin, C. Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA. Cell. 75, 1401-1416 (1993).
- Theodosiou, N. A., Hall, D. A., Jowdry, A. L. Comparison of acid mucin goblet cell distribution and Hox13 expression patterns in the developing vertebrate digestive tract. J. Exp. Zool. B. Mol. Dev. Evol. 308, 442-453 (2007).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Ch. 7. Molecular Cloning; A Laboratory Manual. 1, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 7.82 (2001).
- Zhang, G., Miyamoto, M. M., Cohn, M. J. Lamprey type II collagen and Sox9 reveal an ancient origin of the vertebrate collagenous skeleton. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3180-3185 (2006).
- Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. Theory and practice of histotechnology. , 2, Battelle Press. (1980).
- Theodosiou, N. A., Simeone, A. Evidence of a rudimentary colon in the elasmobranch, Leucoraja erinacea. Dev. Genes Evol. 222, 237-243 (2012).
- Filipe, M. I. Mucins in the human gastrointestinal epithelium: a review. Invest. Cell Pathol. 2, 195-216 (1979).
- Corfield, A. P., Wagner, S. A., Clamp, J. R., Kriaris, M. S., Hoskins, L. C. Mucin degradation in the human colon: production of sialidase, sialate O-acetylesterase, N-acetylneuraminate lyase, arylesterase, and glycosulfatase activities by strains of fecal bacteria. Infect. Immun. 60, 3971-3978 (1992).
- Reid, B. J., et al. Flow-cytometric and histological progression to malignancy in Barrett's esophagus: prospective endoscopic surveillance of a cohort. Gastroenterology. 102, 1212-1219 (1992).
- Mowry, R. Selective staining of pancreatic beta-cell granules. Evolution and present status. Arch. Pathol. Lab Med. 107, 464-468 (1983).
- Roberts, D. J., Smith, D. M., Goff, D. J., Tabin, C. J. Epithelial-mesenchymal signaling during the regionalization of the chick gut. Development. 125, 2791-2801 (1998).
