בידוד, תרבות ואפיון פונקציונלי של Cardiomyoctyes מאוס למבוגרים
Summary
כאן אנו מתארים את הבידוד של cardiomyoctyes עכבר המבוגר באמצעות מערכת זלוף Langendorff. תאים וכתוצאה מכך הם Ca2 +, סובלניים, חשמלי שקט ויכולים להיות מתורבת וtransfected עם אדנו או lentiviruses כדי לתפעל ביטוי גנים. הפונקציונליות שלהם יכולה גם להיות מנותחת באמצעות מערכת MMSYS וטכניקות תיקון מהדק.
Abstract
השימוש בשריר לב ראשוני (CMS) בתרבות סיפק חזק כדי להשלים מודלים עכבריים של מחלת לב בקידום ההבנה של מחלת לב שלנו. בפרט, את היכולת ללמוד הומאוסטזיס יון, פונקצית ערוץ יון, התרגשות יתר סלולרית וצימוד עירור והתכווצות ושינוייהם בתנאים חולים ועל ידי מוטציות הגורמות למחלות הובילה לתובנות משמעותיות למחל לב. יתר על כן, חוסר שורת תאים הונצחה מספיק כדי לחקות את המבוגרים CMS, ואת המגבלות של CMS בילוד (אשר חסרים רבים האופייני ביומכניקה המבנית ותפקודי של המבוגר CMS) בתרבות שהקשו על ההבנה של יחסי הגומלין המורכבים בין מסלולי איתות שלנו, תעלות יונים ותכונות התכווצות בלב המבוגר חיזוק החשיבות של לימוד שריר לב מבודד מבוגר. כאן, אנו מציגים שיטות לבידוד, תרבות, המניפולציה של ביטוי גנים על ידי adenoviral-expreחלבוני ssed, וניתוח פונקציונלי הבא של שריר לב מהעכבר הבוגר. השימוש בטכניקות אלה יסייע לפתח תובנה מכניסטית לתוך איתות מסלולים המווסתים את הרגישות סלולרית, Ca 2 + דינמיקה והתכווצות ולספק הרבה יותר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית אפיון של מחלות לב וכלי דם.
Introduction
מודלים עכבריים למחלת לב וכלי דם ששימשו ככלים יעילים להבהרת מנגנוני מחלה בסיסיות 1,2, כמו גם לזיהוי מטרות טיפוליות אפשריות 1,3. בפרט, השימוש בשני המודלים העכבריים למחלת לב נרכשת (כמו לחץ-עומס יתר) 4,5 ומודלי עכבר מהונדסים קידמו את ההבנה של מחלות לב 6-8 שלנו. השימוש בטכניקות תרבית תאים ללמוד מפלי איתות 3,9,10 ושינויים בחלבונים בודדים העומדים בבסיס רגישות סלולרית וצימוד עירור והתכווצות בלב 11-13 ברמה של התא הבודד שמשלים in vivo המודלים העכבר. עם זאת, החוסר של שורות תאים נאותות המשקפות את מבנה CM המבוגר ותפקוד היה מגבלה משמעותית. חוקרים ביקשו להתגבר על זה על ידי לימוד חלבונים בודדים, כגון תעלות יונים, במערכות ביטוי Heterologous <sup> 14, ובעוד מחקרים אלו סיפקו לנו מידע שימושי במונחים של ביופיזיקה ערוץ יון או סחר בחלבון, ייצוג לקוי של microenvironment יליד CMS הוא מגבלה משמעותית. שנית, מאחר שרוב תאי Heterologous אלה אין לי מנגנון התכווצות בוגר, זה לא היה אפשרי ללמוד לתפקד התכווצות ואת יחסי גומלין המורכבים שבין רגישות והתכווצות הסלולריות. מסיבה זו, חוקרים פנו לתרביות תאי לב עיקריות לרבים מהמחקרים במבחנה הפונקציונליים שלהם. לבסוף, מחקרי cardiomyocyte מבודדים מאפשרים הערכה של תפקוד התכווצות ללא גורמי בלבול של הכנה רב תאית הכוללים את ההשפעה של צלקת או סיסטיק וכיוון סיבים.
שריר לב של חדר עכברוש בילוד ראשי (NRVMs) הם קלים יחסית לתרבות, יכול להיות נגוע בadenoviruses וlentiviruses לתפעל ביטוי גנים 15,nd היה בשימוש ולכן בהצלחה 1, אבל יש מגבלות משלהם. למרות שהם מספקים microenvironment פיסיולוגי 1 והיה סוס העבודה של שדה האיתות, הבדלים משמעותיים בין המורפולוגיה וארגון subcellular של NRVMs וcardiomyoctyes מבוגרים להפוך אותם למודל לקוי לחקירה והנתיבים יוניים וצימוד עירור והתכווצות בלב המבוגר . בעיקר NRVMs חסר משנה t-צינורי סופי 4. מאז Ca 2 + שטף ודינמיקה הם תלוי באופן קריטי על חולצת צינורי בוגר וreticulum sarcoplasmic (SR) מבנה 6, Ca 2 + דינמיקה ומחקרים תפקודיים של התכווצות הלב בNRVMs אינם השתקפות מדויקת של תהליכים הקריטיים אלה בשריר לב מבוגר. יתר על כן, חלק מהרכיבים של מסלולי איתות שונים בין עכברי יילודים ומבוגרים 9, ובכך לספק מגבלה אחרת ללימוד תהליכי מחלה ואניmpact על רגישות סלולרית והתכווצות בNRVMs. לבסוף, ההפצה של מכונות ההתכווצות מובילה לקיצור תא multidirectional ולא אחיד המגביל את הדיוק של מדידות ההתכווצות.
השימוש בשריר לב למבוגרים מבודד מספק לכן מערכת מידול מדויקת יותר במבחנה. הצמיחה יוצאת דופן של ידע מתאפשרת על ידי המניפולציה הגנטית של עכברים מדגישה את החשיבות של השגת שריר לב מבודד פונקציונלי מעכברים. למעשה, האפיון של CMS למבוגרים מבודדים ממודלי עכבר יש לשפוך אור על אירועים ביולוגיים ופתולוגיים רבים. CMS מבודד ממודלי עכבר מהונדסים איפשר ללימודים מהרווח או אובדן התפקוד של חלבונים על תכונות ההתכווצות של תאים בודדים 2,16, והכדאיות במודלים של מחלה כגון איסכמיה / reperfusion 17,18, ובכך משלים את המידע שנצבר ב מחקרי vivo עלעכברי se. שימוש במבוגרים מבודדים CMS ממודלים עכבריים למחלת לב נרכש 3,19,20 (כגון עומס יתר לחץ רוחבי אב העורקים נגרם התכווצות, כי יתר לחץ דם מחקה או היצרות מסתם אאורטלי) או פעילות גופנית 5,21 (לדוגמנות היפרטרופיה פיזיולוגית) מאפשר לבדיקה של האינטראקציה של מפלי איתות מעורבים בתהליכים אלה עם רגישות סלולרית וצימוד עירור והתכווצות ברמה של התא הבודד. יתר על כן, היכולת לתפעל ביטוי גנים באמצעות ביטוי מונע adenoviral גן במבוגרים CMS מאפשרת לנו את ההזדמנות לנתח את המרכיבים של מסלולי איתות מורכבים.
מנקודת מבט של אלקטרו, מתח כל התא וניסויים מהדק הנוכחיים על מבוגרים מבודדים CMS היו קריטיים בהבהרת אופי והנתיבים יוניים בתחילת מחקר ובמצבי מחלה שונות. בגלל המבנה המורכב של קרום התא וההגנה של מחזור ההפרשבמבני פיגומים בין המבוגרים CMS וNRVMs או שורות תאי Heterologous, את יכולת תיקון תאים בוגרים נותנת ייצוג טוב יותר של ההשפעות של חלבונים מסוימים בממברנה, חלבונים מבניים, ושותפים באינטראקציה ערוץ יון ברכיבי אלקטרו של הלב המבוגר.
למרות יתרונות בולטים כגון בלימוד cardiomyocytes העכברי מבוגר, בידוד וculturing cardiomyocytes עכברים הבוגר כבר מאתגר, דוחק את הצורך בתיאור שיטתי ומדויק של המתודולוגיה לבודד את שריר לב עכבר קיימא ולשמור אותם בתרבות כדי לאפשר מניפולציה גנטית נוספת באמצעות ויראלי וקטורים. מחקרים קודמים השתמשו גם CMS המבוגר עכבר חריפות מבודדת או מבוגר חולדה בתרבית CMS. זה האחרון קל יותר לתרבות מאשר עכבר מבוגר CMS, ורוב ניסויי מניפולציות ביטוי גנים במבחנה השתמשו מבוגר CMS חולדה. מחקרים מעטים שינו בהצלחה וחקרו functiביטוי onal גן במבוגרי עכבר CMS, הצגת מגבלה גדולה בהיקף של ניסויים. לכן, כאן אנו מציגים בפירוט מתודולוגיות כגון, שונה מחקירות קודמות, לבידוד 7,8,22, תרבות 3,10,15,23, זיהום adenoviral 11-13,15, וניתוח פונקציונלי של cardiomyoctyes חדרית עכבר מבוגר. תוצאות פרוטוקול הבידוד הזה בCa 2, cardiomyocytes להתרגש + הסובלני שיש לנו בהצלחה בתרבית למשך עד 72 שעה וtransiently transfected עם adenovirus. הפונקציונליות של תאים מבודדים אלה ניתן להעריך באמצעות מערכת MMSYS ההדמיה 14,24 ומהדק תיקון, שגם יידון.
Protocol
Representative Results
Discussion
בדו"ח זה, שתארנו את הטכניקות הדרושות לבידוד מוצלח ותרבות של המבוגרים CMS מלב העכבר. הטכניקה שלנו מאפשרת למחקר הבא של פונקצית CM ורגישות תוך שימוש בשיטות שתוארו לעיל. הפרמטר הקריטי ללימוד פונקציונלי של המבוגרים CMS הוא הבריאות ואיכות CMS המבודד. כפי שתואר לעיל, הטכניקות ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride | Sigma | S7653 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P9333 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S8282 | |
| D-glucose minimum | Sigma | G8270 | |
| Taurine | Sigma | T0625 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma | B0752 | |
| Collagenase B | Roche Applied Science | 11088807001 | |
| Collagenase D | Roche Applied Science | 11088858001 | |
| Protease XIV from Streptomyces griseus | Sigma | P5147 | |
| Albumin from Bovine Serum | Sigma | A2153 | |
| Calcium Chloride | Sigma | C8106 | |
| Minimum Essential Media | Sigma | 51411C | |
| Albumin solution from bovine serum | Sigma | A8412 | |
| L-glutamine | Sigma | G3126 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Insulin-transferrin-sodium selenite media supplement | Sigma | I1884 | |
| Cesium Chloride | Sigma | 289329 | |
| Glutamate | Sigma | G3291 | |
| Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid | Sigma | E3889 | |
| Cesium Hydroxide Solution | Sigma | 232041 | |
| Tetraethylammonium hydroxide solution | Sigma | 86643 | |
| OptiVisor optical glass binocular visor | Dohegan Optical Company Inc. | N/A | |
| Tissue forceps, 5.5″, 1×2 teeth | Roboz Scientific | RS-8164 | |
| Moloney forceps – 4.5″ (11.5 cm) long slight curve, serrated | Roboz Scientific | RS-8254 | |
| Dumont #3 Forceps, Dumostar, tip size 0.17 x 0.10mm | Roboz Scientific | RS-4966 | |
| Packer Mosquito Forceps 5″ Straight Flat | Roboz Scientific | RS-7114 | |
| Micro Dissecting Scissors 4.5″ Curved Sharp/Sharp | Roboz Scientific | RS-5917 | |
| Micro Dissecting Scissors 3.5″ Straight Sharp/Sharp20mm | Roboz Scientific | RS-5907 |
References
- Chlopcikova, S., Psotová, J. Neonatal rat cardiomyocytes-a model for the study of morphological, biochemical and electrophysiological characteristics of the heart. Biomedical Papers. , (2001).
- Rosenthal, N., Brown, S. The mouse ascending: perspectives for human-disease models. Nat. Cell Biol. 9, 993-999 (2007).
- Ballou, L. M., Lin, R. Z. Rapamycin and mTOR kinase inhibitors. J. Chem. Biol. 1, 27-36 (2008).
- Brette, F., Orchard, C. T-Tubule Function in Mammalian Cardiac Myocytes. Circ Res. , (2003).
- Sakata, Y., Hoit, B., Liggett, S., Walsh, R. Decompensation of pressure-overload hypertrophy in G?q-overexpressing mice. Circulation. , (1998).
- Lieu, D. K., et al. Absence of Transverse Tubules Contributes to Non-Uniform Ca 2+Wavefronts in Mouse and Human Embryonic Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Stem Cells and Development. 18, 1493-1500 (2009).
- Lim, H., De Windt, L., Mante, J., Kimball, T. Reversal of cardiac hypertrophy in transgenic disease models by calcineurin inhibition. J. Mol. Cell Cardiol. 32 (4), 697-709 (2000).
- Muthuchamy, M., et al. Mouse model of a familial hypertrophic cardiomyopathy mutation in alpha-tropomyosin manifests cardiac dysfunction. Circ. Res. 85, 47-56 (1999).
- Müller, J. G., et al. Differential regulation of the cardiac sodium calcium exchanger promoter in adult and neonatal cardiomyocytes by Nkx2.5 and serum response factor. J. Mol. Cell. Cardiol. 34, 807-821 (2002).
- Epstein, F., Hunter, J. Signaling pathways for cardiac hypertrophy and failure. New England Journal of Medicine. 341 (17), 1276-1283 (1999).
- Snopko, R., Aromolaran, A., Karko, K. Cell culture modifies Ca 2+ signaling during excitation-contraction coupling in neonate cardiac myocytes. Cell Calcium. , (2007).
- Ranu, H., Terracciano, C., Davia, K. Effects of Na+/Ca2+-exchanger overexpression on excitation-contraction coupling in adult rabbit ventricular myocytes. J. Mol. Cell Cardiol. 34 (4), 389-400 (2002).
- Kaab, S., Nuss, H. B., Chiamvimonvat, N., O’Rourke, B., Pak, P. H., Kass, D. A., Marban, E., Tomaselli, G. F. Ionic mechanism of action potential prolongation in ventricular myocytes from dogs with pacing-induced heart failure. Circ. Res. 78 (2), (1996).
- Splawski, I., et al. Variant of SCN5A sodium channel implicated in risk of cardiac arrhythmia. Science. 297, 1333-1336 (2002).
- Zhou, Y., Wang, S., Zhu, W. Culture and adenoviral infection of adult mouse cardiac myocytes: methods for cellular genetic physiology. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 279 (1), 429-436 (2000).
- Sussman, M., Lim, H., Gude, N., Taigen, T. Prevention of cardiac hypertrophy in mice by calcineurin inhibition. Science. , (1998).
- Heinzel, F. R., et al. Impairment of diazoxide-induced formation of reactive oxygen species and loss of cardioprotection in connexin 43 deficient mice. Circ. Res. 97, 583-586 (2005).
- Li, X., Heinzel, F. R., Boengler, K., Schulz, R., Heusch, G. Role of connexin 43 in ischemic preconditioning does not involve intercellular communication through gap junctions. J. Mol. Cell. Cardiol. 36, 161-163 (2004).
- Rockman, H. A., Ross, R. S., Harris, A. N., Knowlton, K. U., Steinhelper, M. E., Field, L. J., Ross, J., Chein, K. R. Segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo murine model of cardiac hypertrophy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 8277-8281 (1991).
- Nakamura, A., Rokosh, D. LV systolic performance improves with development of hypertrophy after transverse aortic constriction in mice. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 281 (3), 1104-1112 (2001).
- Boström, P., et al. A PGC1-?-dependent myokine that drives brown-fat-like development of white fat and thermogenesis. Nature. 481, 463-468 (2012).
- Liao, R., Jain, M. Isolation, culture, and functional analysis of adult mouse cardiomyocytes. Methods Mol. Med. 139, 251-262 (2007).
- Volz, A., Piper, H. M., Siegmund, B., Schwartz, P. Longevity of adult ventricular rat heart muscle cells in serum-free primary culture. J. Mol. Cell. Cardiol. 23, 161-173 (1991).
- Guatimosim, S., Guatimosim, C., Song, L. -. S. . Methods in Molecular Biology. 689, 205-214 (2010).
- Yang, J., Delaloye, K., Lee, U. S., Cui, J. Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes. J. Vis. Exp. (47), e2269 (2011).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in Xenopus Oocytes. J. Vis. Exp. (20), e936 (2008).
- Arman, A. C., Sampath, A. P. Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation. J. Vis. Exp. (43), e2107 (2010).
- Wen, H., Brehm, P. Paired patch clamp recordings from motor-neuron and target skeletal muscle in zebrafish. J. Vis. Exp. (45), e2351 (2010).
- Maier, S., Westenbroek, R. An unexpected role for brain-type sodium channels in coupling of cell surface depolarization to contraction in the heart. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (6), 4073-4078 (2002).
- Shroff, S. G., Saner, D. R., Lal, R. Dynamic micromechanical properties of cultured rat atrial myocytes measured by atomic force microscopy. Am. J. Physiol. 269, 286-292 (1995).
- Domke, J., Parak, W. J., George, M., Gaub, H. E., Radmacher, M. Mapping the mechanical pulse of single cardiomyocytes with the atomic force microscope. European Biophysics Journal. 28, 179-186 (1999).
- Smith, B. A., Tolloczko, B., Martin, J. G., Grütter, P. Probing the Viscoelastic Behavior of Cultured Airway Smooth Muscle Cells with Atomic Force Microscopy: Stiffening Induced by Contractile Agonist. Biophysical Journal. 88, 2994-3007 (2005).
