Summary
Ved å kombinere metoder for RNA hele mount
Abstract
Marine elasmobranchs verdsettes dyremodeller for biomedisinsk og genomisk studier som de er de mest primitive virveldyr å ha adaptiv immunitet og har unike mekanismer for osmoregulering 1-3. Som den mest primitive levende jawed-virveldyr med sammenkoblede vedheng, elasmobranchs er en evolusjonært viktig modell, spesielt for studier i evolusjon og utvikling. Marine elasmobranchs har også blitt brukt til å studere akvatisk toksikologi og stressfysiologi i forhold til klimaendringer 4. Således er utviklingen og tilpasning av metoder for å forenkle og utvide bruken av disse primitive virveldyr til flere biologiske disipliner. Her har jeg samlet en vellykket tilpasning av RNA hele mount in situ hybridisering og histologiske teknikker for å studere genuttrykk og cellehistologi i elasmobranchs.
Overvåking genuttrykk er et kjennetegn verktøy for utvikling Biologists, og er mye brukt til å undersøke utviklingsprosesser 5. RNA hele mount in situ hybridisering åpner for visualisering og lokalisering av spesifikke gen transkripsjoner i vev i utvikling av embryo. Uttrykket mønster av et gen budskap kan gi innsikt i hva utviklingsprosesser og celle skjebne beslutninger et gen kan styre. Ved å sammenligne ekspresjon mønster av et gen på forskjellige utviklingsstadier, kan innsikt oppnås i hvordan rollen av et gen forandringer under utvikling.
Mens hele mount in situ 's gir et middel for å lokalisere genekspresjon til vev, histologiske teknikker tillater for identifisering av differensierte celletyper og vev. Histologiske flekker har varierte funksjoner. Generelle flekker fremheves cellemorfologi, f.eks hematoxylin og eosin for generell farging av kjerner og cytoplasma, henholdsvis. Andre flekker kan markere bestemt celletyper. For eksempel flekken Alcian blå rapportert i denne artikkelen er en mye brukt kationisk flekken for å identifisere mucosaccharides. Farging av fordøyelseskanalen med Alcian blå kan identifisere fordelingen av goblet celler som produserer mucosaccharides. Variasjoner i mucosaccharide bestanddeler på korte peptider skille goblet celler etter funksjon innenfor fordøyelseskanalen 6. Ved å bruke RNA hele mount in situ 's og histochemical metoder samtidig, kan celle skjebne beslutninger knyttet til gen-spesifikk uttrykk.
Selv RNA in situ 's og histochemistry er mye brukt av forskere, har deres tilpasning og bruk i marine elasmobranchs møtte begrenset og variert suksess. Her har jeg samlet protokoller utviklet for elasmobranchs og brukes på en jevnlig basis i laboratoriet mitt. Selv ytterligere modifikasjon av RNA in situ 's hybridisering fremgangsmåte kan være nødvendig for å tilpasse seg til forskjellige arter, beskrev protokollene her provide et sterkt utgangspunkt for forskere som ønsker å tilpasse bruk av marine elasmobranchs til sine vitenskapelige undersøkelser.
Protocol
I. RNA Whole Mount in situ hybridisering i Marine Elasmobranchs
1. Embryo Fiksering og klargjøring
- Skate embryo kan være iscenesatt i henhold til Ballard 7. Optimale stadier for deteksjon av genekspresjon avhenger vevet av interesse. Å spore genuttrykk i skate fordøyelseskanalen, stadier 27-30 er optimal 7.
- Dissekere embryo i PBS, skiller embryoene fra plommesekken.
- Å reparere i 30 ml nylig laget 4% paraformaldehyd (PFA) på et 50 ml konisk rør ved 4 ° C med forsiktig vuggende. Fastsette for 24 timer.
- Vask embryoer i PBT, to ganger i 15 minutter, roterende ved romtemperatur. Alle løsning oppskrifter for RNA hel mount in situ 's er inkludert (Tabell 1).
- Dehydrere embryoer ved å vaske i en metanol serie på 25%, 50% og 75% metanol: PBT rocking ved romtemperatur. Varigheten av vasker avhenger av stadium av embryoene. For pre-neurulation iscenesatt embryoer, er 5 min av hver vask i metanol-serien tilstrekkelig. For embryoer eldre enn stadium 30, kan vasker vare opp til 30 min. For å avgjøre om embryoer er tilstrekkelig trengt og acclimated til hver vask, holde røret oppreist i hånden. Dersom embryoene synke til bunnen av røret, så er klar for neste vask. Dersom embryoene flyte til toppen av oppløsningen, endre oppløsningen og gjenta den bestemte dehydrering trinn.
- Vask to ganger i 100% metanol i 10 minutter forsiktig rocking.
- Gang dehydratisert til 100% metanol, bør embryoene bli lagret ved -20 ° C i minst 24 timer før fortsetter med protokollen. Embryoer har blitt lagret ved -20 ° C og brukt for RNA hele monteringer for opp til 1 år.
2. Syntese av RNA Probe
- Generere en lineær fragment av genet som uttrykket du vil oppdage. Dette kan gjøres enten ved PCR amplifikasjon eller linearizing et plasmid med genet dinav interesse. Å forsterke ved PCR, velger primerne som bindingsseter flanke genet sette og beholde RNA polymerase bindingssteder i det amplifiserte regionen. For brukte plasmider som PBS eller pGEM, M15 forover og bakover primere er ideelle. Alternativt, linearisere et plasmid ved oppslutning 15 pl QIAGEN miniprep DNA med et enzym som spalter ved 5'-enden av genet. Gel hente ut og rense med riktig QIAquick kit.
- Reverse transkribere RNA probe ved 8 ul lineær plasmid eller 100 ng av PCR-produkt som en mal med riktig RNA polymerase (se tabell 2 for transkripsjon reaksjon).
- Inkuber revers transkripsjon reaksjon i 2 timer ved 37 ° C.
- Å bekrefte reaksjon, kjøre en ul av transkripsjon reaksjonen på en 1% agarose / TAE gel. Kjør gel på 100 mVolts inntil fargestoff har nettopp kjørt inn i gel. En enkelt fremtredende band skal være synlig. Den lineære DNA-templat fragment kan være svakt synlig på et høyere molecuLar vekt.
- Tilsett 1 pl RNase-fri DNAse I til transkripsjon reaksjon og inkuber ved 37 ° C i 15 min.
- Å utfelle, tilsett 100 ul TE pH 8, 10 pl 4 M LiCl, 300 pl 100% EtOH og inkuber ved -20 ° C i minst 60 min eller over natten.
- Spinn i 10 min i en 4 ° C mikrosentrifuge ved 14.000 rpm.
- Vask pellet med 70% EtOH og lufttørke.
- Gjensuspender RNA probe i 20fil dH 2 O. Tilsett 80 pl hybridiseringsbuffer (hybridiseringsbuffer bør forvarmes til 70 ° C). Sonden kan lagres i 80% hybridiseringsbuffer i flere måneder ved -20 ° C eller lengre ved -80 ° C.
3. Embryo Forbehandling og Hybridisering
- Fjern embryoene lagret i 100% metanol fra -20 ° C. For yngre embryo fortsette med trinn (3.2). For senere iscenesatt embryoer (stadium 29/30 <) kan du se en epidermis lag som har "løftet" off kroppen av embryo. Under mikroskop, nøye dissect av epidermal laget for å maksimere probe penetrasjon.
- Sted embryo i rene glass scintillasjonsglass. Rehydrere embryoene i omvendt metanol serien beskrevet ovenfor: (75%, 50%, 25% metanol: PBT) med rocking forsiktig hver løsning for 5-30 minutter hver ved romtemperatur. Komplett rehydrering med to vasker av PBT for 10 min hver, forsiktig rock.
- For å fjerne eventuell pigment, blekemiddel embryoer med 6% hydrogenperoksyd i PBT i 1 time ved romtemperatur, vuggende.
- Fjern hydrogenperoksyd ved vasking tre ganger i PBT, (rocking ved romtemperatur, 10 min hver).
- Unn embryoer med proteinase K for å tillate penetrering av probe under hybridiseringen. Mengden proteinase K og varigheten av behandlingen er avhengig av vevet du vil undersøke og alderen av embryo. Mer overfladisk vev og yngre embryoer krever kortere og mindre proteinase K, mens dypere vev og eldre embryoer krever en høyere konsentrasjon og lengre behandling time å fullt permeabilize embryoet for sondehybridisering. For eksempel, for å detektere Shh i tarmen endoderm teateroppsetninger 29 skate embryoer, er 30 ug / ml av proteinase K / PBT inkubert i 20 min ved romtemperatur.
- Raskt skyll embryo PBT å vaske bort proteinase K.
- Hvis du vil deaktivere proteinase K, Postfix embryoer med 4% PFA, 0,2% glutaraldehyd i PBT i 20 min, forsiktig rocking.
- Vask to ganger i 10 minutter med PBT.
- For pre-hybridisering, tilsett 2-3 ml av forvarmet hybridisering løsning embryoene, akkurat nok til å dekke dem. Rock forsiktig i en oppvarmet vannbad ved 70 ° C i 1 time.
- For å forberede hybridisering løsning, forvarme RNA probe til 70 ° C i 10 min og avkjøles på is. Fortynn 15-20 pl av RNA-probe til 2 ml frisk forvarmet hybridisering løsning, for å oppnå en endelig konsentrasjon på 0,5 til 1,0 mikrogram / ml. Fjern pre-Hybe og legge utvannet RNA probe til embryoer. Embryo bør bare dekket av løsningen, endd mer hybridisering løsning hvis det er nødvendig. Tett sikker lokket scintillasjonskyvette. Hybridisere med rocking forsiktig i en oppvarmet vannbad ved 70 ° C over natten.
4. Innlegg Hybridiserings vasker og Antibody Hybridiserings
- Fjern hybridisering løsning med sonde fra befruktede egg og legg i en fersk scintillasjonskyvette eller Eppendorf tube. Sonden kan lagres ved -20 ° C og gjenbrukes i fremtiden. For post-hybridisering vasker, sted embryoer i en netwell sitter i en 6-brønn vevskulturplaten.
- Vask 3 ganger i 30 min hver i forvarmede Løsning nr. 1, vuggende ved 70 ° C.
- Vask 3 ganger i 30 min hver i forvarmede Løsning nr. 2, vuggende ved 70 ° C.
- Vask 3 ganger for 5 min hver i TBST, rock ved romtemperatur.
- Pre-blokk med 10% varme-inaktivert sauer serum i TBST i 1 time, rocking ved romtemperatur.
- Overfør embryo fra netwell til et friskt glass scintillasjonskyvette. Legg anti-DIGFab fragmenter (1:5,000) i 1% varme-inaktivert sau serum / TBST til embryoer. Rock natten ved 4 ° C.
5. Post Antistoff Hybridisering Vasker
- Fjern antistoff og kast. Sted embryo tilbake i netwell for vasker.
- Vask 3 ganger i 5 min hver i TBST, rock ved romtemperatur
- Vaske minst 6 ganger i 1 time hver, vuggende ved romtemperatur.
- Vask over natten i TBST, rock ved 4 ° C. Som innlegget antistoff vasker bidra til å kutte ned på bakgrunnsfarging, maksimere antall og varighet av vasker er å foretrekke. Embryoer blir rutinemessig vasket i TBST ved 4 ° C, over helgen.
6. Påvisning av Probe
- Sminke frisk NTMT løsning og filtrere sterilisere.
- Kast TBST vaskeløsning og sted embryoer i et rent glass scintillasjonskyvette. Vask embryoer 3 ganger i fersk NTMT i 10 min hver ved romtemperatur, gynge.
- Fjern NTMT vask og legge reaksjonsblandingav 1 x NBT / 1 x BCIP i NTMT. Ettersom disse reaktanter er lysfølsom, dekke scintillasjonskyvette i folie og stein ved romtemperatur.
- Overvåke farge reaksjon hver 15 min til ønsket genuttrykk er godt synlig. Sterke prober kan ta så lite som 10 minutter å utvikle. Svake prober kan ta 1-2 timer. Ikke la reaksjonen gå for lenge eller bakgrunnsfarging vil begynne å vises (hele embryo begynner å slå en kjedelig lilla eller brun farge).
- Vask 2 ganger i 10 min hver i PBT ved romtemperatur, gynge.
- Postfiks embryoer i 4% paraformaldehyd, 0,1% glutaraldehyd i 1 time ved romtemperatur. Embryo kan være store på ubestemt tid i fiksativ ved 4 ° C.
- Visualisere embryoer med en dissekere stereomikroskop. For å produsere en lys blå bakgrunn for bilder, sted embryoer i en tallerken med pre-herdet 1% agarose / PBS.
7. Representative Resultater for I. RNA Whole Mount in situ hybridisering i marine elasmobranchs
RNA hel mount in situ 's skildrer ekspresjon av sonic hedgehog (Shh) og Hoxa13 i skate embryoer er vist i figur 1. Uttrykk av Hysj i høyere virveldyr er funnet i ryggstreng og gut endoderm og dette uttrykket mønsteret er bevart i skøyte (Figur 1a) 8,9. Marine elasmobranchs har en unik metode for osmoregulering som bruker endetarms kjertel å skille ut salter. Hoxa13 uttrykket er høy i utviklingsland rektal kjertel (Figur 1b) 10. Hoxa13 genprodukt rolle i mønster endetarms kjertel er fortsatt ukjent.
II. Parafin Embedding og seksjonering Elasmobranch Tissue
1. Harvest og Utarbeidelse av Tissue
- Dissekere ønsket vev og fikse i 10% formalin for 24-48 timers, rocking ved romtemperatur. 4% paraformaldehyd (PFA) kan også brukes som et fiksativ(Se diskusjon).
- Vaske ut fiksativ ved vasking i PBS, 3 ganger i 30 min hver. Avhengig av størrelsen av vevet, kan vaske tider bli redusert til 10 min eller økes til 1 time.
- Dehydrere embryoer ved å vaske i en etanol serie på 25%, 50% og 75% etanol: PBS rocking ved romtemperatur. Igjen, vil tiden for hver vask, avhenger av størrelsen av vev. I 0,5 cm 3 vev, inkubere hver vask i 15 minutter. Øke tiden for større stykker. Hvis langtidslagring av vev er ønsket, vaske ytterligere to ganger i 75% etanol og oppbevar i -20 ° C i opp til ett år. Ellers fortsetter du til neste trinn.
- Ytterligere dehydrerer ved vasking 3 ganger i 100% etanol i 15 minutter hver, vuggende.
2. Parafin Embedding og seksjonering
- Avklare vev ved å vaske to ganger i xylen for 5 min hver i glass scintillasjonsglass med skrulokk lokk. Xylen vil gjengi vev sprø, så ikke overstige 10 min for varhes. Vevet bør se gjennomsiktig når du holder den opp til en lys. Hvis vevet er fortsatt veldig ugjennomsiktig etter de to vasker, gjør en ekstra vask i xylen for 5 min og deretter fortsette med protokollen. Bare håndtere xylen inne i en avtrekkshette med hansker.
- Fjern xylen og fyll scintillasjonskyvette 2/3 full med smeltet parafin. Inkuber i en 60 ° C ovn i 30 min. Når du legger parafin inn i hetteglasset, vil du legge merke til parafin stivne langs sidene av hetteglasset. Plasser hetteglasset i ovnen og la parafin gjenoppløs i noen minutter. Ta hetteglasset ut av ovnen og gi løsningen en rask virvel for å blande og erstatte i ovnen for resten av inkubasjon.
- Gjenta parafin Inkuberinger to ganger i 30 minutter.
- Inkuber i parafin to ganger for en time hver. Endre parafin en siste gang og inkuber over natten i 60 ° C ovnen.
- Den følgende dag, plasserer vevet i en oppvarmet parafin badekammer og sted under vakuum i 2-3 timer. Dette vil lette infiltrasjon av parafin til vevet og fjerner eventuelle luftbobler. For enkelte typer av tynne vev, kan et vakuum trinnet ikke være nødvendig, men det er nødvendig for hele embryoer eller fordøyelseskanalen og andre organer med luminal kupeene.
- Etter vakuum-tilrettelagt infiltrasjon av vev, sted vev i en metallform med smeltet parafin, og kul på en is plate. La på is eller ved 4 ° C over natten før prøver å fjerne vev fra formen. Parafin blokker av vev kan lagres på ubestemt tid ved 4 ° C.
- Sted parafin blokk på en mikrotom og kutte åtte mikrometer seksjoner. Seksjoner bør fløt på et vannbad oppvarmet til 48 ° C og montert på glassplater SuperFrost * Plus lysbilder.
- Tørre lysbilder over natten i et 37 ° C ovn.
- Oppbevar deler ved 4 ° C inntil nødvendig.
III. Alcian Blue / Nuclear Fast Red Stain av Elasmobranch Tissue
1. Alcian blåved for Mucins
- Sted glir med deler vendt opp på et lysbilde varmere. Smelt i 45 minutter.
- Sted glir inn i en lysbildeholderen. Alle påfølgende løsninger som er med i kar inne i en avtrekkshette. Lysbildene er vasket ved å overføre dem fra en kar med en løsning til en annen. Sørg for at løsningen nivåer i badekar dekker lysbildene, vevet på lysbildene er helt under vann. Oppløse parafin ved vasking lysbilder 2 ganger i xylen i 5 min hver.
- Vask lysbilder to ganger med 100% etanol i 1 min hver.
- Rehydratiseres lysbilder i en etanol serie (75%, 50%, 25% etanol) vask i hver løsning i 1 min. Vask i dH 2 O i 1 min.
- Flekken i Alcian Blå Solution, 2,5 pH i 15 min.
- Utvikle flekken ved vasking i rennende vann i 3 min. Dypp en gang i dH 2 O.
- Counterstain i Nuclear Fast Red Counterstain løsning for 10 min.
- Vask i rennende vann i 3 min og dukkert i dH 2 O én gang.
- Dehydrate i en etanol-serien (25%, 50%, 75%, 100%, 100%) for 20 dips hver, eller 1 min hver. Vask 2 ganger i xylen i 5 min hver. Monter med DPX montering medium og dekkglass. Tillat monteringsmedium å tørke og herde i 48 timer i avtrekksskap før manipulere lysbilder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Eksempler på Alcian blå flekker i ulike regioner av L. erinacea fordøyelseskanalen er vist i figur 2. Acid mucin som inneholder globlet celler er godt synlig ved Alcian blå flekken i hele fordøyelseskanalen. Fordelingen av syre mucins skiller seg i de ulike regionene i fordøyelseskanalen, og dermed gjenspeiler forskjeller i funksjon. Surt mucins er sparsely produseres i spiralen tarmen og Cloaca, mens en høy konsentrasjon av syre mucins oppdages i den distale tarmen (sammenlign figur 2a og 2c med 2b).
| PBT | 1 x PBS |
| 0,1% Tween-20 | |
| Filter-sterilisere i Nalgene-type vev kultur filterenheter. | |
| 20 x SSC, 4,5 pH </ Td> | 3 M NaCl |
| 0,3 M NaCitrate | |
| Juster pH med sitronsyre. | |
| Hybridisering løsning | 50% formamid |
| 1,3 x SSC, 4,5 pH | |
| 5 mM EDTA, pH 8 | |
| 50 mg / ml tRNA | |
| 0,2% Tween-20 | |
| 0,5% Chaps | |
| 100 mg / ml heparin | |
| Delmengde og oppbevar ved -20 ° C i opp til ett år. | |
| Proteinase K | 10 mg / ml lagerløsning |
| 20 ul alikvoter inn 0,5 ul Eppendorf-lignende rør og oppbevar ved -20 ° C. | |
| Løsning nr. 1 | 50% formamid |
| 1,3 x SSC, 4,5 pH | |
| 0,2% Tween-20 | |
| Oppbevares ved -20 ° C | |
| Løsning nr. 2 | 50% formamid |
| 1 x SSC, 4,5 pH | |
| 0,2% Tween-20 | |
| Oppbevares ved -20 ° C | |
| Sau serum | Innaktivere ved oppvarming til 55 ° C i 1 time, og lagre i aliquoter ved -20 ° C. |
| 10 x TBS | 80 g NaCl |
| 2 g KCl | |
| 250 ml, 1 M Tris-HCl, pH 7,5 | |
| Tilsett vann til 1 l | |
| 1 x TBST | 1 x TBS |
| 0,1% Tween-20 | |
| NTMT | 100 mM NaCl |
| 100 mM Tris-HCl, 9,5 pH | |
| </ Td> | 50 mM MgCl 2 |
| 0,1% Tween-20 | |
| Gjør ca 100 ml friskt før bruk og filter. | |
| 200 x NBT lager | 50 mg / ml NBT i 70% dimetylformamid |
| Lagres i -20 ° C i 1 ml alikvoter. | |
| 200 x BCIP lager | 25 mg / ml i vann BCIP |
| Lagres i -20 ° C i 1 ml alikvoter. |
Tabell 1. RNA hele mount in situ løsninger.
| Lineariserte plasmid | 8 pl |
| 10 x transkripsjon buffer | 4 pl |
| DIG-UTP nukleotid blanding | 2 ul |
| RNase inhibitor | 0,5 ul |
| RNApolymerase (SP6, T3 eller T7) | 1 ul |
| RNase-fri sterile H 2 0 | 4,5 pl |
| Totalt volum | 20 pl |
Tabell 2. Transkripsjon reaksjon å generere RNA probe.
Figur 1. Shh og Hoxa13 uttrykk i Leucoraja erinacea embryoer er visualisert ved RNA hele mount in situ hybridisering. (A) Shh uttrykk er oppdaget i en scene 29 skate embryo. (A ') Høyere forstørrelse av (a) viser Shh uttrykk i notochord (pilspisser) og gut endoderm (piler). (b) Hoxa13 expression er lokalisert til rektal kjertel (pil) av en scene 29 skøyte embryo (b ') dissekert fordøyelseskanalen fra embryoet i (b) demonstrerer spesifisiteten av Hoxa13 transkript uttrykket til den rektale kjertel e, endoderm;.. n, notochord ,. rg, rektal kjertel Klikk her for å se større figur .
Figur 2. Fordeling av sure mucin-produserende goblet celler i skate fordøyelseskanal. (A, c) Lave verdier av sure mucin-produserende goblet celler oppdages av Alcian blå flekken i spiral tarmen og Cloaca, henholdsvis (piler). (B)Den distale tarmen inneholder en høyere tetthet av sure mucin goblet celler (piler). I alle paneler, kjerner er klart synlige ved kjernefysiske rask rød flekk. Klikk her for å se større figur .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollene som presenteres er klassiske metoder for overvåking genuttrykk og identifisere differensierte celletyper, og er tilrettelagt for bruk i marine elasmobranchs. Ytterligere modifikasjoner av disse protokollene kan være nødvendig å tilpasse seg ulike elasmobranch arter.
Den vanligste bekymring RNA hel mount in situ 's er risikoen for RNase kontaminering og derved nedbrytning av RNA-probe og endogene meldinger. To aspekter må tas i betraktning: syntese av riboprobe og dens hybridisering til embryonale meldinger, og generelle teknikker for håndtering RNA. Generelt kan forurensning av ribonucleases unngås ved å bruke plasticware fra uåpnede beholdere, og tidligere ubrukt glass. Hvis ny glass er utilgjengelig, behandle alle glass med RNase-AWAY (VWR # 17810-491). Vasker er gjort ved å forsiktig helle ut løsninger gjennom en perforert skje og legge ny løsning til hetteglasset.Alternativt, kan svært små embryoer eller organer / vev bli plassert i en netwell som passer inn i en 6-brønners vevskultur parabolen. Vevet kan flyttes fra en løsning på den neste ved å løfte netwell fra én brønn til den neste. Dette bidrar til å hindre tap av vev ved å helle, og også bevarer arkitekturen i vevet. Ytterligere forslag for håndtering RNA og forebygge RNase forurensning kan bli funnet i Molecular Cloning, A Laboratory Manual, og på flere farmasøytiske nettsteder, inkludert Roche ( http://www.roche-applied-science.com/labfaqs/p2_1.htm ) 11 .
Generasjon av RNA-probe og forbehandling og hybridisering av embryoer er de mest sårbare trinnene til forurensning av ribonucleases. Antisens RNA sonder som utfyller innfødt mRNA transkript syntetiseres ved in vitro revers transkripsjon i PResence av Digoxigenin-UTP. Kort, er cDNA plasmider linearisert med en unik restriksjonsenzym hvis området er plassert på 5'-enden av genet. Dette gir mulighet for RNA-polymerase til å falle av ved slutten av genet. Velg en RNA polymerase ved å identifisere RNA-polymerase-promotoren tilgjengelig i plasmidet, bare 3 'til stoppkodonet. Mens T3 og T7 RNA polymeraser brukes ofte til pBLUESCRIPT, er SP6 valget for gener subklonet inn retningsknappene pGEM plasmider. I tillegg til RNase hemmer, DEPC-behandlet vann som brukes i transkripsjon reaksjonen og rensing av sonden. Hybridisering løsning og trinn ved hjelp PBT i forbehandling av embryo skal alle bli gjort med DEPC vann. Til DEPC behandler vann, tilsett 1 ml DEPC til 1 l vann i en stor kolbe og bland godt. La over natten i en hette og autoklaver neste dag. Løsninger som 10 x PBS og SSC kan også gjøres med DEPC-behandlet vann. Etter hybridisering med riboprobe, bruk av RNase-fri såresolusjoner og lignende forholdsregler er ikke lenger nødvendig.
Tilleggsvariabler verdt vurderer er konsentrasjonen og lengden av proteinase K behandling, som kan påvirke penetrasjon av proben. En forsiktig titrering av proteinase K lager anbefales å optimalisere behandlingen for forskjellige embryonale stadier. Protokollen er beskrevet her har blitt rutinemessig og brukt med embryoer på etapper 20-31 ifølge Ballard 7. For embryoer som er meget ung eller for vev som er spesielt "klebrige", kan vaskemiddel Tween-20 bli erstattet med Triton-X. I tillegg, kan gen-spesifikke endringer i protokollen være nødvendig avhengig overflod av transkripsjon. For å redusere bakgrunn har 10% dimetylformamid blitt rutinemessig lagt til utbyggingsløsning (NTMT) av flere grupper 12.
I motsetning til den følsomme natur av RNA in situ 's, er gleden histologi somdet er rask og ganske idiotsikkert! Enhver variasjon i farging er sannsynlig skyldes manglende fiksering. For å sikre at vevet er fullt løst, er det anbefalt at svært store vev (eksempel fordøyelseskanalen av en voksen dyr) være dissected i mindre biter og frisk fikseringsoppløsning erstattet hver 10 hr over en 48 timers periode. Det kan være nødvendig for å optimalisere betingelser for fiksering, kan både under og over-faste vev resultere i dårlig seksjonering eller ujevn farging. I tillegg ulike histokjemiske flekker fungere optimalt med forskjellige fiksativ. Således, er det verdt å modifisere fiksativ ifølge histochemical flekken brukes 13. 4% paraformaldehyd anbefales når fikse bløtvev organer eller unge embryoer. For eldre embryoer eller hele dyr, 10% formalin foretrekkes. Når vevet er parafin innebygde og seksjonert, kan det bli brukt for flere formål, blant RNA i situ 's. Dette gjør det mulig for oppløsning av genuttrykk på cellenivå level. Alternativt kan seksjoner være farget med forskjellige histokjemiske flekker å identifisere differensierte celletyper.
Den Alcian blå og kjernefysisk rask rød flekker har blitt utført i skøyte (Leucoraja erinacea), pigghå (Squalas acanthias), slimål (myxine glutinosa) og niøye (Petromyzon marinus), (upubliserte resultater) 10,14. I tillegg til den Alcian blå pH 2,5 flekken beskrives her, å endre pH i den Alcian blå løsning kan skille forskjellige mucosaccharides (dvs. sialo-versus sulfomucins) 13. Ulike mucosaccharide bestanddeler kan skille goblet celler etter funksjon og lokalisering innenfor fordøyelseskanalen 15,16. Alcian blå flekk i fordøyelseskanalen har vært brukt til å diagnostisere tilstander som Barretts øsofagus og å forbedre fargingen av pankreas beta-celle granulene 17,18.
I summary, histochemistry og RNA hele mount in situ 's når det brukes sammen kan føre til en bedre forståelse av sammenhengen mellom hvor et gen uttrykkes under utvikling og den resulterende differensiert celletype. Ekspresjon av posterior Hox-genene har vært knyttet til spesifikasjonen av syre mucin goblet celler i utviklingen fordøyelseskanalen 10,19. Her jeg gi et eksempel av ekspresjonen av Shh og Hox genet sammen med tilstedeværelse av syre mucin-produserende goblet celler i L. erinacea fordøyelseskanalen. Disse teknikkene kan bli mye brukt til ulike arter av elasmobranchs, ulike utviklingsmessige mønster gener og ulike histologiske flekker. Den fortsatte anvendelse og tilpasning av teknikker for å marine elasmobranchs er viktig å holde tritt med den brede bruken av disse dyrene for biomedisinsk forskning modeller i fysiologi, endokrinologi, toksikologi og genomikk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Jeg har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Jeg ønsker å takke de mange studentene som har jobbet i laboratoriet mitt og bidratt til utviklingen av disse protokollene. NAT har fått støtte fra Skidmore-Union Network, et prosjekt etablert med NSF forhånd betalt tilskudd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 x transcription buffer | Roche | 11-465-384-001 | |
| DIG-RNA labeling mix | Roche | 11-277-073-910 | |
| RNAse inhibitor | Roche | 03-335-399-001 | |
| RNA polymerase - SP6 | Roche | 10-810-274-001 | |
| DNAseI, RNAse-free | Roche | 10-776-785-001 | |
| Yeast RNA | Invitrogen | 15401-029 | |
| CHAPS | EMD-Millipore | 220201 | |
| heparin | Sigma-Aldrich | H4784 | |
| DEPC (diethyl pyrocarbonate) | Research Organics | 2106D | |
| Moria Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | |
| Netwell inserts | Electron Microscopy Sciences | 64713-00 | Netwells for use in 6-well tissue culture dishes |
| 6-well tissue culture plate | Corning | 3516 | |
| Glass scintillation vials with screw-cap lids | Weaton Science Products | 986540 | |
| formamide | Fisher | BP227500 | |
| Proteinase K | Invitrogen | 59895 (AM2542) | |
| NBT | 11585029001 | ||
| BCIP | Roche | 11585002001 | |
| Hydrogen peroxide, 30% | EMD | HX0635-1 | |
| Sheep serum | VWR | 101301-478 | |
| glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| tRNA | Roche | 10-109-541-001 | |
| Anti-DIG Fab Fragments | Roche | 1137-6623 | |
| Table 3. Reagents and equipment for RNA whole mount in situ's. | |||
| 1% Alcian Blue 8GS, pH 2.5 | Electron Microscopy Sciences | 26323-01 | |
| Nuclear Fast Red | Electron Microscopy Sciences | 26078-05 | |
| DPX Mountant | Electron Microscopy Sciences | 13510 | |
| Paraffin (Paraplast X-tra) | McCormick Scientific | 39503002 | |
| 10% Formalin, NBF | VWR | 95042-908 | |
| Glass scintillation vials with screw-cap lids | Weaton Science Products | 986540 | |
| Stainless steal base molds | Tissue-Tek | 4161-4165 | Multiple sizes available. |
| Cassettes | Tissue-Tek | 4170 | |
| Slide warmer | Fisher-Scientific | 12-594Q | |
| Tissue Embedder | Leica Microsystems | EG1160 | |
| Microtome, rotary | Leica Microsystems | RM2235 | |
| Tissue-Tek Slide Staining Set | Electron Microscopy Sciences | 62540-01 | |
| Tissue-Tek 24-Slide Holder | Electron Microscopy Sciences | 62543-06 | |
| Superfrost*Plus slides | Fisherbrand | 12-550-17 | |
| Table 4. Reagents and equipment for Alcian Blue stain. | |||
References
- Forester, R., Goldstein, L. Intracellular osmoregulatory role of amino acids and urea in marine elasmobranchs. Am. J. Physiol. 230, 925-931 (1976).
- Shuttleworth, T. Physiology of elasmobranch fishes. Shuttleworth, R. , Springer-Verlag. 171-194 (1988).
- Yancey, P. H., Clark, M. E., Hand, S. C., Bowlus, R. D., Somero, G. N. Living with water stress: evolution of osmolyte systems. Science. 217, 1214-1222 (1982).
- Ballatori, N., Villalobos, A. Defining the molecular and cellular basis of toxicity using comparative models. Toxicl. Appl. Pharmacol. 183, 207-220 (2002).
- Nieto, M. A., Patel, K., Wilkinson, D. G. In situ hybridization analysis of chick embryos in whole mount and tissue sections. Methods Cell Biol. 51, 219-235 (1996).
- Jass, J. R., Walsh, M. D. Altered mucin expression in the gastrointestinal tract: a review. J Cell Mol Med. 5, 327-351 (2001).
- Ballard, W. W., Mellinger, J., Lechenault, H. A series of normal stages for development of Scyliorhinus canicula, the lesser spotted dogfish (Chondrichthyes; Scyliorhinidae). J. Exp. Zool. 267, 318-336 (1993).
- Echelard, Y., et al. Sonic hedgehog, a member of a family of putative signaling molecules, is implicated in the regulation of CNS polarity. Cell. 75, 1417-1430 (1993).
- Riddle, R. D., Johnson, R. L., Laufer, E., Tabin, C. Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA. Cell. 75, 1401-1416 (1993).
- Theodosiou, N. A., Hall, D. A., Jowdry, A. L. Comparison of acid mucin goblet cell distribution and Hox13 expression patterns in the developing vertebrate digestive tract. J. Exp. Zool. B. Mol. Dev. Evol. 308, 442-453 (2007).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Ch. 7. Molecular Cloning; A Laboratory Manual. 1, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 7.82 (2001).
- Zhang, G., Miyamoto, M. M., Cohn, M. J. Lamprey type II collagen and Sox9 reveal an ancient origin of the vertebrate collagenous skeleton. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3180-3185 (2006).
- Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. Theory and practice of histotechnology. , 2, Battelle Press. (1980).
- Theodosiou, N. A., Simeone, A. Evidence of a rudimentary colon in the elasmobranch, Leucoraja erinacea. Dev. Genes Evol. 222, 237-243 (2012).
- Filipe, M. I. Mucins in the human gastrointestinal epithelium: a review. Invest. Cell Pathol. 2, 195-216 (1979).
- Corfield, A. P., Wagner, S. A., Clamp, J. R., Kriaris, M. S., Hoskins, L. C. Mucin degradation in the human colon: production of sialidase, sialate O-acetylesterase, N-acetylneuraminate lyase, arylesterase, and glycosulfatase activities by strains of fecal bacteria. Infect. Immun. 60, 3971-3978 (1992).
- Reid, B. J., et al. Flow-cytometric and histological progression to malignancy in Barrett's esophagus: prospective endoscopic surveillance of a cohort. Gastroenterology. 102, 1212-1219 (1992).
- Mowry, R. Selective staining of pancreatic beta-cell granules. Evolution and present status. Arch. Pathol. Lab Med. 107, 464-468 (1983).
- Roberts, D. J., Smith, D. M., Goff, D. J., Tabin, C. J. Epithelial-mesenchymal signaling during the regionalization of the chick gut. Development. 125, 2791-2801 (1998).
