Slice культур облегчения манипуляций развития эмбриона путем генной и фармакологической возмущения. Тем не менее, культура условия должны обеспечить нормальное развитие может продолжаться в течение уменьшить среды срез. Проиллюстрируем это протокол, который способствует нормальному развитию спинной шнур продолжаться в течение по крайней мере 24 часов.
Slice культур может облегчить манипуляции развития эмбриона и фармакологически, и через генной манипуляции. В этом приведенная система, потенциальные смертельные побочные эффекты, в связи с системными приложениями препарат может быть преодолен. Тем не менее, культура условия должны обеспечить нормальное развитие идет по сниженной среду срез. Мы сосредоточились на развитии спинного мозга, в частности, что из нейронов спинного мозга двигателя. Мы систематически изменять условия культивирования кусочков куриного эмбриона от точки, в которой большинство нейронов спинного мозга двигатель был рожден. Мы анализировали количество и тип моторных нейронов, которые выжили в период культуре и позиция тех моторных нейронов по сравнению с, что в естественных условиях. Мы обнаружили, что сыворотка типа и нейротрофических факторов должны были в течение периода культивирования и смогли сохранить моторных нейронов жив по крайней мере, 24 часа в сутки и позволит тем моторных нейронов перейти на соответствующие должности вспинного мозга. Мы представляем эти условия культивирования и методологии подготовки эмбрионов срез культур с использованием куриных эмбрионов потрошился встроенные в агарозном и нарезанный использованием vibratome.
Во время нормального развития эмбриона, много различных типов клеток генерируются, которые должны мигрировать с их точки происхождения, где они в конечном итоге работает в зрелом организме. В развивающихся спинного мозга, клеток-предшественников расположены в вентрикулярной зоне в средней линии и генерировать много подтипов постмитотических нейронов и глиальных клеток, которые должны мигрировать к интеграции в функциональных нейронных цепей необходимых для обработки сенсорных и моторных выходов 1. Спинной моторные нейроны, которые контролируют сокращения мышц конечностей были тщательно изучены и многое известно о молекулах и механизмов, которые управляют формированием их различных подклассов. Тем не менее, известно гораздо меньше механизмов, с помощью которых моторные нейроны мигрируют, разделения и получать синаптических входов.
Двигательного нейрона подтипа личности, приобретенных в течение развития в иерархическом порядке. Двигательного нейрона подтипы могут быть широко классифицированы яNto различных столбцов, отделов и бассейны, которые определяются их проекции аксонов. Мотор колонны проекта аксоны либо осевой, висцеральный или мышц конечностей. Мотор подразделений разделить конечностей проектирование моторных нейронов бокового столбца двигателя (БМО) в тех проектирования до живота или спины мышцы 2. В подразделений, групп моторных нейронов называется проект двигателя бассейнов отдельных мышц конечностей 2, 3. Limb-проектирования моторных нейронов определяются их выражение фактор транскрипции Foxp1 4, 5, в то время как дивизии личность характеризуется выражением гомеодоменовых транскрипционных факторов Иле-1 (проектирование снизу) или LHX-1 (проектирование сверху) 6. Действительно, LHX-1 выражения, необходимые для соответствующего спинной проекции моторных нейронов 7. Каждый из этих подтипов занимают различные должности в спинном мозге, брюшной проектирование двигательных нейронов приходят на проживание медиальнее сверху projectiнг моторных нейронов. Это приводит к LMC быть разделены на так называемые LMCmedial (LMCm) и LMClateral (LMCl) подразделений. Ведомственные и автомобильного парка организация приобрела в два этапа 8. На первом этапе, отделов сегрегация осуществляется через миграцию моторных нейронов в характерной медиальнее бокового моды. LMCl клетки образуются после LMCm клетки и так LMCl мигрирует через LMCm достичь своей окончательной позиции расселения. На втором этапе происходит моторных нейронов в разделении и кластеров их в двигатель бассейны нейронов, предположительно, через спинной-вентральной сортировки моторных нейронов. Члены катенин-зависимых классической семьи кадгерина было показано, что решающее значение для обеих фазах двигательного нейрона 8-10 организации. Однако, как кадгерина функция управляет клеточного движения еще плохо изучены.
Приобретение столбчатые, отделов и бассейн тождества требует внешних сигналов, что картина intrinsiС экспрессии транскрипционных факторов 11. Кроме того, около 50% всех моторных нейронов умереть через апоптоз во время нормального развития в процесс, который требует внешних сигналов от конечностей, в основном за счет нейротрофических поддержку выживание двигательных нейронов. Таким образом, двигательный нейрон развития требует соответствующих условий будет поддерживаться в течение относительно длительного timecourse. По этой причине, практические аспекты создания спинного культур срез кабеля для поддержания двигательных нейронов выживания требуют выяснения соответствующих условий культуры. Предыдущий культур срез зародыша были использованы, чтобы следить за поведением внешне добавил очищенной популяции нейронов 12-14. Однако, по нашим сведениям культуры условий, способствующих на месте двигательных нейронов выживания и миграции в себе кусочек не были опубликованы. Мы изменили стандартное условие культуры, которая способствует выживанию очищают, диссоциированных черепных моторных нейронов для облегчения мOTOR нейрона развития в системе культуры срез зародыша. Мы также следили за позиционирование сохранившихся двигательных нейронов и продемонстрировать, что в значительной степени нормальное положение двигательного нейрона подразделениями, приобретенных в течение периода культивирования.
Протокол, описанный здесь, позволяет кусочек куриного эмбриона для инкубировали в течение более одного дня, в то время сохранение моторных нейронов живы и продолжают мигрировать в течение периода культивирования. В выяснении условий держать моторные нейроны живы, мы определили несколько ключевых особенностей требуется. Кажется, что до 4% куриных сыворотки имеет решающее значение для выживания моторных нейронов и замена ее с сывороткой разных видов не допускается. Интересно, мы обнаружили, что наличие высокой концентрации сыворотки наносят ущерб ломтиками, поскольку они способствовали разрастание ткани, ведущее к валовым искажений в срезе форму. Более того, присутствие цилиарной нейротрофический фактор также оказалась критической. Остается вероятность, что кусочки могут быть культивировали в течение значительно более длительный период, чем просто 24 часа в сутки, может быть, даже с учетом визуализации сенсорных афферентного входа в спинной мозг. Кроме того, культуратуры условия здесь могут также оказаться полезными для нарезки культура развивается ствола мозга и среднего мозга / мозжечка.
Возможно, самая большая потенциальная выгода в использовании этих условиях срез культуры в том, что они облегчают возможность фармакологической манипуляции функции белка, минимизируя возможность неблагоприятного воздействия на остальную часть зародыша, таких как сердце. Большое количество ингибиторов и агонисты различные сигнальные пути могут быть использованы для оценки миграции различных подтипа нейронов спинного и, возможно, их влияние на формирование местных спинного схемы в процессе разработки. Кроме того, некоторые генетические возмущения экспрессии белка, такие как те, которые делают использование siRNAs и морфолино олигонуклеотиды, страдают от того, что они могут быть введены только на ранних стадиях развития (из-за ограничений в области в яйце процедуры электропорации) и влияние лишь в течение короткий период тиме (обычно один день). Наша часть культуры началось на более поздних этапах и дает возможность использовать эту технологию позднее в развитии на стадии нарезки, чтобы просмотреть их последствий в период культуре срез.
Протокол срез культуры может также позволить визуализации и спинного двигательный нейрон, а также спинной миграции интернейронов в режиме реального времени с помощью покадровой видео микроскопии. Это может быть достигнуто с помощью фазово-контрастной микроскопии при дневном свете или с помощью флуоресцентной микроскопии. Если последний техники должны были быть использованы то введение флуоресцентных меток не требуется. Это может быть достигнуто либо путем введения флуоресцентных красителей, таких как DiI или DIO либо через ретроградной маркировки из конечностей или антероградной маркировки из желудочка или в яйце электропорации конструкций ездить флуоресцентных белков в подмножество нейронов.
The authors have nothing to disclose.
Мы хотели бы поблагодарить Шарон Boast за многочисленные обсуждения проницательный и B. Novitch за добрые дар антител к Foxp1. Эта работа финансируется за счет студенчества из Wellcome Trust, чтобы KCT и проект грант от Wellcome Trust в SRP (грант идентификационный номер 094399/B/10/Z).
Eggs | Henry Stewart Farms, UK | Fertilised Brown Bovan Gold Hen’s eggs (Henry Stewart Farms, UK), stored at 14 °C until incubation | |
21 Gauge needle | BD-Microlance-3 | 304432 | |
5 ml syringe | BD Plastipak | 302187 | |
#5 Dumont forceps | Roboz | RS 5045 | |
Micro Dissecting scissors | Roboz | RS 5910SC | (3.5 in straight) |
Embryo embedding moulds: Peel away moulds | Agar Scientific | G3764 | Pyramidal shaped 22 mm to 12 mm |
Super glue | Power Flex, Loctite | ||
Ethanol | SIGMA | 32221 | |
Sodium di-hydrogen Phosphate, mono-hydrate | BDH | 102454R | |
Di Sodium mono-hydrogen Phosphate | VWR/ BDH | 102494C | |
Sodium Chloride | VWR/BDH | 27810.295 | |
Low melting temperature agarose | Invitrogen | 16520 | |
Fetal Bovine serum | Gibco | 10500-064 | |
Triton X-100 | SIGMA | T8787 | |
Sodium Hydroxide | FLUKA | 71689 | |
Paraformaldehyde | VWR/BDH | 28794.295 | |
Plastic disposable pasteur pipettes | ElKay Precision laboratory consumables | 127-P503-000 | Liquipette 3 ml volume |
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14170 | |
Sucrose | SIGMA | S0389 | |
Sodium Hydrogen Carbonate | SIGMA | S5761 | |
Chicken Embryo Extract | Seralabs | CE650-J | |
Penicillin/ Streptomycin solution | Gibco | 15070 | |
L-Glutamine solution | Gibco | 25030 | |
2-mercaptoethanol | Gibco | 21985 | |
Horse serum | Southern Group Labs | 9028B | |
B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
Neurobasal medium | Gibco | Cat ~ 2103 | |
CilliaryNeurotrophic factor (CNTF) | R and D Systems | 557-NT-010 | |
Chick Serum | SIGMA | C5405 | |
Primary antibodies | were purchased from Developmental Studies Hybridoma Bank, with the exception of anti-foxP1 antibodies, which were a kind gift from Bennett Novitch of UCLA. Primary antibodies dilutions were Rabbit anti-FoxP1 (1/32000), Mouse anti-Lhx1/2 (4F2) (1/50), Guinea Pig anti-FoxP1 (1/1000). All antibodies were stored at 4 °C. |
||
Secondary antibodies | Donkey anti-Guinea Pig (cy3) (1:1000) purchased from Jackson Immunoreseach Laboratories Inc. Donkey anti-Mouse (Alexa Fluor 488) (1:1000), Donkey anti-Rabbit (Alexa Fluor 594) (1:1000) purchased from Invitrogen All antibodies were stored at 4 °C. |
||
24-well plate | Corning COSTAR | 3473 | ultralow attachment 24-well plate |
O.C.T. | Tissue Tek, Sakura | 4583 | Optimum Cutting Temperature |
Vectashield | Vector Labs | H1000 | Vectashield fluorescent mounting medium |
Slides | Thermo Scientific | Superfrost-Plus positively-charged slides, 25 x 75 x 1.0 mm | |
Cover Glass | VWR International | 631-0167 | 25×60 mm |
Forced draft incubator: | Lyon Electric Company | kept humid by ensuring water levels always sufficient, maintained at 38 °C | |
Cryostat | Brite, Huntingdon, UK | -36 °C | |
Tissue Culture Incubator | DH Autoflow | Nuaire 38 °C, 5% CO2 | |
Vibratome | Leica | Leica VT1000-S | |
Microscope | Nikon | Nikon Eclipse E80i fluorescence microscope | |
Digital Camera | Nikon | Nikon DS5M and Hamammatsu ORCA ER |