Summary

Langdurige zwijgen van Intersectin-1s in Muis Longen door Herhaalde levering van een specifiek siRNA via kationische liposomen. Evaluatie van Knockdown Effects van Electron Microscopy

Published: June 21, 2013
doi:

Summary

Herhaalde retro-orbitale injectie van kationische complexen liposomes/siRNA/ITSN-1s in muizen, elke 72 uur gedurende 24 dagen, efficiënt siRNA duplex leveren aan de muizenlong microvasculatuur verminderen ITSN 1s-mRNA en eiwitexpressie met 75%. Deze techniek is zeer reproduceerbaar in een dierlijk model, heeft geen bijwerkingen en sterfgevallen voorkomt.

Abstract

Eerdere studies toonden aan dat knockdown van ITSN-1s (KD ITSN), een endocytisch eiwit betrokken bij de regulering van long vasculaire permeabiliteit en endotheelcellen (EC) overleving, geïnduceerde apoptotische celdood, een belangrijk obstakel in de ontwikkeling van een celcultuur systeem met verlengde ITSN-1s inhibitie 1. Met behulp van kationische liposomen als dragers, we het tot zwijgen brengen van ITSN-1s-gen in de muis longen onderzocht door systemische toediening van siRNA gericht ITSN-1 gen (siRNA ITSN). Kationische liposomen bieden een aantal voordelen voor siRNA levering: veilig bij herhaalde toediening, immunogeen, niet giftig en gemakkelijk te produceren 2. Liposomen prestaties en biologische activiteit afhankelijk van hun grootte, lading, lipidensamenstelling stabiliteit, dosis en toedieningsroute 3 Here, efficiënte en specifieke KD ITSN in muizenlongen werd verkregen met een cholesterol en dimethyl dioctadecyl ammonium bromide combinatie. Intraveneuze leveringvan siRNA ITSN / kationische liposoom complexen tijdelijk neergehaald ITSN-1s eiwit en mRNA in muizenlongen op dag 3, die herstelde na nog eens 3 dagen. Profiterend van de kationische liposomen als een herhaalbare veilige drager, de studie verlengd voor 24 dagen. Dus, retro-orbitale behandeling met vers gegenereerd complexen werd toegediend elke 3e dag, induceren aanhoudende KD ITSN gehele studie 4. Muizenweefsels op verschillende tijdstippen na-siRNA ITSN verzameld werden onderworpen aan elektronenmicroscopie (EM) analyse van de effecten van chronische KD ITSN evalueren, long endotheel. Hoge-resolutie EM beeldvorming liet ons toe om de morfologische veranderingen veroorzaakt door KDITSN in de long vaatbed evalueren (dwz verstoring van de endotheliale barrière, verminderd aantal caveolae en opregulatie van alternatief vervoer routes), kenmerken niet-detecteerbaar met lichtmicroscopie. Algehele deze bevindingen opgericht een belanglangrijke rol van ITSN-1s in de EC-functie en de longen homeostase, terwijl ter illustratie van de effectiviteit van de levering siRNA-liposomen in vivo.

Introduction

Naakte siRNA bij ondoordringbare het celmembraan, wordt negatief geladen, en gemakkelijk wordt afgebroken door enzymen in het bloed, weefsels en cellen. Zelfs met recent structurele modificaties optimale stabiliteit, siRNA accumulatie op de aanbrengplaats na toediening uiterst laag en vereist een efficiënte intracellulaire voertuig 5. Kationische liposomen ontwikkeld tot veilige nucleïnezuren dragers met de mogelijkheid om grote stukken DNA / RNA te brengen in cellen door inkapselen en beschermen van de nucleïnezuren van enzymatische afbraak 6. Ook kationische liposomen spontaan interactie met DNA / RNA, waardoor genoverdracht bevorderen om de cellen 2. Meer recent liposomen toegepast op vaccins en laag molecuulgewicht drugs 7 leveren. Liposomale aflevering van microRNA-7-expressie plasmide overwint epidermale groeifactor receptor tyrosine kinase inhibitor-resistentie in longkankercellen 8. Bij het richten van devasculair endotheel, de intraveneuze levering is essentieel omdat de complexen is onwaarschijnlijk dat de endotheliale barrière te passeren en extravaseren in het interstitium 9. In vergelijking met andere organen, EC uit de capillairen van de longen hebben de grootste opname en gretig kationische liposoom internaliseren en DNA / RNA complexen, gevolgd door de lymfeknopen en Peyer's Patches 9. Intraveneuze levering in knaagdier modellen van siRNA via retro-orbitale of staartader injecties is bewezen onschadelijk, zelfs in hoge concentraties, zoals 50 mg / kg 10. In de gepubliceerde literatuur de samenstelling van kationische liposomen verschilt op basis van de lipiden formulering en hun equimolaire verhouding 11, 12. Er is een breed scala aan mogelijke toepassingen met behulp van kationische liposomen voor genafgifte in vivo, of richten down-regulation/over-expression van de eiwitten, levering van vaccins of anti-tumor therapie 13-15. Belangrijk om te onthoudenis dat de efficiëntie van DNA / RNA-celmembraan interactie wordt geregeld door de vorm koppeling tussen gegenereerd complexen en membraanlipiden. Dit suggereert dat het afstemmen van de lipiden samenstelling gerichte celmembraan profielen hoge transfectie gunstige en resulteren kan in een bepaald celtype 6.

Protocol

1. Kationische liposomen Voorbereiding Autoclaaf een schone rondbodemkolf worden gebruikt lipososmes bereiding. Bereid voorraad oplossingen: – Los 200 mg dimethyl dioctadecyl ammonium bromide (doab) in 10 ml chloroform met een klein glazen flesje. – Los 200 mg cholesterol in 10 ml chloroform met een kleine glazen fles. – Voorbereiden en autoclaaf tot 5% glucose steriliseren in 100 ml van RNA / DNA-ase vrij gedistilleerd water. Spoel de …

Representative Results

ITSN 1s-eiwit en mRNA niveaus werden gevolgd op verschillende tijdstippen na siRNA ITSN bezorging Western blot conventionele en kwantitatieve PCR zoals in 4. ITSN-1s eiwit en mRNA niveaus in siRNA ITSN behandelde muis longen waren ongeveer 75% lager aan de hand van controles tijdens de continue neerhalen van ITSN-1s voor 21 dagen. Zonder ITSN-1s, dynamine-2, een belangrijke interactie partner van ITSN-1s en essentiële speler in onthechting van caveolae uit de plasmamembraan is niet effi…

Discussion

Op basis van eerdere studies gepubliceerd door anderen 9 en ons 1, 18 we deze methodologie voor de lange termijn neerhalen van ITSN-1s in vivo door herhaalde intraveneuze toediening (om de 72 uur, gedurende 24 opeenvolgende dagen) van specifieke siRNA / liposoom complexen ontwikkeld. Deze experimentele benadering is efficiënt, veilig en herhaaldelijk gebruik en kan gemakkelijk worden uitgebreid om de betrokkenheid van een gen dat codeert voor een eiwit van interesse in de longen endotheel…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door de National Institute of Health Subsidies R01HL089462 naar SP.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number
Dimethyl Dioctadecyl Ammonium Bromide (DOAB) Sigma-Aldrich D2779
LiposoFast stabilizer (mini-extruder) Avestin Inc. LF-STB
Polycarbonate membrane, 19 mm diameter, 50 nm pore Avestin Inc. LFM-50
Cholesterol Sigma-Aldrich C-8667
Chloroform Mallinckrodt Chemicals 4432-04
Hank’s balanced salts Sigma-Aldrich H1387
Round-bottom flask Fisher Scientific FHB-275-030X
Mouse siRNAITSN – on target Dharmacon/ThermoScientific J-046912-11
Peristaltic pump Ismatec REGLO-CDF digital with RHOO pump head
Ventilator Hugo Sachs Electronik NA
Barbital Sigma-Aldrich B-0500
Uranyl acetate EM Sciences 22400
Epon812 EM Sciences Discontinued by the manufacturer
Propylene oxide EM Sciences 20400
Embedding molds EM Sciences 69923-05
Tannic acid EM Sciences 21710
8 nm gold-albumin tracer Prepared in the laboratory as in16
Comments
Equipped with 2 Avestin 1 ml gas-tight syringes (cat. # LF-1)
Pyrex, 100 ml
Modified siRNA, in vivo
Part of IDEX corp.
D-79232 March, Germany
Replaced with Embed812, cat. # 14120

References

  1. Predescu, S. A., Predescu, D. N., Knezevic, I., Klein, I. K., Malik, A. B. Intersectin-1s regulates the mitochondrial apoptotic pathway in endothelial cells. J. Biol. Chem. 282 (282), 17166-17178 (2007).
  2. Uddin, S. Cationic lipids used in non-viral gene delivery systems. Biotechnology and Molecular Biology Review. 2 (2), 58-67 (2007).
  3. Barenholz, Y., et al. Influence of lipid composition on the thermotropic behavior and size distribution of mixed cationic liposomes. J. Colloid Interface Sci. (356), 46-53 (2011).
  4. Predescu, D. N., Neamu, R., Bardita, C., Wang, M., Predescu, S. A. Impaired caveolae function and upregulation of alternative endocytic pathways induced by experimental modulation of intersectin-1s expression in mouse lung endothelium. Biochem. Res. Int.. (2012), 672705 (2012).
  5. Higuchi, Y., Kawakami, S., Hashida, M. Strategies for in vivo delivery of siRNAs: recent progress. BioDrugs. 24 (24), 195-205 (2010).
  6. Caracciolo, G., Amenitsch, H. Cationic liposome/DNA complexes: from structure to interactions with cellular membranes. Eur. Biophys. J. , (2012).
  7. Barnier Quer, C., Elsharkawy, A., Romeijn, S., Kros, A., Jiskoot, W. Cationic liposomes as adjuvants for influenza hemagglutinin: more than charge alone. Eur. J. Pharm. Biopharm. 81 (81), 294-302 (2012).
  8. Rai, K., et al. Liposomal delivery of MicroRNA-7-expressing plasmid overcomes epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor-resistance in lung cancer cells. Mol. Cancer Ther. (10), 1720-1727 (2011).
  9. McLean, J. W., et al. Organ-specific endothelial cell uptake of cationic liposome-DNA complexes in mice. Am. J. Physiol. (273), H387-H404 (1997).
  10. Soutschek, J., et al. Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs. Nature. (432), 173-178 (2004).
  11. Barenholz, Y. Liposomes enhance bioremediation of oil-contaminated soil. J. Liposome Res. (13), 1-8 (2003).
  12. Zamboni, W. C. Liposomal, nanoparticle, and conjugated formulations of anticancer agents. Clin. Cancer Res. (11), 8230-8234 (2005).
  13. Newman, M. S., Colbern, G. T., Working, P. K., Engbers, C., Amantea, M. A. Comparative pharmacokinetics, tissue distribution, and therapeutic effectiveness of cisplatin encapsulated in long-circulating, pegylated liposomes (SPI-077) in tumor-bearing mice. Cancer Chemother Pharmacol. (43), 1-7 (1999).
  14. Martino, S., et al. Efficient siRNA delivery by the cationic liposome DOTAP in human hematopoietic stem cells differentiating into dendritic cells. J. Biomed. Biotechnol. (2009), 410260 (2009).
  15. Zhang, G., et al. A delivery system targeting bone formation surfaces to facilitate RNAi-based anabolic therapy. Nat. Med. 18 (18), 307-314 (2012).
  16. Predescu, D., Palade, G. E. Plasmalemmal vesicles represent the large pore system of continuous microvascular endothelium. Am. J. Physiol. (265), H725-H733 (1993).
  17. Koh, T. W., Verstreken, P., Bellen, H. J. Dap160/intersectin acts as a stabilizing scaffold required for synaptic development and vesicle endocytosis. Neuron. (43), 193-205 (2004).
  18. Miyawaki-Shimizu, K., et al. . Lung Cell Mol. Physiol. (290), L405-L413 (2006).

Play Video

Cite This Article
Bardita, C., Predescu, D., Predescu, S. Long-term Silencing of Intersectin-1s in Mouse Lungs by Repeated Delivery of a Specific siRNA via Cationic Liposomes. Evaluation of Knockdown Effects by Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (76), e50316, doi:10.3791/50316 (2013).

View Video