切片文化促进胚胎发育的基因和药理学的扰动操作。然而,文化条件必须确保可以继续正常发展的片内减少环境。我们说明了一个协议,有利于脊髓发育正常进行至少24小时。
切片培养的胚胎发育可以方便的操作都通过药理学和基因操作。这降低了系统潜在的致命的副作用,由于全身药物的应用是可以克服的。然而,文化条件必须确保正常发展所得的片内减少环境。我们一直专注于脊髓的发展,尤其是脊髓运动神经元。我们系统地不同的培养条件的鸡胚胎切片,的点最脊髓运动神经元诞生了。我们测定存活培养期间和运动神经元的位置的那些相比, 在体内的运动神经元的数目和类型。我们发现,培养期间需要血清型和神经营养因子,并能够保持为至少24小时,并允许这些运动神经元迁移到适当的位置中的运动神经元存活脊髓。我们提出这些培养条件和方法,准备使用嵌入在琼脂糖全净膛鸡胚胎的胚胎切片文化和切片用一个vibratome。
在正常胚胎发育过程中,许多不同类型的细胞生成,必须从他们的角度原产地迁移,在那里他们将最终在成熟的有机体的功能。脊髓内的显影,在中线位于脑室区祖细胞,并生成许多亚型的有丝分裂后的神经元和神经胶质细胞,这些细胞必须迁移到融入功能的神经元的感官处理所需的电路和电机输出1。脊髓运动神经元控制四肢肌肉的收缩已被广泛研究,多是已知的分子和机制,推动形成不同的子类。然而,更何况是运动神经元迁移,分离和接收突触输入的机制。
运动神经元亚型的身份获得在开发过程中在一个分层的方式。运动神经元亚型可大致归我置身于不同的列,被定义为他们的轴突预测的部门和游泳池。汽车列项目轴突为轴向,内脏或四肢的肌肉。汽车部门细分的肢体投影到那些投射到腹部或背部肌肉的运动神经元电机外侧柱(LMC)。运动神经元群内的部门,被称为电机池项目单独的肌肉,肢体的2,3。肢体突出的运动神经元中定义的由它们的表达的转录因子FOXP1 4,5,而分割的身份是其特征在于,表达的同源结构域的转录因子胰岛-1(腹侧凸)或LHX-1(背侧凸)6。事实上,LHX-1的表达所需的适当的背突起的运动神经元7。这些亚型占据不同的位置,在脊髓腹侧突出的运动神经元来居住内侧背投影法纳克运动神经元。结果被隔离在大麦哲伦星云所谓的LMCmedial(LMCm)和LMClateral(LMCl)部门。池组织部门和电机的收购分为两个阶段8。在第一阶段中,分割偏析实现通过侧向时尚内侧的特性的运动神经元的迁移。 LMCl细胞后,将产生的LMCm细胞等LMCl的通过的LMCm移动实现其最终停留位置。第二阶段运动神经元内的分工和集群成运动神经元池,大概是通过一个背腹排序,运动神经元。已经示出连环蛋白依赖的古典钙粘蛋白家族的成员,是至关重要的两个阶段的运动神经元组织8-10。然而,钙粘蛋白功能如何控制细胞运动知之甚少。
收购柱状,部门和池标识需要外在的信号,这种模式本质安全C表达的转录因子11。此外,约50%的运动神经元死亡通过细胞凋亡在正常发展的一个过程,需要从肢体的外在信号,主要是通过神经营养支持的运动神经元生存。因此,运动神经元的发展,需要适当的环境,以保持在一个相对长的时间过程。出于这个原因,产生脊髓切片培养的实用性,以保持运动神经元存活所需要的适当的培养条件下的澄清。往前的胚胎切片培养已被用于跟踪的行为非本质加入纯化的神经元群体的12-14。然而,据我们所知,在片本身在原地运动神经元的存活和迁移的培养条件,促进尚未公布。我们修改一个标准的文化条件,有利于生存的纯化,分离颅运动神经元,以方便米OTOR神经元内的胚胎切片文化系统的发展。我们还监测了定位尚存的运动神经元的,并表明主要为正常的位置的运动神经元师培养期间获取。
这里所描述的协议允许的鸡胚胎切片保温一天以上,同时保持运动神经元的存活,并继续培养期间迁移。在阐明的条件,以保持运动神经元的存活,我们已经确定了几个主要特点。高达4%的小鸡血清它似乎是关键的运动神经元的生存和它的替换与来自不同物种的血清是不能容忍的。有趣的是,我们发现,较高浓度的血清的存在下,不利的,因为它们促进导致严重扭曲切片中的形状的组织过度生长的切片。神经营养因子cilliary的存在下,更重要的是,也被证明是至关重要的。它仍然是一个明显的可能性,可能可以相当长的时间,比只是24小时进行培养,甚至允许可视化感觉传入输入到脊髓切片。此外,CULTURE条件,也可能是有用的切片文化的发展脑干和中脑/小脑。
或许这些切片的培养条件下,在使用的最大的潜在的好处是,它们促进蛋白质的功能,同时尽量减少潜在的胚胎的其余部分上的不利影响,如心脏药理操纵的可能性。大量的不同的信号通路抑制剂和激动剂可用于评估不同的脊髓神经元亚型的迁移和潜在的,他们在开发过程中形成的局部脊髓电路的影响。此外,一些基因蛋白的表达,如那些利用siRNA和吗啉代寡核苷酸,受到扰动的事实,他们只能在开发初期推出(中在OVO电过程碍于)和效果只持续短期内添E(通常为一天)。我们的片文化在稍后阶段开始,并让使用这种技术的可能性在发展期间,文化的切片切片阶段,以查看效果。
片培养协议,也可以让双方脊髓运动神经元,以及作为背interneuron的迁移时间的推移实时通过视频显微镜的可视化。这可以实现白色光下使用相差显微镜或通过使用荧光成像。如果后者的技术被使用,则需要引入荧光标记。这可能通过引入如荧光染料DiI荧光或DIO来实现,也可以通过任逆行标记从肢体或顺行标签从心室或卵内的电驱动荧光蛋白,在神经元的一个子集的结构。
The authors have nothing to disclose.
我们想了很多精辟的讨论和B Novitch抗体的一种恩赐,感谢沙龙大话FOXP1。资助这项工作从威康信托基金会的助学金KCT和SRP(的格兰特参考号094399/B/10/Z)从威康信托基金会的项目资助。
Eggs | Henry Stewart Farms, UK | Fertilised Brown Bovan Gold Hen’s eggs (Henry Stewart Farms, UK), stored at 14 °C until incubation | |
21 Gauge needle | BD-Microlance-3 | 304432 | |
5 ml syringe | BD Plastipak | 302187 | |
#5 Dumont forceps | Roboz | RS 5045 | |
Micro Dissecting scissors | Roboz | RS 5910SC | (3.5 in straight) |
Embryo embedding moulds: Peel away moulds | Agar Scientific | G3764 | Pyramidal shaped 22 mm to 12 mm |
Super glue | Power Flex, Loctite | ||
Ethanol | SIGMA | 32221 | |
Sodium di-hydrogen Phosphate, mono-hydrate | BDH | 102454R | |
Di Sodium mono-hydrogen Phosphate | VWR/ BDH | 102494C | |
Sodium Chloride | VWR/BDH | 27810.295 | |
Low melting temperature agarose | Invitrogen | 16520 | |
Fetal Bovine serum | Gibco | 10500-064 | |
Triton X-100 | SIGMA | T8787 | |
Sodium Hydroxide | FLUKA | 71689 | |
Paraformaldehyde | VWR/BDH | 28794.295 | |
Plastic disposable pasteur pipettes | ElKay Precision laboratory consumables | 127-P503-000 | Liquipette 3 ml volume |
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14170 | |
Sucrose | SIGMA | S0389 | |
Sodium Hydrogen Carbonate | SIGMA | S5761 | |
Chicken Embryo Extract | Seralabs | CE650-J | |
Penicillin/ Streptomycin solution | Gibco | 15070 | |
L-Glutamine solution | Gibco | 25030 | |
2-mercaptoethanol | Gibco | 21985 | |
Horse serum | Southern Group Labs | 9028B | |
B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
Neurobasal medium | Gibco | Cat ~ 2103 | |
CilliaryNeurotrophic factor (CNTF) | R and D Systems | 557-NT-010 | |
Chick Serum | SIGMA | C5405 | |
Primary antibodies | were purchased from Developmental Studies Hybridoma Bank, with the exception of anti-foxP1 antibodies, which were a kind gift from Bennett Novitch of UCLA. Primary antibodies dilutions were Rabbit anti-FoxP1 (1/32000), Mouse anti-Lhx1/2 (4F2) (1/50), Guinea Pig anti-FoxP1 (1/1000). All antibodies were stored at 4 °C. |
||
Secondary antibodies | Donkey anti-Guinea Pig (cy3) (1:1000) purchased from Jackson Immunoreseach Laboratories Inc. Donkey anti-Mouse (Alexa Fluor 488) (1:1000), Donkey anti-Rabbit (Alexa Fluor 594) (1:1000) purchased from Invitrogen All antibodies were stored at 4 °C. |
||
24-well plate | Corning COSTAR | 3473 | ultralow attachment 24-well plate |
O.C.T. | Tissue Tek, Sakura | 4583 | Optimum Cutting Temperature |
Vectashield | Vector Labs | H1000 | Vectashield fluorescent mounting medium |
Slides | Thermo Scientific | Superfrost-Plus positively-charged slides, 25 x 75 x 1.0 mm | |
Cover Glass | VWR International | 631-0167 | 25×60 mm |
Forced draft incubator: | Lyon Electric Company | kept humid by ensuring water levels always sufficient, maintained at 38 °C | |
Cryostat | Brite, Huntingdon, UK | -36 °C | |
Tissue Culture Incubator | DH Autoflow | Nuaire 38 °C, 5% CO2 | |
Vibratome | Leica | Leica VT1000-S | |
Microscope | Nikon | Nikon Eclipse E80i fluorescence microscope | |
Digital Camera | Nikon | Nikon DS5M and Hamammatsu ORCA ER |