Isolasjon, Kultur, og Funksjonell karakterisering av voksne musen Cardiomyoctyes

Summary

Her beskriver vi isolasjon av voksne mus cardiomyoctyes ved hjelp av en Langendorff perfusjon system. De resulterende cellene er Ca2 +-tolerant, elektrisk quiescent og kan dyrkes og transfektert med adeno-eller lentiviruses å manipulere genekspresjon. Deres funksjonalitet kan også bli analysert ved hjelp av MMSYS systemet og patch clamp-teknikker.

Abstract

Bruken av primær cardiomyocytes (CMS) i kultur har gitt et kraftig supplement til murine modeller av hjertesykdom i å fremme vår forståelse av hjertesykdom. Spesielt har muligheten til å studere ion homeostase, ionekanal funksjon, cellular oppstemthet og eksitasjon-kontraksjon kopling og deres endringer i syke forhold og av sykdomsfremkallende mutasjoner førte til betydelige innsikt i hjertesykdommer. Videre er mangelen på en tilstrekkelig udødeliggjort cellelinje for å etterligne voksen CMs, og begrensningene til neonatal CMs (som mangler mange av de strukturelle og funksjonelle biomechanics karakteristisk for voksen CMs) i kultur hemmet vår forståelse av det komplekse samspill mellom signalveier, ionekanaler og kontraktile egenskaper i den voksne hjertet styrke viktigheten av å studere voksen isolerte cardiomyocytes. Her presenterer vi metoder for isolering, kultur, manipulering av genuttrykk av adenovirus-EXPREssed proteiner og påfølgende funksjonell analyse av cardiomyocytes fra den voksne mus. Anvendelse av disse teknikker vil bidra til å utvikle mekanisk innsikt i signalveier som regulerer cellulær eksitabilitet, Ca ^{2 +-dynamikk} og kontraktilitet, og gir en mye mer fysiologisk relevant karakterisering av kardiovaskulær sykdom.

Introduction

Murine modeller av hjerte-og karsykdommer har fungert som effektive verktøy for å belyse grunnleggende sykdomsmekanismer ^1,2 samt for å identifisere potensielle terapeutiske mål ^1,3. Spesielt har bruken av både murine modeller av ervervet hjertesykdom (slik som trykk-overbelastning) ^4,5 og transgene musemodeller utvidet vår forståelse av hjertesykdommer ^6-8. Bruken av cellekulturteknikker for å undersøke signalkaskader ^3,9,10 og forandringer i individuelle proteiner som ligger til grunn cellulære eksitasjon eksitabilitet og-kontraksjon kopling i hjertet ^11-13 på nivået av den enkelte celle er supplert med in vivo-musemodeller. Imidlertid har mangelen på egnede cellelinjer som reflekterer voksen CM struktur og funksjon har vært en vesentlig begrensning. Forskere har forsøkt å løse dette ved å studere de enkelte proteiner, slik som ione-kanaler, i heterologe ekspresjonssystemer <sup> 14, og mens disse studiene har gitt oss nyttig informasjon i form av ionekanal biofysikk eller protein trafficking, utilstrekkelig representasjon av den opprinnelige mikromiljøet til CMS er en betydelig begrensning. For det andre, siden de fleste av disse heterologe celler har en moden kontraktile apparat, har det ikke vært mulig å studere kontraktile funksjon, og det komplekse samspill mellom celle eksitabilitet og sammentrekning. Av denne grunn, har forskere slått til primær kardial cellekulturer for mange av deres in vitro-funksjonsstudier. Til slutt, isolerte cardiomyocyte studier tillate vurdering av kontraktil funksjon uten konfunderende faktorer av flercellet forberedelse inkludert effekten av arr eller fibrose og fiber orientering.

Primære neonatal rotte ventrikkel cardiomyocytes (NRVMs) er relativt lett å kultur, kan være infisert med adenovirus og lentiviruses å manipulere genekspresjon ^15, ennd har derfor vært brukt med hell ^1, men har begrensninger i sin egen. Selv om de gir en fysiologisk mikromiljøet ^en og har vært arbeidshesten av signalanlegget feltet, betydelige forskjeller mellom morfologi og subcellulære organisering av NRVMs og voksne cardiomyoctyes gjøre dem en utilstrekkelig modell for etterforskningen av ioniske flussmidler og eksitasjon-kontraksjon kopling i den voksne hjertet . Mest spesielt NRVMs mangler en definitiv t-rørformet delsystem ^fire. Siden Ca ^{2 +} flux og dynamikk er kritisk avhengig av moden t-rør og sarkoplasmatisk retikulum (SR) struktur ^6, Ca ^{2 +} dynamikk og funksjonelle studier av hjertets kontraktilitet i NRVMs er ikke en nøyaktig refleksjon av disse kritiske prosesser i voksen cardiomyocytes. Videre, noen komponenter i signalveier varierer mellom neonatal og voksen mus ^9, og gir dermed en annen begrensning for å studere sykdomsprosesser og deres jegmPACT på mobilnettet oppstemthet og kontraktilitet i NRVMs. Endelig fordelingen av kontraktile maskiner fører til flerveis-og ikke-uniform celle forkorting begrenser nøyaktigheten av kontraktile målinger.

Bruken av isolerte voksen kardiomyocytter gir derfor en mer nøyaktig in vitro modellsystem. Den ekstraordinære veksten av kunnskap gjort mulig av den genetiske manipulering av mus som understreker betydningen av å skaffe funksjonelle isolerte kardiomyocytter fra mus. Faktisk, har karakterisering av voksne CMs isolert fra musemodeller belyse mange biologiske og patologiske hendelser. Isolerte CMs fra transgene musemodeller har åpnet for studier av gevinst eller tap av funksjon av proteiner på de sammentrekkende egenskapene til enkeltceller ^2,16, og levedyktighet i sykdomsmodeller som iskemi / reperfusjon ^17,18, og dermed utfyller informasjonen han fikk fra i vivo-studier påSE mus. Bruk av isolert voksen CMs fra murine modeller av ervervet hjertesykdom ^3,19,20 (for eksempel tverrgående aortic innsnevring-indusert press overbelastning, som etterligner hypertensjon eller Aortastenose) eller trening ^5,21 (for modellering fysiologisk hypertrofi) gir mulighet for undersøkelse av interaksjonen av signalkaskader innblandet i disse prosessene med cellulær eksitabilitet og eksitasjon-kontraksjon kopling på nivået av den enkelte celle. Videre, evnen til å manipulere genekspresjon ved hjelp adenovirus-drevet genuttrykk i voksen CMs gir oss muligheten til å dissekere komponentene i komplekse signalveier.

Fra en elektrofysiologisk perspektiv, har hel-celle spenning og strøm klemme eksperimenter på isolerte voksen CMs vært avgjørende i å belyse innholdet i ioniske flukser ved baseline og i ulike sykdomstilstander. På grunn av den komplekse struktur av cellemembranen, og differensial protei stillaskonstruksjoner mellom voksen CMs og NRVMs eller heterologe cellelinjer, evnen til å lappe voksne celler gir en mye bedre representasjon av effekten av visse membranproteiner, strukturelle proteiner, og ionekanal samvirkende partnere på de elektrofysiologiske komponenter av voksent hjerte.

Til tross for slike fremtredende fordeler i å studere voksen murine cardiomyocytes, isolering og dyrking av voksne mus cardiomyocytes har vært utfordrende, oppfordret behovet for en systematisk og nøyaktig beskrivelse av metoden for å isolere levedyktige mus cardiomyocytes og å opprettholde dem i kultur for å tillate ytterligere genetisk manipulasjon ved hjelp av viral vektorer. Tidligere studier har brukt enten akutt isolert mus voksen CMs eller kultivert rotte voksen CMS. Sistnevnte er lettere å kultur enn voksen mus CMS, og de ​​fleste eksperimenter manipulere genekspresjon in vitro har brukt rotte voksen CMS. Få studier har blitt endret og undersøkt funksjonelleonal genekspresjon i mus voksen CMs, presentere en stor begrensning på omfanget av eksperimenter. Derfor, her presenterer vi i detalj slike metoder, endret fra tidligere undersøkelser, for isolering ^7,8,22, kultur ^3,10,15,23, adenovirus infeksjon ^11-13,15, og funksjonell analyse av voksen mus ventrikulære cardiomyoctyes. Denne isolasjonen protokollresultatene i Ca ^{2 +-tolerante,} hissige cardiomyocytes at vi har lykkes dyrket i opptil 72 timer, og forbigående tilført med adenovirus. Funksjonaliteten til disse isolerte celler kan vurderes ved hjelp av MMSYS imaging system ^14,24 og patch clamp, som også vil bli diskutert.

Protocol

En. Cardiomyocyte Isolation Materialer (Figur 1) Microdissecting tang Tissue tang Delikat hemostatic tang Hemostatic tang Microdissecting, taggete, buede tang Drifts saks, rett Drifts saks, buet 15 ml Falcon-rør (5) 60 mm petriskål Fosfatbufret saltvann (PBS) Nylon Mesh – 400 mikrometer porestørrelse Liten trakt Voksbelagte, flettet silke 4-0, 19 mm, 7-10 cm lang…

Representative Results

Isoleringen av voksne cardiomyoctyes resulterer i stavformede, tverrstripet, og hvilende (ikke spontant slo) celler (Figur 5A). Døde celler vil let avrundet og ingen striper vil være til stede. Hvile celler kan være kultivert og tilført med adenovirus å manipulere genekspresjon (Tall 5B og 5C). Etter 24 timer av kultur, ikke morfologi av levende celler ikke endre, er de fortsatt Ca 2 +-tolerant, og de ​​kan være tempoet etter felt stimulering. Med d…

Discussion

I denne rapporten har vi beskrevet de nødvendige teknikker for vellykket isolasjon og kultur av voksen CMs fra musen hjertet. Vår teknikk som gjør det mulig for etterfølgende undersøkelse av CM funksjon og eksitabilitet ved hjelp av metodene som er beskrevet ovenfor. Den kritiske parameter for å studere funksjonen av voksen CMs er helse-og kvaliteten av det isolerte CMs. Som beskrevet ovenfor, våre teknikker gjør det mulig for et høyt utbytte av funksjonelle celler som er mottagelig for manipulering av genekspr…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Sodium Chloride	Sigma	S7653
Potassium Chloride	Sigma	P9333
Magnesium Chloride	Sigma	M8266
HEPES	Sigma	H3375
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma	S8282
D-glucose minimum	Sigma	G8270
Taurine	Sigma	T0625
2,3-Butanedione monoxime	Sigma	B0752
Collagenase B	Roche Applied Science	11088807001
Collagenase D	Roche Applied Science	11088858001
Protease XIV from Streptomyces griseus	Sigma	P5147
Albumin from Bovine Serum	Sigma	A2153
Calcium Chloride	Sigma	C8106
Minimum Essential Media	Sigma	51411C
Albumin solution from bovine serum	Sigma	A8412
L-glutamine	Sigma	G3126
Penicillin-Streptomycin	Sigma	P4333
Insulin-transferrin-sodium selenite media supplement	Sigma	I1884
Cesium Chloride	Sigma	289329
Glutamate	Sigma	G3291
Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt	Sigma	A9187
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid	Sigma	E3889
Cesium Hydroxide Solution	Sigma	232041
Tetraethylammonium hydroxide solution	Sigma	86643
OptiVisor optical glass binocular visor	Dohegan Optical Company Inc.	N/A
Tissue forceps, 5.5″, 1×2 teeth	Roboz Scientific	RS-8164
Moloney forceps – 4.5″ (11.5 cm) long slight curve, serrated	Roboz Scientific	RS-8254
Dumont #3 Forceps, Dumostar, tip size 0.17 x 0.10mm	Roboz Scientific	RS-4966
Packer Mosquito Forceps 5″ Straight Flat	Roboz Scientific	RS-7114
Micro Dissecting Scissors 4.5″ Curved Sharp/Sharp	Roboz Scientific	RS-5917
Micro Dissecting Scissors 3.5″ Straight Sharp/Sharp20mm	Roboz Scientific	RS-5907