Summary
शाही सेना पूरे माउंट के लिए तरीकों के संयोजन से
Protocol
I. समुद्री Elasmobranchs में आरएनए स्वस्थानी संकरण में पूरे माउंट
1. भ्रूण फिक्सेशन और तैयारी
- स्केट भ्रूण 7 बेलार्ड के अनुसार मंचन किया जा सकता है. जीन की अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए इष्टतम चरणों हित के ऊतक पर निर्भर करता है. स्केट पाचन तंत्र में जीन की अभिव्यक्ति को ट्रैक करने के लिए, चरणों 27-30 जुलाई इष्टतम हैं.
- पीबीएस में भ्रूण टुकड़े करना, जर्दी थैली से भ्रूण को अलग.
- ताजा बना 4 में एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब ° C सौम्य कमाल के साथ में 4% paraformaldehyde (पीएफए) के 30 मिलीलीटर में फिक्स. 24 घंटे के लिए ठीक.
- पीबीटी में भ्रूण के लिए दो बार 15 मिनट, कमरे के तापमान पर घूर्णन धो लें. आरएनए स्वस्थानी 'में पूरे माउंट के लिए सभी समाधान व्यंजनों (1 टेबल) शामिल हैं.
- पीबीटी कमाल कमरे के तापमान पर 25% की एक मेथनॉल श्रृंखला, 50% और 75% मेथनॉल में धोने से भ्रूण निर्जलीकरण. washes की अवधि के भ्रूण के स्तर पर निर्भर करता है. पूर्व n के लिएeurulation भ्रूण का मंचन किया, मेथनॉल श्रृंखला में प्रत्येक धोने के 5 मिनट के लिए पर्याप्त है. पुराने भ्रूण के लिए 30 चरण की तुलना में, washes अप करने के लिए 30 मिनट के लिए पिछले कर सकते हैं. यह निर्धारित करने के लिए कि अगर भ्रूण पर्याप्त penetrated और प्रत्येक धोने को आदत, ट्यूब ईमानदार अपने हाथ में पकड़. यदि भ्रूण ट्यूब के नीचे सिंक करने के लिए है, तो आप अगले धोने के लिए तैयार कर रहे हैं. यदि भ्रूण समाधान के ऊपर तैरने लगते हैं, समाधान को बदलने के लिए और है कि विशेष रूप से निर्जलीकरण चरण दोहराएँ.
- 100% मेथनॉल में दो बार 10 मिनट के लिए धीरे कमाल धो लें.
- एक बार 100% मेथनॉल निर्जलित भ्रूण -20 डिग्री सेल्सियस में कम से कम 24 घंटे के लिए किया जाना चाहिए प्रोटोकॉल के साथ आगे बढ़ने से पहले संग्रहीत. भ्रूण सफलतापूर्वक किया गया है -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत और 1 वर्ष के लिए शाही सेना पूरे mounts के लिए प्रयोग किया जाता है.
2. शाही सेना जांच के संश्लेषण
- जीन जिनकी अभिव्यक्ति आप का पता लगाने के लिए करना चाहते हैं की एक रेखीय टुकड़ा उत्पन्न करता है. इस पीसीआर प्रवर्धन के भी किया जा सकता है या अपने जीन के साथ एक प्लाज्मिड linearizingब्याज की. पीसीआर द्वारा बढ़ाना, प्राइमरों जिसका बाध्यकारी साइटों पार्श्व जीन डालने और परिलक्षित क्षेत्र में शाही सेना पोलीमरेज़ बाध्यकारी साइटों को बनाए रखने के लिए चुनते हैं. पीबीएस या pGEM, M15 आगे और रिवर्स प्राइमरों के रूप में आमतौर पर इस्तेमाल किया plasmids के लिए आदर्श होते हैं. वैकल्पिक रूप से, एक एंजाइम है कि जीन के 5 'अंत में cleaves साथ QIAGEN miniprep डीएनए के 15 μl पचाने के द्वारा एक प्लाज्मिड linearize. जेल से निकालने और उपयुक्त QIAquick किट का उपयोग कर को शुद्ध.
- शाही सेना एक उचित आरएनए पोलीमरेज़ (प्रतिलेखन प्रतिक्रिया के लिए 2 टेबल देखें) का उपयोग टेम्पलेट के रूप में रैखिक पीसीआर उत्पाद के प्लाज्मिड या 100 एनजी 8 μl का उपयोग जांच अनुलेखन उल्टा.
- 37 में 2 घंटे के लिए रिवर्स प्रतिलेखन प्रतिक्रिया सेते ° सी.
- प्रतिक्रिया की पुष्टि करने के लिए, एक 1% agarose जेल / TAE प्रतिलेखन प्रतिक्रिया के 1 μl चलाते हैं. 100 mVolts में जेल चलाने के लिए जब तक डाई सिर्फ जेल में चला गया है. एक एकल प्रमुख बैंड दिखाई जानी चाहिए. रैखिक डीएनए टेम्पलेट टुकड़ा थोड़े बल एक उच्च molecu पर दिखाई दे सकता हैlar वजन.
- 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए RNase मुक्त मैं प्रतिलेखन प्रतिक्रिया और सेते DNase 1 μl जोड़ें.
- वेग, -20 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 60 मिनट या रात भर के लिए 100 μl ते 8 पीएच, 10 μl 4 एम LiCl, 300 μl 100% EtOH और सेते.
- +१४००० Rpm पर 10 मिनट के लिए एक 4 डिग्री सेल्सियस microfuge में स्पिन.
- 70% EtOH और शुष्क हवा के साथ गोली धो लें.
- DH 2 ओ के 20 μl में Resuspend आरएनए जांच संकरण बफर के 80 μl (संकरण बफर किया जाना चाहिए 70 डिग्री सेल्सियस के पूर्व गरम) जोड़ें. जांच -20 डिग्री सेल्सियस या उससे अधिक समय में कई महीनों के लिए 80% संकरण बफर में संग्रहीत किया जा सकता है -80 में डिग्री सेल्सियस
3. भ्रूण पूर्व उपचार और संकरण
- -20 डिग्री सेल्सियस से 100% मेथनॉल में संग्रहीत भ्रूण निकालें युवा भ्रूण के लिए कदम (3.2) के साथ आगे बढ़ना है. बाद भ्रूण (चरण 29 / <30) आप एक epidermis परत है कि भ्रूण के शरीर से दूर 'उठाया' देख सकते हैं. मंचन किया खुर्दबीन के तहत, ध्यान dissepidermal परत जांच पैठ को अधिकतम ect.
- स्वच्छ कांच जगमगाहट शीशियों में जगह भ्रूण. रिवर्स मेथनॉल श्रृंखला में ऊपर वर्णित भ्रूण rehydrate: धीरे कमरे के तापमान पर 5-30 मिनट प्रत्येक के लिए प्रत्येक समाधान कमाल: (पीबीटी 75%, 50%, 25% मेथनॉल). 10 मिनट प्रत्येक के लिए दो पीबीटी washes, धीरे कमाल के साथ पूरी पुनर्जलीकरण.
- पीबीटी 6% में 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर हाइड्रोजन पेरोक्साइड कमाल के साथ किसी भी वर्णक, ब्लीच भ्रूण को हटा दें.
- पीबीटी में तीन बार धोने से निकालें हाइड्रोजन पेरोक्साइड (कमरे के तापमान, 10 मिनट में कमाल).
- Proteinase कश्मीर के साथ भ्रूण का इलाज करने के लिए जांच के संकरण दौरान प्रवेश के लिए अनुमति देने के लिए. proteinase कश्मीर की राशि और इलाज की अवधि ऊतक आप जांच करने के लिए करना चाहते हैं और भ्रूण की उम्र पर निर्भर करता है. ज्यादा सतही ऊतक और छोटी भ्रूण कम और कम proteinase कश्मीर की आवश्यकता होती है, जबकि गहरे ऊतकों और उम्र भ्रूण एक उच्च एकाग्रता और लंबे समय तक इलाज टिम की आवश्यकताई पूरी तरह से जांच संकरण के लिए भ्रूण permeabilize. उदाहरण के लिए, चरण 29 स्केट भ्रूण पेट अन्तस्त्वक् में श्श्श का पता लगाने के लिए, 30 ग्राम / proteinase कश्मीर / PBT मिलीलीटर कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए incubated है.
- पीबीटी में भ्रूण कुल्ला दूर proteinase लालकृष्ण धो लो
- 4% पीएफए, पीबीटी में 20 मिनट के लिए 0.2% glutaraldehyde, धीरे कमाल साथ proteinase कश्मीर, पोस्टफिक्स भ्रूण निष्क्रिय.
- पीबीटी के साथ 10 मिनट के लिए दो बार धो लें.
- पूर्व संकरण के लिए, भ्रूण पूर्व गर्म संकरण समाधान के 2-3 मिलीलीटर जोड़ने, बस उन्हें कवर करने के लिए पर्याप्त है. एक गर्म पानी के स्नान में धीरे से 1 घंटे के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर रॉक.
- 70 ° सी के लिए 10 मिनट और बर्फ पर शांत संकरण समाधान, पहले से गरम आरएनए जांच को तैयार करते हैं. ताजा preheated संकरण समाधान के 2 मिलीलीटर आरएनए जांच के 15-20 μl पतला, 0.5-1.0 ग्राम / मिलीलीटर की एक अंतिम एकाग्रता प्राप्त. पूर्व hybe निकालें और भ्रूण को पतला आरएनए जांच जोड़ने. भ्रूण सिर्फ समाधान द्वारा कवर किया जाना चाहिए, एकdd अधिक संकरण यदि आवश्यक समाधान. जगमगाहट शीशी की कसकर सुरक्षित ढक्कन. 70 ° रातोंरात सी में एक गर्म पानी में स्नान धीरे कमाल द्वारा संकरण.
4. संकरण Washes और एंटीबॉडी संकरण पोस्ट
- एक ताजा जगमगाहट शीशी या Eppendorf ट्यूब में भ्रूण और जगह से जांच के साथ संकरण समाधान निकालें. जांच -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है और भविष्य में reused. के बाद संकरण washes, एक Netwell में जगह भ्रूण एक ऊतक छह अच्छी तरह से संस्कृति की थाली में बैठा.
- 30 मिनट पूर्व गर्म समाधान में प्रत्येक 1 # 70 में कमाल डिग्री सेल्सियस के लिए 3 बार धोएं
- 30 मिनट पूर्व गर्म समाधान में प्रत्येक # 2, 70 में कमाल डिग्री सेल्सियस के लिए 3 बार धोएं
- 5 TBST में प्रत्येक मिनट, कमरे के तापमान पर कमाल करने के लिए 3 बार धोएं.
- 10% गर्मी निष्क्रिय TBST में 1 घंटे के लिए भेड़ सीरम, कमरे के तापमान पर कमाल के साथ पूर्व ब्लॉक.
- Netwell से एक ताजा कांच जगमगाहट शीशी भ्रूण स्थानांतरण. विरोधी डीआईजी जोड़ें1% भेड़ गर्मी निष्क्रिय सीरम / भ्रूण TBST में फैब टुकड़े (1:5,000). 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात रॉक
5. डाक एंटीबॉडी संकरण Washes
- एंटीबॉडी निकालें और त्यागें. Washes के लिए प्लेस Netwell में वापस भ्रूण.
- 5 मिनट TBST में प्रत्येक के लिए 3 बार धोएं, कमरे के तापमान पर कमाल
- 1 घंटे के लिए कम से कम 6 बार धोएं, कमरे के तापमान पर कमाल.
- रातोंरात TBST में धो, 4 डिग्री सेल्सियस पर कमाल के रूप में पोस्ट एंटीबॉडी washes नीचे पृष्ठभूमि धुंधला हो पर कटौती की मदद, और washes की संख्या अवधि अधिकतम बेहतर है. भ्रूण नियमित रूप से 4 डिग्री सेल्सियस पर TBST में सप्ताहांत पर, धोया.
6. जांच की जांच
- ताजा NTMT समाधान करें और बाँझ बनाना फ़िल्टर करने के लिए.
- TBST धोने और एक स्वच्छ कांच जगमगाहट शीशी में समाधान जगह भ्रूण त्यागें. भ्रूण कमरे के तापमान, कमाल में प्रत्येक 10 मिनट के लिए 3 बार धोएं ताजा NTMT में.
- NTMT धोने और प्रतिक्रिया मिश्रण जोड़ने निकालें1 x एनबीटी / 1 x BCIP NTMT में. के रूप में इन reactants प्रकाश के प्रति संवेदनशील हैं, कमरे के तापमान पर पन्नी और रॉक में जगमगाहट शीशी को कवर.
- रंग प्रतिक्रिया हर 15 मिनट मॉनिटर जब तक वांछित जीन की अभिव्यक्ति स्पष्ट रूप से दिखाई देता है. मजबूत जांच के रूप में कम से कम 10 मिनट के लेने के लिए विकसित कर सकते हैं. कमजोर जांच 1-2 घंटा लग सकता है. प्रतिक्रिया बहुत लंबा है या पृष्ठभूमि धुंधला हो जाना प्रकट करने के लिए शुरू (पूरे भ्रूण एक सुस्त बैंगनी या भूरे रंग की बारी शुरू होता है) के लिए जाना मत देना.
- पीबीटी में प्रत्येक 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान, कमाल में 2 बार धोएं.
- 4% paraformaldehyde में पोस्टफिक्स भ्रूण, कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 0.1% glutaraldehyde. भ्रूण लगानेवाला में अनिश्चित काल के 4 डिग्री सेल्सियस की दुकान में हो सकता है
- एक विदारक stereomicroscope साथ भ्रूण कल्पना. पूर्व कठोर 1% agarose / पीबीएस के साथ एक थाली में एक प्रकाश चित्रों, जगह भ्रूण के लिए नीले रंग की पृष्ठभूमि का उत्पादन.
7. प्रतिनिधि परिणाम I. समुद्री elasmobranchs में आरएनए स्वस्थानी संकरण में पूरे माउंट के लिए
आरएनए 'सीटू ध्वनि (श) हाथी और Hoxa13 स्केट भ्रूण में चित्रण अभिव्यक्ति में पूरे माउंट चित्र 1 में दिखाया जाता है. श्श्श उच्च रीढ़ में अभिव्यक्ति पृष्ठदंड और पेट अन्तस्त्वक् में पाया जाता है और इस अभिव्यक्ति पैटर्न स्केट (चित्रा 1a) 8,9 में संरक्षित है. समुद्री elasmobranchs osmoregulation का एक अनूठा तरीका है कि छिपाना लवण मलाशय के ग्रंथि का उपयोग करता है Hoxa13 अभिव्यक्ति विकासशील गुदा ग्रंथि में उच्च है (चित्रा 1b) 10 patterning में Hoxa13 जीन उत्पाद भूमिका मलाशय के ग्रंथि अनजान बनी हुई है.
द्वितीय. पैराफिन Embedding और Elasmobranch ऊतक सेक्शनिंग
1. हार्वेस्ट और ऊतक की तैयारी
- वांछित ऊतक को काटना और 24-48 घंटे के लिए 10 formalin% ठीक करने के लिए, कमरे के तापमान पर कमाल. 4% paraformaldehyde (पीएफए) के एक बंधक के रूप में भी इस्तेमाल किया जा सकता है(चर्चा देखने के लिए).
- पीबीएस में कपड़े धोने, 30 मिनट के लिए 3 बार लगानेवाला धो लें. ऊतक के आकार पर निर्भर करता है, धोने बार 10 मिनट के लिए कम किया जा सकता है या 1 घंटे की वृद्धि हुई है.
- कमरे के तापमान पर पीबीएस कमाल: 25%, 50% और 75% इथेनॉल के एक इथेनॉल श्रृंखला में धोने से भ्रूण निर्जलीकरण. फिर, प्रत्येक धोने के लिए समय ऊतक के आकार पर निर्भर करेगा. 0.5 सेमी 3 ऊतक के लिए, 15 मिनट के लिए प्रत्येक धोने सेते हैं. बड़े टुकड़े के लिए समय बढ़ाएँ. यदि ऊतक की लंबी अवधि के भंडारण के वांछित है, 75% और इथेनॉल में -20 डिग्री सेल्सियस की दुकान में एक वर्ष के लिए एक अतिरिक्त दो बार धो लो. अन्यथा अगले कदम के लिए आगे बढ़ना है.
- इसके अलावा 100% इथेनॉल में 3 बार 15 मिनट के लिए, धोने, कमाल निर्जलीकरण.
2. Embedding और पैराफिन Sectioning
- Xylene में पेंच टोपी lids के साथ कांच जगमगाहट शीशियों में 5 मिनट के लिए 2 बार धोने से ऊतक स्पष्ट. Xylene ऊतक भंगुर प्रस्तुत करना होगा, तो था के लिए कुल 10 मिनट के एक से अधिक नहीं होनी करतेhes. ऊतक पारदर्शी देखने के लिए जब आप इसे एक प्रकाश पकड़ चाहिए. यदि ऊतक दो washes के बाद भी बहुत से अपारदर्शी है, xylene में 5 मिनट के लिए एक अतिरिक्त धोने और तो प्रोटोकॉल के साथ आगे बढ़ना है. दस्ताने के साथ एक धूआं हुड के अंदर केवल xylene संभाल.
- Xylene निकालें और जगमगाहट शीशी पिघल आयल के साथ 2/3 के भरें. 30 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस ओवन में सेते हैं. जब शीशी में आयल डाल, तो आप देखेंगे पैराफिन शीशी के पक्ष के साथ जमना. शीशी ओवन में रखें और पैराफिन कुछ मिनट के लिए फिर से भंग की अनुमति. ओवन से बाहर शीशी लो और समाधान के लिए एक त्वरित मिश्रण और ऊष्मायन शेष के लिए ओवन में बदलने ज़ुल्फ़ दे.
- दोहराएँ आयल 30 मिनट के लिए दो बार incubations.
- दो बार तेल में हर एक घंटे के लिए सेते हैं. आयल एक अंतिम समय बदलें और 60 डिग्री सेल्सियस ओवन में रातोंरात सेते हैं.
- अगले दिन, एक गर्म पैराफिन स्नान कक्ष और जगह में वैक्यूम के तहत 2-3 घंटे के लिए ऊतक जगह. इस ऊतक में आयल की घुसपैठ की सुविधा के लिए और किसी भी हवाई बुलबुले निकाल देंगे. पतली ऊतक के कुछ प्रकार के लिए, एक वैक्यूम कदम नहीं किया जा आवश्यकता है लेकिन हो सकता है यह पूरे भ्रूण या पाचन तंत्र और luminal डिब्बों के साथ अन्य अंगों के लिए आवश्यक है.
- बाद पिघल आयल, और एक बर्फ प्लेट पर शांत के साथ एक धातु मोल्ड में ऊतक, जगह ऊतक के घुसपैठ वैक्यूम सुविधा. आचारण से ऊतक को हटाने की कोशिश कर रहा से पहले बर्फ पर या 4 ° C विकेट पर छोड़ दें. ऊतक के पैराफिन ब्लॉकों 4 डिग्री सेल्सियस पर अनिश्चित काल के संग्रहीत कर सकते हैं
- एक सूक्ष्म तक्षणी प्लेस पर पैराफिन ब्लॉक और 8 सुक्ष्ममापी वर्गों में कटौती. धारा एक पानी 48 डिग्री सेल्सियस तक गर्म स्नान पर जारी किया जाना चाहिए और, कांच Superfrost * प्लस स्लाइड पर रखा.
- सूखी रातोंरात एक 37 डिग्री सेल्सियस ओवन में स्लाइड.
- 4 में स्टोर वर्गों ° C जरूरत तक.
III. Alcian ब्लू / परमाणु फास्ट लाल Elasmobranch ऊतक का दाग
1. Alcian ब्लू Mucins के लिए दाग
- इस जगह को एक गर्म स्लाइड पर ऊपर की ओर का सामना करना पड़ वर्गों के साथ स्लाइड. 45 मिनट के लिए पिगलो.
- एक स्लाइड धारक प्लेस में स्लाइड. सभी फलस्वरूप समाधान एक धूआं हुड के अंदर के टब में समाहित कर रहे हैं. स्लाइड उन्हें दूसरे करने के लिए एक समाधान के साथ एक टब से स्थानांतरित करके धो रहे हैं. सुनिश्चित करें कि टब में समाधान के स्तर स्लाइड्स को शामिल किया गया है, ऊतकों स्लाइड्स पर पूरी तरह से डूबे हुए हैं. स्लाइड 5 मिनट प्रत्येक के लिए 2 बार धोने xylene में पैराफिन भंग.
- स्लाइड 1 मिनट प्रत्येक के लिए 100% इथेनॉल के साथ दो बार धोएं.
- एक इथेनॉल श्रृंखला में स्लाइड्स (75%, 50%, 25% इथेनॉल) 1 मिनट के लिए प्रत्येक समाधान में धोने rehydrate. 1 मिनट के लिए DH 2 हे में धो लें.
- 15 मिनट के लिए Alcian ब्लू समाधान, 2.5 पीएच में दाग.
- 3 मिनट के लिए नल का पानी चलाने में धोने से दाग का विकास करना. DH 2 ओ में एक बार डुबकी
- 10 मिनट के लिए परमाणु फास्ट लाल Counterstain समाधान में Counterstain.
- 3 मिनट के लिए नल का पानी चलाने में धो और DH 2 हे एक समय में डुबकी.
- Dehyप्रत्येक 20 dips, या 1 मिनट के लिए एक इथेनॉल श्रृंखला (25%, 50%, 75%, 100%, 100%) में drate. Xylene में 5 मिनट के लिए 2 बार धोएं. DPX बढ़ते मध्यम और coverslips के साथ माउंट. शुष्क और कड़ा करने के लिए स्लाइड जोड़ तोड़ से पहले धूआं हुड में 48 घंटे के लिए मध्यम बढ़ते करने की अनुमति दें.
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Representative Results
Alcian नीले धुंधला के एल के विभिन्न क्षेत्रों में उदाहरण erinacea पाचन तंत्र चित्रा 2 में दिखाया जाता है. एसिड globlet कोशिकाओं से युक्त mucin स्पष्ट रूप से alcian नीले रंग की दिखाई पाचन तंत्र भर दाग रहे हैं. एसिड mucins के वितरण पाचन तंत्र के विभिन्न क्षेत्रों में अलग है, इस प्रकार के समारोह में अंतर को दर्शाती है. अम्लीय mucins कम सर्पिल आंत और क्लोअका में उत्पादित कर रहे हैं, के जबकि एसिड mucins के एक उच्च एकाग्रता डिस्टल आंत (2b साथ चित्रा 2a और 2c तुलना) में पाया जाता है.
| पीबीटी | 1 x पीबीएस |
| 0.1% Tween-20 | |
| फ़िल्टर Nalgene प्रकार के ऊतक संस्कृति फिल्टर इकाइयों में बाँझ. | |
| 20 x एसएससी, 4.5 पीएच </ P> | एम 3 NaCl |
| 0.3 एम NaCitrate | |
| साइट्रिक एसिड के साथ पीएच को समायोजित करें. | |
| संकरण समाधान | 50% Formamide |
| 1.3 x एसएससी, 4.5 पीएच | |
| 5 मिमी EDTA, पीएच 8 | |
| 50 मिग्रा / मिली tRNA | |
| 0.2% Tween-20 | |
| 0.5% लोग | |
| 100 मिलीग्राम / एमएल हेपरिन | |
| अशेष भाजक और एक वर्ष तक के लिए दुकान में -20 डिग्री सेल्सियस. | |
| Proteinase कश्मीर | 10 मिलीग्राम / एमएल स्टॉक समाधान |
| 0.5 μl Eppendorf तरह -20 डिग्री सेल्सियस और ट्यूबों की दुकान में 20 μl aliquots | |
| # 1 समाधान | 50% Formamide |
| 1.3 x एसएससी, 4.5 पीएच | |
| 0.2% Tween-20 | |
| -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर | |
| # 2 समाधान | 50% Formamide |
| 1 x एसएससी, 4.5 पीएच | |
| 0.2% Tween-20 | |
| -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर | |
| भेड़ सीरम | हीटिंग द्वारा 55 डिग्री सेल्सियस -20 में 1 घंटा, और aliquots में दुकान के लिए सी ° निष्क्रिय |
| 10 x टीबीएस | 80 ग्राम NaCl |
| 2 ग्राम KCl | |
| 250 मिलीलीटर, 1 Tris एचसीएल, पीएच 7.5 एम | |
| 1 एल पानी जोड़ें | |
| 1 x TBST | 1 x टीबीएस |
| 0.1% Tween-20 | |
| NTMT | 100 मिमी NaCl |
| 100 मिमी Tris एचसीएल, पीएच 9.5 | |
| </ P> | 50 मिमी 2 MgCl |
| 0.1% Tween-20 | |
| लगभग 100 मिलीलीटर का उपयोग कर और फिल्टर से पहले ताजा. | |
| 200 x एनबीटी स्टॉक | 50 मिलीग्राम / मिलीलीटर एनबीटी 70% डाइमिथाइल Formamide में |
| -20 डिग्री सेल्सियस में 1 मिलीलीटर aliquots में स्टोर. | |
| 200 x BCIP स्टॉक | 25 मिलीग्राम / मिलीलीटर पानी में BCIP |
| -20 डिग्री सेल्सियस में 1 मिलीलीटर aliquots में स्टोर. |
तालिका 1. स्वस्थानी समाधान में पूरी माउंट आरएनए.
| प्लाज्मिड linearized | 8 μl |
| 10 x प्रतिलेखन बफर | 4 μl |
| डीआईजी UTP nucleotide मिश्रण | 2 μl |
| RNase अवरोध करनेवाला | 0.5 μl |
| आरएनएपोलीमरेज़ (SP6, T3 या T7) | 1 μl |
| RNase मुक्त बाँझ 2 0 एच | 4.5 μl |
| कुल मात्रा | 20 μl |
तालिका 2. ट्रांसक्रिप्शन प्रतिक्रिया आरएनए जांच उत्पन्न.
चित्रा 1 श्श्श और Leucoraja erinacea भ्रूण में Hoxa13 अभिव्यक्ति आरएनए स्वस्थानी संकरण में पूरे माउंट द्वारा visualized हैं. (क) श्श्श अभिव्यक्ति एक चरण 29 स्केट भ्रूण में पाया जाता है (एक) की उच्च बढ़ाई (क) में श्श्श अभिव्यक्ति का पता चलता है. (तीर) पृष्ठदंड और पेट (तीर) (ख) Hoxa13 पूर्व अन्तस्त्वक्.pression स्थानीयकृत है एक मंच 29 स्केट भ्रूण की गुदा ग्रंथि (तीर) (ख) (ख) में भ्रूण से dissected पाचन तंत्र मलाशय के ग्रंथि Hoxa13 प्रतिलिपि अभिव्यक्ति की विशिष्टता ई अन्तस्त्वक् दर्शाता है. n, पृष्ठदंड , आरजी, गुदा ग्रंथि बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 2. अम्लीय mucin उत्पादक स्केट पाचन तंत्र (क, ग) अम्लीय mucin उत्पादक जाम कोशिकाओं की कम संख्या में जाम कोशिकाओं का वितरण सर्पिल आंत और क्लोअका में alcian नीले दाग, क्रमशः (तीर) से पता चला रहे हैं. (ख)बाहर का आंत अम्लीय mucin जाम कोशिकाओं (तीर) के एक उच्च घनत्व शामिल हैं. सभी पैनलों में, नाभिक परमाणु तेजी दाग लाल द्वारा स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
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Discussion
प्रस्तुत प्रोटोकॉल जीन की अभिव्यक्ति की निगरानी और विभेदित सेल प्रकार की पहचान करने के लिए क्लासिक तरीके हैं, और समुद्री elasmobranchs में उपयोग के लिए अनुकूलित किया गया है. इन प्रोटोकॉल से आगे संशोधन विभिन्न elasmobranch प्रजातियों के लिए अनुकूलन की जरूरत हो सकती है.
सबसे आम के बारे में चिंता आरएनए सीटू 'में पूरे माउंट RNase संदूषण का जोखिम और जिससे आरएनए जांच और अंतर्जात संदेश की गिरावट है. दो पहलुओं विचार करने की आवश्यकता: riboprobe के संश्लेषण और उसके संकरण भ्रूण संदेश, और शाही सेना से निपटने के लिए सामान्य तकनीक. सामान्य में, ribonucleases द्वारा संदूषण बंद कंटेनरों से plasticware का उपयोग करके बचा जा सकता है, और अप्रयुक्त पहले कांच के बने पदार्थ. यदि नया कांच के बने पदार्थ अनुपलब्ध है, RNase दूर (VWR 17,810-491 #) के साथ सभी कांच के बने पदार्थ का इलाज. Washes धीरे से एक छिद्रित चम्मच के माध्यम से समाधान डालने के लिये और शीशी ताजा समाधान जोड़ने के द्वारा किया जाता है.वैकल्पिक रूप से, बहुत छोटे भ्रूण / या अंगों और ऊतकों एक Netwell है कि एक 6-अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति डिश में फिट बैठता में रखा जा सकता है. ऊतक बस एक अच्छी तरह से Netwell अगले उठाने के द्वारा एक समाधान से अगले करने के लिए ले जाया जा सकता है. यह गिरने से किसी भी ऊतक के नुकसान को रोकने में मदद करता है, और यह भी ऊतक की वास्तुकला को बरकरार रखता है. शाही सेना को संभालने और RNase संदूषण को रोकने के लिए अतिरिक्त सुझाव आण्विक क्लोनिंग में पाया जा सकता है, एक प्रयोगशाला मैनुअल, और कई दवा वेबसाइटों पर (Roche सहित http://www.roche-applied-science.com/labfaqs/p2_1.htm ) 11 .
आरएनए जांच के सृजन और पूर्व उपचार और भ्रूण के संकरण ribonucleases द्वारा सबसे कमजोर संदूषण के लिए कदम उठाए हैं. Antisense शाही सेना जांच कि देशी mRNA प्रतिलेख पूरक से इन विट्रो रिवर्स प्रतिलेखन में जनसंपर्क में संश्लेषित कर रहे हैंdigoxigenin - UTP esence. संक्षेप में, एक अद्वितीय प्रतिबंध एंजाइम साइट जिसका जीन के 5 'अंत में स्थित है के साथ सीडीएनए plasmids linearized कर रहे हैं. इस के लिए शाही सेना पोलीमरेज़ जीन के अंत में गिरावट के लिए अनुमति देता है. आरएनए पोलीमरेज़ प्लाज्मिड, 3 बस रोकने के कोडोन 'में उपलब्ध प्रमोटर की पहचान के द्वारा एक शाही सेना पोलीमरेज़ चुनें. जबकि T3 और T7 आरएनए पोलिमेरासिज़ अक्सर pBluescript के लिए उपयोग किया जाता है, SP6 दिशात्मक pGEM plasmids में subcloned जीनों के लिए पसंद है. RNase अवरोध करनेवाला के अलावा, DEPC पानी का इलाज प्रतिलेखन और जांच की प्रतिक्रिया शुद्धि में प्रयोग किया जाता है. संकरण समाधान और भ्रूण के पूर्व उपचार में पीबीटी का उपयोग कदम सभी DEPC पानी के साथ किया जाना चाहिए. DEPC का इलाज पानी, पानी की एक बड़ी फ्लास्क में 1 एल DEPC के 1 मिलीलीटर जोड़ने और मिश्रण अच्छी तरह से. एक डाकू में रात भर छोड़ दें और अगले दिन आटोक्लेव. 10 x पीबीएस और एसएससी के रूप में इस तरह के समाधान भी DEPC पानी का इलाज के साथ किया जा सकता है. संकरण बाद riboprobe साथ RNase मुक्त उपयोग तोlutions और इसी तरह की सावधानियों नहीं रह रहे हैं आवश्यक है.
पर विचार करने लायक अतिरिक्त चर एकाग्रता और proteinase कश्मीर उपचार की लंबाई, जो जांच के प्रवेश को प्रभावित कर सकते हैं कर रहे हैं. Proteinase कश्मीर स्टॉक की एक सावधान अनुमापन अलग भ्रूण चरणों के लिए उपचार समय का अनुकूलन करने के लिए सिफारिश की है. प्रोटोकॉल यहाँ बताया कि नियमित रूप से और सफलतापूर्वक 20 चरणों में भ्रूण के साथ इस्तेमाल किया - 7 बेलार्ड के अनुसार 31. भ्रूण कि बहुत युवा या ऊतक है कि विशेष रूप से "चिपचिपा" के लिए कर रहे हैं, डिटर्जेंट Tween-20 Triton एक्स के साथ बदला जा सकता है. इसके अलावा, प्रोटोकॉल के लिए जीन विशेष संशोधनों प्रतिलिपि बहुतायत के आधार पर की जरूरत हो सकती है. पृष्ठभूमि को कम करने के लिए, 10% dimethylformamide नियमित किया गया है कई 12 समूहों द्वारा विकास समाधान (NTMT) जोड़ा.
'सीटू एस में शाही सेना की संवेदनशील प्रकृति के विपरीत, ऊतक विज्ञान की खुशी है कियह जल्दी है और बहुत आसान है! धुंधला हो परिवर्तनशीलता में किसी भी संभावना है अपर्याप्त निर्धारण के कारण है. यह सुनिश्चित करने के लिए कि ऊतक पूरी तरह से तय हो गई है, यह सिफारिश की है कि बहुत बड़ी ऊतकों (जैसे एक वयस्क पशुओं के पाचन तंत्र के रूप में) छोटे टुकड़ों और ताजा लगानेवाला समाधान में dissected किया जा एक 48 घंटे की अवधि पर हर 10 घंटा की जगह. यह निर्धारण के लिए शर्तों का अनुकूलन के लिए आवश्यक हो सकता है, दोनों के तहत और अधिक तय ऊतकों गरीब सेक्शनिंग या असमान धुंधला हो जाना हो सकता है. इसके अलावा, विभिन्न Histochemical दाग अलग fixatives के साथ बेहतर काम करते हैं. इस प्रकार, यह लगानेवाला Histochemical 13 प्रयोग किया जाता दाग के अनुसार संशोधित करने लायक है. 4% paraformaldehyde नरम ऊतक अंगों या युवा भ्रूण फिक्सिंग की सिफारिश की है. बड़े भ्रूण या पूरी पशुओं के लिए 10% formalin पसंद है. एक बार ऊतक एम्बेडेड और sectioned पैराफिन है, यह कई उद्देश्यों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, 'स्वस्थानी में शाही सेना सहित. यह सेलुलर लेव पर जीन अभिव्यक्ति के संकल्प के लिए अनुमति देता हैएल. वैकल्पिक रूप से, वर्गों विभिन्न Histochemical धब्बे के साथ सना हुआ जा सकता है विभेदित सेल प्रकार की पहचान.
सफलतापूर्वक alcian नीले और परमाणु तेजी लाल धुंधला हो स्केट (Leucoraja erinacea), dogfish (Squalas acanthias), hagfish (Myxine glutinosa) और एक प्रकार की मछली (Petromyzon Marinus) (अप्रकाशित परिणाम) 10,14 में प्रदर्शन किया गया है. 2.5 alcian नीले पीएच अलावा यहाँ वर्णित दाग, को संशोधित विभिन्न alcian नीले समाधान के पीएच (यानी sulfomucins sialo बनाम) mucosaccharides 13 भेद कर सकते हैं. विभिन्न mucosaccharide घटक पाचन पथ 15,16 भीतर समारोह और स्थानीयकरण द्वारा जाम कोशिकाओं को अलग कर सकते हैं. Alcian नीले पाचन तंत्र में दाग है Barrett घुटकी के रूप में इस तरह की स्थितियों का पता लगाने के लिए और अग्नाशय बीटा सेल 17,18 granules के धुंधला बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया गया है.
कुल मिलाकरmary ऊतकरसायनविज्ञान, और 'सीटू है जब एक साथ इस्तेमाल में पूरे माउंट आरएनए जहां एक जीन विकास के दौरान व्यक्त की है और परिणामस्वरूप विभेदित सेल प्रकार के बीच की कड़ी का एक बेहतर समझ के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. पीछे Hox जीन की अभिव्यक्ति एसिड mucin जाम कोशिकाओं के विकास पाचन तंत्र में 10,19 विनिर्देशन के लिए जोड़ा गया है. यहाँ मैं श्श्श और एल में mucin उत्पादन एसिड जाम कोशिकाओं की उपस्थिति के साथ साथ एक Hox जीन की अभिव्यक्ति का एक उदाहरण प्रदान erinacea पाचन तंत्र. इन तकनीकों में व्यापक रूप से elasmobranchs, विभिन्न विकासात्मक patterning जीन और अलग histological दाग की विभिन्न प्रजातियों के लिए लागू किया जा सकता है. निरंतर आवेदन और समुद्री elasmobranchs तकनीकों के अनुकूलन के लिए जैव चिकित्सा अनुसंधान मॉडल के लिए इन जानवरों के शरीर क्रिया विज्ञान में व्यापक, endocrinology, विष विज्ञान, जीनोमिक्स और उपयोग के साथ तालमेल रखने के लिए महत्वपूर्ण है.
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Disclosures
मैं खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
मैं कई स्नातक छात्रों जो मेरी प्रयोगशाला में काम किया है और इन प्रोटोकॉल के विकास में योगदान का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं. NAT Skidmore केंद्रीय नेटवर्क, एक NSF अनुदान अग्रिम श्रद्धांजलि के साथ स्थापित परियोजना से समर्थन मिला है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 x transcription buffer | Roche | 11-465-384-001 | |
| DIG-RNA labeling mix | Roche | 11-277-073-910 | |
| RNAse inhibitor | Roche | 03-335-399-001 | |
| RNA polymerase - SP6 | Roche | 10-810-274-001 | |
| DNAseI, RNAse-free | Roche | 10-776-785-001 | |
| Yeast RNA | Invitrogen | 15401-029 | |
| CHAPS | EMD-Millipore | 220201 | |
| heparin | Sigma-Aldrich | H4784 | |
| DEPC (diethyl pyrocarbonate) | Research Organics | 2106D | |
| Moria Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | |
| Netwell inserts | Electron Microscopy Sciences | 64713-00 | Netwells for use in 6-well tissue culture dishes |
| 6-well tissue culture plate | Corning | 3516 | |
| Glass scintillation vials with screw-cap lids | Weaton Science Products | 986540 | |
| formamide | Fisher | BP227500 | |
| Proteinase K | Invitrogen | 59895 (AM2542) | |
| NBT | 11585029001 | ||
| BCIP | Roche | 11585002001 | |
| Hydrogen peroxide, 30% | EMD | HX0635-1 | |
| Sheep serum | VWR | 101301-478 | |
| glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| tRNA | Roche | 10-109-541-001 | |
| Anti-DIG Fab Fragments | Roche | 1137-6623 | |
| Table 3. Reagents and equipment for RNA whole mount in situ's. | |||
| 1% Alcian Blue 8GS, pH 2.5 | Electron Microscopy Sciences | 26323-01 | |
| Nuclear Fast Red | Electron Microscopy Sciences | 26078-05 | |
| DPX Mountant | Electron Microscopy Sciences | 13510 | |
| Paraffin (Paraplast X-tra) | McCormick Scientific | 39503002 | |
| 10% Formalin, NBF | VWR | 95042-908 | |
| Glass scintillation vials with screw-cap lids | Weaton Science Products | 986540 | |
| Stainless steal base molds | Tissue-Tek | 4161-4165 | Multiple sizes available. |
| Cassettes | Tissue-Tek | 4170 | |
| Slide warmer | Fisher-Scientific | 12-594Q | |
| Tissue Embedder | Leica Microsystems | EG1160 | |
| Microtome, rotary | Leica Microsystems | RM2235 | |
| Tissue-Tek Slide Staining Set | Electron Microscopy Sciences | 62540-01 | |
| Tissue-Tek 24-Slide Holder | Electron Microscopy Sciences | 62543-06 | |
| Superfrost*Plus slides | Fisherbrand | 12-550-17 | |
| Table 4. Reagents and equipment for Alcian Blue stain. | |||
References
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