Scheibe Kulturen ermöglichen die Manipulation der Embryonalentwicklung durch Gen-und pharmakologische Störungen. Allerdings müssen Kulturbedingungen sicherzustellen, dass eine normale Entwicklung innerhalb der reduzierten Umfeld der Scheibe gehen. Wir stellen ein Protokoll, das normale Entwicklung Rückenmarks erleichtert, um für wenigstens 24 Stunden fort.
Slice-Kulturen erleichtern kann die Manipulation der Entwicklung des Embryos sowohl pharmakologisch und durch Gen-Manipulationen. In dieser reduzierten System können potenzielle tödliche Nebenwirkungen durch systemische Medikament Anwendungen überwunden werden. Allerdings muss Kulturbedingungen garantiert den normalen Entwicklung verläuft innerhalb des reduzierten Umgebung der Scheibe. Wir haben bei der Entwicklung des Rückenmarks fokussiert, insbesondere der Wirbelsäule Motoneuronen. Wir systematisch Kulturbedingungen Hühnerembryo Scheiben von dem Punkt, an dem die meisten spinalen motorischen Neuronen geboren worden war vielfältig. Wir untersucht die Anzahl und Art der Motoneuronen, die während der Züchtungsperiode und der Position jener Motoneuronen Vergleich zu der in vivo überlebt. Wir fanden, dass das Serum Art und neurotrophen Faktoren wurden während der Anzucht benötigt und konnten zu halten Motoneuronen Leben für mindestens 24 Stunden und lassen diese Motoneuronen zu entsprechenden Positionen in der MigrationRückenmark. Wir präsentieren diese Kulturbedingungen und die Methodik der Erstellung des Embryos Slice-Kulturen mit ausgeweideten Hühnerembryonen in Agarose eingebettet und geschnitten mit einem Vibratom.
Während der normalen Embryonalentwicklung werden viele verschiedene Zelltypen erzeugt, muss von ihrem Ursprungsort, wo sie schließlich im reifen Organismus funktionieren zu migrieren. Innerhalb des sich entwickelnden Rückenmarks sind Vorläuferzellen im ventrikulären Zone an der Mittellinie angeordnet und erzeugen viele Subtypen postmitotischen Neuronen und Gliazellen, die migrieren, um in funktionelle neuronale Schaltungen zur Verarbeitung sensorischer und Motorleistungen 1 erforderlich integrieren muss. Spinalen motorischen Neuronen, die die Kontraktion des Körpers Muskeln kontrollieren wurden ausgiebig untersucht und es wird viel der Moleküle und Mechanismen, die die Bildung ihrer verschiedenen Unterklassen fahren bekannt. Allerdings ist viel weniger der Mechanismen, durch die Motoneuronen zu migrieren, zu trennen und zu empfangen synaptischen Eingängen bekannt.
Motoneuronen Subtyp Identität während der Entwicklung in einer hierarchischen Weise erworben. Motor Neuron Subtypen können grob klassifiziert werden into unterschiedlichen Spalten, Abteilungen und Pools, die durch ihre Axon definiert sind. Motor Säulen Projekt Axone entweder axial, viszerale Leib oder Muskeln. Motor Abteilungen unterteilen den Schenkel vorsteht Motoneuronen des Motors seitliche Spalte (LMC) vorsteht, um in diejenigen ventralen oder dorsalen Muskeln 2. Innerhalb der Divisionen, genannt Cluster von Motoneuronen Fuhrparks Projekt einzelnen Muskeln in den Gliedmaßen 2, 3. Schenkel ragenden Motoneuronen sich durch ihre Expression des Transkriptionsfaktors FOXP1 4, 5 definiert, während Teilanmeldung Identität durch die Expression der Homöodomäne Transkriptionsfaktoren Islet-1 (ventral vorspringende) oder LHX-1 (dorsal vorspringende) 6 gekennzeichnet ist. Tatsächlich ist LHX-1-Expression für die entsprechenden dorsalen Projektionen der Motoneuronen 7 erforderlich. Jeder dieser unterschiedlichen Positionen besetzen Subtypen innerhalb des Rückenmarks; ventralen vorspringenden Motoneuronen kommen aufzuhalten medial dorsal projecting Motoneuronen. Daraus ergibt sich die LMC ist in sogenannte LMCmedial (LMCM) und LMClateral (LMCl) Divisionen getrennt. Bereichs-und Fuhrpark Organisation ist in zwei Phasen 8 erworben. In der ersten Phase wird über eine Teilanmeldung Segregation Migration von Motoneuronen in einer charakteristischen medial nach lateral Weise erreicht. Die LMCl Zellen werden nach den LMCM Zellen und so LMCl wandert durch die LMCM zu seiner endgültigen Beilegung Position zu erreichen erzeugt. Die zweite Phase dauert Motoneuronen innerhalb einer Abteilung und Clustern sie in Motoneuronen Pools, vermutlich über einen dorsal-ventral Sortierung der Motoneuronen. Mitglieder der Catenin-abhängigen klassischen Cadherin Familie erwiesen sich als entscheidend für beide Phasen der Motoneuronen Organisation 8-10. Allerdings ist, wie Cadherin-Funktion Zellbewegung steuert schlecht verstanden.
Der Erwerb von säulenförmig, Divisions-und Pool-Identitäten erfordert extrinsische Signale, dass Muster eigensicherenc Expression von Transkriptionsfaktoren 11. Zusätzlich sterben etwa 50% aller Motoneuronen über Apoptose während der normalen Entwicklung in einem Prozess, extrinsischen Signale vom Schenkel erfordert, weitgehend durch neurotrophen Unterstützung der Motoneuronen das Überleben. Somit erfordert Motoneuronen Entwicklung geeigneter Rahmenbedingungen über einen relativ langen Zeitverlauf aufrechterhalten werden. Aus diesem Grund erfordern die Durchführbarkeit des Erzeugens Rückenmarks Schnittkulturen um Motoneuronen das Überleben Aufrechterhaltung der Aufklärung von geeigneten Kulturbedingungen. Zurück Embryo Schnittkulturen sind verwendet worden, um das Verhalten von extrinsisch zugegeben gereinigt neuronale Populationen 12-14 folgen. Allerdings haben unsere Wissenskultur Bedingungen, die in situ Motoneuronen Überleben und Migration zu erleichtern innerhalb der Scheibe selbst nicht veröffentlicht worden. Wir modifizierten ein Standard-Kulturbedingungen, die das Überleben von gereinigtem erleichtert, zu dissoziierten kranialen Motoneuronen zu erleichtern motor Neuron Entwicklung innerhalb eines Embryos Kokultur-System. Auch überwacht die Positionierung der überlebenden Motoneuronen und zeigen, dass weitgehend normalen Positionen der Motoneuronen Divisionen während der Anzucht wird erworben.
Die hier beschriebene Protokoll ermöglicht einem Hühnerembryo Slice für mehr als einen Tag unter Beibehaltung Motoneuronen lebendig und weiterhin während der Anzucht migrieren inkubiert werden. In der Aufklärung der Bedingungen zu halten Motoneuronen lebendig, haben wir einige wichtige Funktionen erforderlich identifiziert. Es scheint, dass bis zu 4% chick Serum entscheidend für das Überleben von Motoneuronen und ihre Ersetzung mit Serum aus einer anderen Spezies ist wird nicht toleriert. Interessanterweise zeigte sich, dass die Anwesenheit von höheren Konzentrationen von Serum Nachteil der Scheiben, wie sie Überwachsen des Gewebes, die zu Verzerrungen im grober Form befördert Scheibe waren. Noch wichtiger ist, die Anwesenheit von cilliarer neurotrophic factor auch bewiesen kritisch. Es bleibt durchaus möglich, dass die Scheiben können möglicherweise für längere Zeiträume erheblich als nur 24 Stunden kultiviert werden, vielleicht sogar ermöglicht die Visualisierung von sensorischen afferenten Input zum Rückenmark. Zusätzlich wird die Kulturtur Bedingungen hier kann auch als nützlich erweisen, um Kulturen der Entwicklungsländer Hirnstamm und Mittelhirn / Kleinhirn schneiden.
Vielleicht die größte Potenzial bei der Verwendung dieser Scheibe Kulturbedingungen ist, dass sie die Möglichkeit für pharmakologische Manipulation Proteinfunktion gleichzeitiger Minimierung des Potentials für schädliche Wirkungen auf den Rest des Embryos, wie dem Herzen zu erleichtern. Eine große Anzahl von Inhibitoren und Agonisten der verschiedenen Signalwege verwendet werden, um die Wanderung der verschiedenen Subtypen spinalen Neuronen und möglicherweise auch deren Wirkung der Bildung lokaler spinalen Schaltungen während der Entwicklung beurteilt werden. Zusätzlich leiden einige genetische Störungen der Proteinexpression, wie jene, die die Verwendung von siRNAs und Morpholino Oligonukleotide zu machen, aus der Tatsache, dass sie nur früh in der Entwicklung eingeführt werden (aufgrund von Einschränkungen in der in-ovo-Verfahren Elektroporation) und die Effekte nur noch für eine kurze Periode des time (typischerweise ein Tag). Unsere slice Kultur wird bei späteren Stadien gestartet und bietet die Möglichkeit, diese Technologie später in der Entwicklung verwenden, um das Aufschneiden Bühne, um ihre Auswirkungen innerhalb der Periode der Kultur der Scheibe zu sehen.
Die Kokultur Protokoll könnte auch ermöglichen die Visualisierung sowohl spinale Motoneuronen sowie dorsalen Interneuronen Migration in Echtzeit über Zeitraffer-Video-Mikroskopie. Dies könnte erreicht werden mittels Phasenkontrastmikroskopie unter weißem Licht oder durch den Einsatz von Fluoreszenz-Bildgebung werden. Wenn die letztere Technik wurden dann verwendet werden die Einführung von fluoreszierenden Markierungen benötigt wird. Dies könnte entweder durch Einführung von Fluoreszenzfarbstoffen wie DiI oder DiO erreicht werden entweder über retrograde Markierung aus dem Körper oder anterograde Etikettierung vom Ventrikel oder in ovo Elektroporation von Konstrukten zur fluoreszierenden Proteine in einer Untergruppe von Neuronen anzutreiben.
The authors have nothing to disclose.
Wir möchten Sharon Boast für viele aufschlussreiche Diskussionen und B. Novitch danken für die freundliche Gabe der Antikörper an FOXP1. Diese Arbeit durch ein Stipendium aus dem Wellcome Trust KCT und ein Projekt Beihilfe des Wellcome Trust SRP (Grant Referenznummer 094399/B/10/Z) finanziert.
Eggs | Henry Stewart Farms, UK | Fertilised Brown Bovan Gold Hen’s eggs (Henry Stewart Farms, UK), stored at 14 °C until incubation | |
21 Gauge needle | BD-Microlance-3 | 304432 | |
5 ml syringe | BD Plastipak | 302187 | |
#5 Dumont forceps | Roboz | RS 5045 | |
Micro Dissecting scissors | Roboz | RS 5910SC | (3.5 in straight) |
Embryo embedding moulds: Peel away moulds | Agar Scientific | G3764 | Pyramidal shaped 22 mm to 12 mm |
Super glue | Power Flex, Loctite | ||
Ethanol | SIGMA | 32221 | |
Sodium di-hydrogen Phosphate, mono-hydrate | BDH | 102454R | |
Di Sodium mono-hydrogen Phosphate | VWR/ BDH | 102494C | |
Sodium Chloride | VWR/BDH | 27810.295 | |
Low melting temperature agarose | Invitrogen | 16520 | |
Fetal Bovine serum | Gibco | 10500-064 | |
Triton X-100 | SIGMA | T8787 | |
Sodium Hydroxide | FLUKA | 71689 | |
Paraformaldehyde | VWR/BDH | 28794.295 | |
Plastic disposable pasteur pipettes | ElKay Precision laboratory consumables | 127-P503-000 | Liquipette 3 ml volume |
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14170 | |
Sucrose | SIGMA | S0389 | |
Sodium Hydrogen Carbonate | SIGMA | S5761 | |
Chicken Embryo Extract | Seralabs | CE650-J | |
Penicillin/ Streptomycin solution | Gibco | 15070 | |
L-Glutamine solution | Gibco | 25030 | |
2-mercaptoethanol | Gibco | 21985 | |
Horse serum | Southern Group Labs | 9028B | |
B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
Neurobasal medium | Gibco | Cat ~ 2103 | |
CilliaryNeurotrophic factor (CNTF) | R and D Systems | 557-NT-010 | |
Chick Serum | SIGMA | C5405 | |
Primary antibodies | were purchased from Developmental Studies Hybridoma Bank, with the exception of anti-foxP1 antibodies, which were a kind gift from Bennett Novitch of UCLA. Primary antibodies dilutions were Rabbit anti-FoxP1 (1/32000), Mouse anti-Lhx1/2 (4F2) (1/50), Guinea Pig anti-FoxP1 (1/1000). All antibodies were stored at 4 °C. |
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Secondary antibodies | Donkey anti-Guinea Pig (cy3) (1:1000) purchased from Jackson Immunoreseach Laboratories Inc. Donkey anti-Mouse (Alexa Fluor 488) (1:1000), Donkey anti-Rabbit (Alexa Fluor 594) (1:1000) purchased from Invitrogen All antibodies were stored at 4 °C. |
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24-well plate | Corning COSTAR | 3473 | ultralow attachment 24-well plate |
O.C.T. | Tissue Tek, Sakura | 4583 | Optimum Cutting Temperature |
Vectashield | Vector Labs | H1000 | Vectashield fluorescent mounting medium |
Slides | Thermo Scientific | Superfrost-Plus positively-charged slides, 25 x 75 x 1.0 mm | |
Cover Glass | VWR International | 631-0167 | 25×60 mm |
Forced draft incubator: | Lyon Electric Company | kept humid by ensuring water levels always sufficient, maintained at 38 °C | |
Cryostat | Brite, Huntingdon, UK | -36 °C | |
Tissue Culture Incubator | DH Autoflow | Nuaire 38 °C, 5% CO2 | |
Vibratome | Leica | Leica VT1000-S | |
Microscope | Nikon | Nikon Eclipse E80i fluorescence microscope | |
Digital Camera | Nikon | Nikon DS5M and Hamammatsu ORCA ER |