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Biology

Langfristige Silencing von Intersectin-1s in Mauslungen von wiederkehrenden Lieferung eines spezifischen siRNA durch kationische Liposomen. Auswertung der Knockdown Effects Electron Microscopy

Published: June 21, 2013 doi: 10.3791/50316
Automatic Translation
*1, *1,2, 1,2
1Department of Pharmacology, Rush University, 2Pulmonary and Critical Care Department, Rush University
* These authors contributed equally

Summary

Wiederholte retroorbitalen Injektionen kationische liposomes/siRNA/ITSN-1s Komplexe in Mäusen, alle 72 Stunden für 24 Tage, effizient die siRNA-Duplex zum Mauslunge Mikrovaskulatur Reduzierung ITSN-1s mRNA und Protein-Expression von 75%. Diese Technik ist in hohem Maße reproduzierbar in einem Tiermodell, hat keine Nebenwirkungen und Todesfälle verhindert.

Abstract

Frühere Studien zeigten, dass Knockdown von ITSN-1s (KD ITSN), ein Protein, das in der Regulierung endozytischen Lunge vaskulären Permeabilität und Endothelzellen (ECs) Überleben, induzierte Apoptose, ein wesentliches Hindernis bei der Entwicklung eines Zellkultur-System mit längerer ITSN-1s beteiligt Hemmung 1. Mit kationische Liposomen als Träger, erkundeten wir die Silencing ITSN-1s-Gen in der Maus Lunge durch systemische Verabreichung von siRNA Targeting ITSN-1-Gen (siRNA ITSN). Kationische Liposomen bieten mehrere Vorteile für siRNA Lieferung: Safe mit wiederholter Gabe, nicht immunogen, ungiftig und einfach zu 2 zu erzeugen. Liposomen Leistung und biologische Aktivität von ihrer Größe, Ladung, Lipid-Zusammensetzung, Stabilität, Dosis und Art der Verabreichung 3 Hier eine effiziente und spezifische KD ITSN in Mauslungen wurde unter Verwendung eines Cholesterin-und Dimethyl Dioctadecyl ammoniumbromid Kombination ab. Intravenöse Verabreichungvon siRNA ITSN / kationische Liposomen-Komplexe vorübergehend abgerissen ITSN-1s Protein und mRNA in Mauslungen am Tag 3, die nach weiteren 3 Tagen wiedergefunden. Unter Ausnutzung der kationische Liposomen als wiederholbare sichere Fluggesellschaft, erweitert die Studie für 24 Tage. So wurde retroorbitalen Behandlung mit frisch erzeugten Komplexe verabreicht jeden 3. Tag, induzieren anhaltende KD ITSN während der Studie 4. Maus-Gewebe an mehreren Zeitpunkten nach der siRNA ITSN gesammelt wurden elektronenmikroskopische (EM)-Analysen unterzogen, um die Wirkung einer chronischen KD ITSN auszuwerten, Lunge Endothel. Hochauflösende EM Bildgebung erlaubt es uns, die morphologischen Veränderungen durch KDITSN in der Lunge Gefäßsystem verursacht bewerten (dh Störung der endothelialen Barriere, verringerte Anzahl von Caveolae und Hochregulation alternative Transportwege), Eigenschaften nicht nachweisbar durch Lichtmikroskopie. Insgesamt diese Erkenntnisse etabliert eine wichtigewichtige Rolle von ITSN-1s in der ECs Funktion und Lunge Homöostase, während, die die Wirksamkeit von siRNA-Liposomen Lieferung in vivo.

Introduction

Nackte siRNA kann nicht durch die Zellmembran, das negativ geladen ist, und es ist leicht durch Enzyme abgebaut in Blut, Gewebe und Zellen. Selbst mit kurzem strukturelle Veränderungen, um die Stabilität zu verbessern, ist siRNA Akkumulation am Zielort nach Verabreichung äußerst gering und erfordert eine effiziente intrazelluläre Fahrzeug 5. Kationische Liposomen erwies sich als sicher Nukleinsäuren Träger mit dem Potenzial, große Stücke von DNA / RNA in Zellen übertragen durch Verkapselung und Schutz der Nukleinsäuren vor enzymatischem Abbau 6. Auch kationische Liposomen spontan interagieren mit DNA / RNA, damit die Förderung Gentransfer in die Zellen 2. In jüngerer Zeit Liposomen wurden angewendet, um Impfstoffe und niedrigem Molekulargewicht Drogen 7 liefern. Liposomal Lieferung microRNA-7-exprimierenden Plasmid überwindet epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor-Tyrosin-Kinase-Inhibitor-Resistenz in Lungenkrebszellen 8. Bei der Ausrichtung dervaskulären Endothel ist die intravenöse Verabreichung notwendig, weil die Komplexe unwahrscheinlich, dass die endotheliale Schranke und extravasieren in dem Interstitium 9 sind. Im Vergleich zu anderen Organen, ECS vom Mikrovaskulatur der Lunge haben die größte Aufnahme und eifrig verinnerlichen kationische Liposomen und DNA / RNA-Komplexen, die Lymphknoten und Peyer-Plaques 9 gefolgt. Intravenöse Lieferung in Tiermodellen der siRNA über retroorbitalen oder Schwanzvene Injektionen ist erwiesen, auch in hohen Konzentrationen, wie 50 mg / kg 10 harmlos. In der Literatur die Zusammensetzung Liposomen, unterscheidet, basierend auf der Formulierung, Lipide und deren äquimolaren Verhältnis 11, 12. Es gibt eine breite Palette von möglichen Anwendungen, die kationische Liposomen für den Gentransfer in vivo, ob Targeting down-regulation/over-expression der Proteine, die Lieferung von Impfstoffen oder Anti-Tumor-Therapien 13-15. Wichtig zu merkenist, dass die Effizienz der DNA / RNA-Zellmembran Wechselwirkung durch die Form Kopplung zwischen erzeugten Komplexe und Membranlipiden geregelt wird. Dies legt nahe, dass Anpassung der Lipide Zusammensetzung auf die gezielte Zellmembran Profilen von Vorteil sein kann und zu einer hohen Transfektionseffizienz in einem bestimmten Zelltyp 6.

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Protocol

1. Kationische Liposomen Vorbereitung

  1. Autoklav eine saubere Rundkolben für lipososmes Zubereitung verwendet werden.
  2. Bereiten Stammlösungen:
    1. - Man löst 200 mg Dimethyl-dioctadecyl Ammoniumbromid (DOAB) in 10 ml Chloroform mit einer kleinen Glasflasche.
    2. - Lösen Sie 200 mg Cholesterin in 10 ml Chloroform mit einer kleinen Glasflasche.
    3. - Vorbereitung und Autoklaven auf 5% Glucose in 100 ml RNA / DNA-ase kostenlos destilliertem Wasser zu sterilisieren.
  3. Spülen Sie den Rundkolben mit Chloroform. In 5-10 ml in den Kolben, Wirbel, und lassen Sie es sich für ein paar Minuten. Halten Sie den Kolben mit Aluminiumfolie jederzeit gesichert. Leeren Sie das Chloroform aus dem Kolben.
  4. Herstellung von Liposomen:
    1. - In 315 ul DOAB Stammlösung der Rundkolben.
    2. - In 200 ul Cholesterin stock Lösung in den Kolben.
    3. - Fügen Sie 9,5 ml Chloroform in den Kolben einnd mischen durch schwenken.
  5. Stellen Sie den Rotationsverdampfer bei 37 ° C, 100 Umdrehungen pro Minute (rpm) oder mehr (100-120 rpm). Der Rotationsverdampfer sollte zu einem Wasserstrahlvakuum Steuerung mit einem Saugrohr richtig befestigt angeschlossen werden.
  6. Schließen Sie das Argon-Gas-Tank und die Rotavapors.
  7. Bringen Sie den Kolben an die Rotavapors und passen Sie die optimalen Einstellungen vor dem Absenken es im Wasserbad. Öffnen Sie das erste Ventil für den Argon vollständig durch Drehen gegen den Uhrzeigersinn. Immer öffnen und schließen dieses Ventil zuerst. Das zweite Ventil steuert den Argondruck Einblasen in den Kolben gegeben. Der Druck sollte immer sanft.
  8. Senken Sie den Rotationsverdampfer im Wasserbad, genug für den Kolben, um das Wasser vollständig untergetaucht, ohne zu berühren, und schalten Sie die Geschwindigkeit.
  9. Warten Sie, bis alle Chloroform verdunstet, ca. 10 min. Dann die Maschine stoppen.
  10. Schalten Sie die Geschwindigkeit und die Rotavapors Argontank Ventile. Jetzt wird der Kolben entfernt werden sollte.
  11. 2 ml 5% Glucose zu the Kolben zu lösen die Lipide.
  12. Rubbeln Sie an der Unterseite des Kolbens gründlich mit 1 ml Pipettenspitze alle Lipide aufzulösen. Nach Kratzen, entfernen Sie alle verbleibenden Lipid aus der 1 ml-Spitze in den Kolben, wenn nötig, mit einer zweiten Spitze.
  13. Inkubation der erhaltenen Lösung in 42 ° C Wasserbad während langsam Vortexen (15 rpm) die Flasche.
  14. Füllen Sie das Ultraschallgerät Bottich mit kaltem Wasser. Beschallen die Lösung für mindestens 20-30 min mit dem Kolben gehalten und der Boden gerade noch das Wasser zu berühren.
  15. Der Kolben in der Rotavapors die Wasserbad für 20 min bei 42 ° C, bei Drehzahl Null mit rundem Boden in Wasser getaucht, diesmal.
  16. Filtern Sie die Liposomen durch einen 0,47 Mikron und anschließend 0,22-Mikron-Filter Spritze.
  17. Mit einem kleinen Extruder, filtern die Liposomen durch einen 50 nm Membran, um eine homogene Population von unilamellaren Liposomen Bläschen zu erzeugen.
  18. Übertragen Sie die Liposomen zu einem Eppendorf-Röhrchen und legen Sie es auf Eis.

2. Bereiten Sie die Liposomen: siRNA-ITSN-1-Komplexe

  1. Resuspendieren Sie das On-Target-Maus siRNA ITSN in siRNA-Puffer mit 20 mM HEPES und 150 mM Natriumchlorid, pH 7,4, auf eine Endkonzentration von 2 pg / pl. Halten Sie es vor dem Mischen auf Eis.
  2. Bereiten Sie die Liposomen: siRNA ITSN Komplexe in einem Verhältnis von 8 nmol Liposomen: 2 ug RNA (oder 400 nmol Liposomen: 100 ug siRNA ITSN). In der vorliegenden Studie haben wir 50 ul siRNA ITSN aus der Stammlösung (50 &mgr; M) zu 100 ul frisch zubereitet Liposomen mit einem RNA / DNA-ase kostenlos Eppendorf-Röhrchen. Beachten Sie, dass die Konzentration von siRNA ITSN sehr wichtig ist, weil ein Maximum von 150 ul Mischung bilateral und retroorbitalen injizierten in der Maus sein kann, auf einmal.
  3. Halten Sie die Mischung auf Eis während der Wartezeit, um die Mäuse zu injizieren.

3. Maus Retro-Orbital-Injektion (Internal Winkel der Augenhöhle)

jove_content "> Alle Mausexperimenten genehmigt wurden und in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Rush University Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss durchgeführt.

  1. Anesthetize der Maus durch intraperitoneale Injektion einer 50 mg / kg Körpergewicht Ketamin und 5 mg / kg Körpergewicht Xylazin (im Handel erhältlich Mischung). Je nach Gewicht des Tieres und das Alter, passen Sie die Lautstärke Anästhetika und Konzentration. Die Mäuse in der Studie verwendeten Mäuse sind CD1 männliche Mäuse, 6-8 Wochen alt und wiegen rund 25 Gramm. Die Spritzen sind Tuberkulin 1 ml Typ mit der Nadel.
  2. Halten Maus Ohren mit einer Hand und drehen Sie die Maus nach unten auf einer Seite, um die interne Augenwinkel freizulegen. Richten medial der Plica semilunaris; berühren den Augapfel.
  3. Nähern der Tränenflüssigkeit des Auges caruncle Halten der Spritze, die das Gemisch in einem 45 Grad Winkel in allen drei Achsen.
  4. Langsam spritzen die Mischung und lassen Sie die Maus, um mit dem injizierten Seite erholen sich. Wenn eine große FlüssigkeitTröpfchen bildet sich an der Nadeleinführung Platz einfahren Nadel-, Saug-back der Tropfen in die Spritze und versuchen Sie es erneut. Wiederholte Injektionen werden am besten durch abwechselnd die Augen getan, um eine perfekte Erholung zu ermöglichen. Wenn Sie unsicher sind, kann diese Technik durch die Injektion von blauem Farbstoff (50 ul, 0,5% Kristallviolett in Methanol) und das Aussetzen der Maus Lunge, um den blauen Gefäßsystem beobachten überprüft werden.
  5. Die Mäuse wurden in dieser Studie injiziert wird jeden 3. Tag für 3 Wochen ohne Todesfälle oder unerwünschte Nebenwirkungen.

4. Maus Lung Perfusion und Tissue Collection für biochemische Studien

  1. Stellen Sie die Schlauchpumpe auf 1,5 ml / min laufen.
  2. Bereiten Sie die Einstellung: Ventilator, OP-Tisch, Instrumente, sterile Wattestäbchen, Q-Tips, Strings, Bechern, destilliertes Wasser, Hanks balanced salt, Tracer.
  3. Anesthetize die Maus durch intraperitoneale Injektion des Narkosemittels Gemisch (100 mg / kg Körpergewicht Ketamin und 10 mg / kg Körpergewicht Xylazin). An der Höhe des Halses, entfernen Sie die Speicheldrüsen und setzen die Luftröhre.
  4. Beginnen Sie mit Bauchschnitt, Verbrauchssteuern das Zwerchfell, und folgen mit Thorakotomie, Aussetzen der Lunge und das Herz.
  5. Entfernen Sie die Thymus.
  6. Mit der Lichtmikroskopie für eine bessere Genauigkeit, catheterize die Lungenarterie.
  7. Haben Tracheotomie und Intubation mit der Maus über das Tracheostoma. Stellen Sie den Ventilator zu einer Geschwindigkeit von 150 Hüben / min und Hubvolumen von 150 ul.
  8. Als Abgang, öffnen Sie die linke Atrium.
  9. Perfundieren die Maus Lungengefäße frei von Blut für 5 min, mit der Schlauchpumpe und Hank-Lösung erwärmt auf 37 ° C.
  10. Perfundieren den Tracer (8 nm Gold-Albumin 16) für weitere 10 min bei der gleichen Fließgeschwindigkeit.
  11. Spülen Sie die ungebundenen Tracer von 5 min Lungenperfusion mit Hanks-Lösung.
  12. Folgen Sie mit in situ Fixierung der Lunge, die durch 10 min Perfusion von 4% (wt / vol) Formaldehyd, 2,5% Glutaraldehyd und 1% Gerbsäure in 0,1 PIPESPuffer, pH 7,2.
  13. Sammeln Sie die Lungen, entfernen Sie den übermäßigen Gewebe, schneiden kleine Blöcke (3/3 mm), und legen Sie sie in einem markierten Szintillationsfläschchen mit 2 ml Fixativ Mischung.

Die Mäuse erlischt vollständig betäubt während des Verfahrens.

5. Maus Lung Gewebeeinbettsystem für EM

  1. Bereiten Stammlösungen: 1% OsO 4 Palade, Acetat veronal und Kellenberger Puffer.
    1. - 1% OsO 4 Palade-Puffer enthält: 1 ml Acetat veronal Lager, 1,25 ml 4% OsO 4, 1 ml 0,1 N Salzsäure und destilliertem Wasser bis zu 5 ml Endvolumen.
    2. - Acetate veronal Lager wird durch Auflösen von 1,15 g Natriumacetat und 2,94 g andydrous Barbital in 100 ml destilliertem Wasser erhalten.
    3. Kellenberger-Lösung enthält 2 ml Acetat veronal Lager, 2,8 ml 0,1 N Salzsäure, 0,05 g Uranylacetat und 5,1 mldestilliertes Wasser, pH = 6.
  2. Waschen Sie die Lunge Blöcke in 0,1 M Natriumcacodylatpuffer, pH = 7,4, 3 mal kurz.
  3. Befestigen der Proben in die 4% (w / v) Formaldehyd, 2,5% Glutaraldehyd in 0,1 PIPES-Puffer, pH 7,2, für 1 Stunde bei Raumtemperatur.
  4. Mit 1% Palade-Osmium Post-fix für 1 Stunde in der Motorhaube, auf Eis, in der Dunkelheit.
  5. Spülen Sie einmal mit Puffer Kellenberger.
  6. Inkubieren Proben in Kellenberger Puffer für 2 h bis über Nacht bei Raumtemperatur.
  7. Spülen einmal in 50% Ethanol.
  8. Entwässern mit abgestuften Reihe von Ethanol, 5 min / Stück: 70%, 95%, dann 2 x 15 min 100% Ethanol.
  9. Wechseln Sie zu 100% Propylenoxid, 2 x 15 min.
  10. Entfernen Sie die Propylenoxid und dann eine Mischung aus 50% Propylenoxid und 50% Epon 812, über Nacht inkubieren, Drehen eines Rades, bei Raumtemperatur.
  11. Am nächsten Morgen, entfernen Sie die Mischung und fügen Sie frisches Epon 812, wenigstens für 4-5 Stunden auf dem Rad.
  12. Mit verdoppelt sich verjüngenden Formen gefülltauf halbem Weg mit frischen 100% Epon 812, fügen ausgewählten Proben und legen Sie sie an den Kanten.
  13. Bewegen Sie die Formen in den Inkubator auf 60 ° C und lassen Sie sie für 48-72 Stunden aushärten.
  14. Wenn polymerisiert, senden Sie die Blöcke, dünn zu sein (60-70 nm dick) geschnitten.

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Representative Results

ITSN-1s Protein-und mRNA-Spiegel wurden zu verschiedenen Zeitpunkten nach der siRNA ITSN Lieferung durch Western-Blot-und konventionellen und quantitative PCR, wie in 4 überwacht. ITSN-1s Protein-und mRNA-Level in siRNA-behandelten Maus ITSN Lungen waren etwa 75% niedriger unter Bezugnahme auf die Kontrollen während der kontinuierlichen Knockdown von ITSN-1s für 21 Tage. Ohne ITSN-1s, Dynamin-2 ist ein wichtiger Interaktionspartner von ITSN-1s und wichtiger Akteur in Ablösung von Caveolae von der Plasmamembran nicht effizient auf die Endozytose Ort rekrutiert und dadurch Caveolae Loslösung von der Plasmamembran und Bildung von freien vesikulären Trägern 1, 17 gestört. Daher verursacht unwirksam Membran Kernspaltung und eingeschränkter Bildung von freien Trägern vesikulären mangelhaft Endozytose und transendotheliale Transport, Störung der inter-endothelialen Barriere und Lungenödem (Abbildung 1). Außerdem Down-Regulation von ITSN-1s bis geregelt alternative transport von Konzepten für mangelhaft Endozytose kompensieren. Uns ist aufgefallen, häutigen Ringe (2A und 2a1), pleomorph Tubuli (2B), und vergrößerten Endosomen mit typischen Caveolae (Abbildung 2C) aktiv in die Aufnahme und den Transport gold-Albumin beteiligt verschmolzen. Ein wichtiges Ergebnis ist die Abnahme der Zahl in Caveolae ITSN-1s defizienten Maus Lunge Endothel durch Bezugnahme auf Kontrollen, Tabelle 1. Längerer ITSN-1s Hemmung für 24 Tage von wiederkehrenden Lieferung kationische Liposomen / siRNA ITSN reduziert das Lungenödem in Mäusen durch teilweise Wiederherstellung der inter-endothelialen Barriere Integrität. EM morphologische Studien zeigten, dass die Gold-Albumin 8nm Tracer konnte nicht durchdringen die inter-endothelial Kreuzungen, zu diesem Zeitpunkt. Stattdessen bildeten sie Filtrationsrückstände in der luminalen Introitus des Übergangs (Abbildung 3). Jedoch zeigten die perivaskuläre Bereiche eine Ausdehnung und mildÖdem, was darauf hindeutet, dass Verbindungen undurchlässig dieser Größe der Partikel sind, aber immer noch undicht. Auch die Zwischenprodukte der morphologischen alternative Wege endocytic aktiv und in höheren Zahlen. Bemerkenswerterweise zeigten die morphometrischen Analysen, dass die Anzahl der membranartigen Ring / Röhrchen von Gold-markiertem Albumin Teilchen um 14 fach in ITSN-1s chronischen defizienten Mäusen Lunge erhöht Endothel zu Kontrollen, Tabelle 1 verglichen. Caveolae Zahl ist teilweise restauriert, nur 17,8% sinken, unter Bezugnahme auf die Kontrollen. So zeigen unsere Ergebnisse, dass wiederkehrenden Lieferung kationische Liposomen / siRNA-Komplexe ITSN ist eine geeignete Methode, um die Auswirkungen der langfristigen Protein Knockdown in vivo zu untersuchen.

Abbildung 1
Abbildung 1. Repräsentative elektronenmikroskopische Aufnahmen zeigen, offene interendothelialen Junctions (IEJs) markiert thCopyright bezüglich ihrer Länge von 8 nm Gold-Albumin-Partikel. Arrowhead in A und vergrößert a1, weist auf drei bis vier Gold-Albumin-Partikel nahe beieinander in dem gleichen Plan gelegen, welches die breite Öffnung des IEJ. (- Pfeile A, B) Goldpartikel sind mit der abluminalen Ausgang IEJs verbunden. Beachten Sie auch die begrenzte Anzahl von Caveolae und Dilatation der pericapillary Raum St.; Sternchen). Bars: 200 nm (A), 100 nm (B, A1).

Abbildung 2
Abbildung 2. Akute Störung ITSN-1s Expression induziert pleomorph endozytischen / transcytotic Zwischenprodukten. Repräsentative EM Bilder von häutigen Ringe (A, A1), röhrenförmigen Elementen (B, Pfeile) und vergrößerten Endosomen (C, Pfeilspitzen), mit 8 nm Gold-Albumin geladen und verbunden mit Caveolae-likeMorphologie. Beachten Sie auch die schweren Dilatation des perivaskulären Raum (PVS) und der proteinhaltige Ödem (A). Bars: 250 nm (A), 200 nm (B) 100 nm (a1, C).

Abbildung 3
Abbildung 3. Chronische Hemmung ITSN-1s Ausdruck teilweise wieder IEJ Integrität. Filtration Rückstände in der luminalen Introitus eines IEJ (Pfeilspitze). Mild Dilatation (*) der PVS schlägt Undichtigkeit der IEJs. Multivesicular Körper (MVB), in unmittelbarer Nähe der Plasmamembran einen Teil ihrer inneren kleinen Bläschen, gekennzeichnet durch 8 nm Gold Albuminpartikel. Bar: 100 nm.

Tabelle 1. Chronische Hemmung ITSN-1s Ausdruck bewirkt die Aktivierung der alternativen endozytischen / transcytotic Wege und teilweise wieder Caveolae Nummer. * Ergebnisse pro 100 um EC Länge normalisiert werden.

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Discussion

Basierend auf früheren Studien von anderen 9 und uns 1, 18 haben wir diese Methode für die langfristige knock down von ITSN-1s in vivo durch wiederholte intravenöse Verabreichung (alle 72 h für 24 aufeinanderfolgende Tage) spezifischer siRNA / Liposom-Komplexen veröffentlicht. Dieser experimentelle Ansatz ist effizient, sicher und immer wieder verwendet werden und es kann leicht erweitert werden, um die Beteiligung eines Gens jedes Protein von Interesse in der Lunge und pulmonaler Endothel Homöostase zu studieren. Unter den experimentellen Bedingungen durch uns für wiederholte siRNA / Liposomen Lieferung zu setzen, erschien Mäuse ohne Anzeichen von Toxizität oder Immunantworten normal. Die systemische Verabreichung von siRNA ITSN / Liposom-Komplexe ist die klinisch relevante Weg für Indikationen wie Krebs und anderen Stoffwechselerkrankungen. Die Lunge ist das erste Kapillar-Bett durch die siRNA / Liposom-Komplexe intravenös injiziert und dieser die effiziente KD ITSN erklären können auftretenin der Lunge.

Eine Einschränkung der Studie ist die zeitabhängige kontinuierliche Aggregation von Liposomen, 2. Um sie zu überwinden, wurden die siRNA / Liposom-Komplexe kurz (weniger als 2 Stunden) nach der Erzeugung geliefert und erhalten auf Eis zu allen Zeiten vor dem Gebrauch. Herkömmliche Liposomen, wie die, die in dieser Studie verwendet werden, die zur Realisierung des retikuloendothelialen System gelöscht werden. Die Rate der durch Phagozyten-up nehmen kann de sank um liposomale Pegylierung. Sterische Stabilisierung mit Polyethylenglykol (PEG)-Beschichtung verlängert Liposomen 'Umlaufzeit, während eine gleichmäßigere Verteilung tissular. Diese Faktoren werden wichtige Eigenschaften in der Anti-Krebs-Therapien, wo verlängerte Zirkulation der Chemotherapeutika 12 gewünscht wird.

In Bezug auf die EM Verfahrens sollte die kleinste Mengen untersuchten Gewebes für durch systematische und umfangreiche morphologische und mo kompensiert werdenrphometric Analyse sowie durch Untersuchung der seriellen Abschnitte, wenn nötig.

Während unsere Methodik optimiert die Dosierungsschema für nachhaltiges Liefer-und siRNA Wirksamkeit, sind weitere Studien erforderlich, um auf den hohen Wirkungsgrad Identifizierung der richtigen Ziele und über die Beurteilung von Risiken / Nutzen beteiligten Parameter konzentrieren.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde vom National Institute of Health Grants R01HL089462 SP unterstützt.

Materials

Endozytischen / transcytotic Strukturen Steuern ITSN-1s siRNA, 72 h ITSN-1s siRNA, 24 d
Caveolae zu öffnen, um das Lumen * 106,6 ± 9,5 50,46 ± 4,8 87.15 ± 5,9
Caveolae scheinbar frei im Cytosol 173,5 ± 12,0 77,41 ± 6,3 143,0 ± 9,5
Insgesamt Caveolae (Luminal und frei im Cytosol) 280,1 ± 21,5 127,86 ± 11,1 230,14 ± 15,4
Abnormal endozytischen Strukturen (vergrößert Endosomen) 2,65 ± 0,34 11.29 ± 2,7 14.93 ± 3,8
Caveolae Clustern 3,95 ± 0,4 5,64 ± 1,6 11,3 ± 2,5
Membranöse Ringe 1,33 ± 0,04 9,47 ± 2,4 12,8 ± 2,8
Tubules .88 ± .05 4,0 ± 1,3 18.84 ± 3,4
Name Company Catalog Number Comments
Dimethyl Dioctadecyl Ammonium Bromide (DOAB) Sigma-Aldrich D2779
LiposoFast stabilizer (mini-extruder) Avestin Inc. LF-STB
Polycarbonate membrane, 19 mm diameter, 50 nm pore Avestin Inc. LFM-50
Cholesterol Sigma-Aldrich C-8667
Chloroform Mallinckrodt Chemicals 4432-04
Hank's balanced salts Sigma-Aldrich H1387
Round-bottom flask Fisher Scientific FHB-275-030X
Mouse siRNAITSN - on target Dharmacon/ThermoScientific J-046912-11
Peristaltic pump Ismatec REGLO-CDF digital with RHOO pump head
Ventilator Hugo Sachs Electronik NA
Barbital Sigma-Aldrich B-0500
Uranyl acetate EM Sciences 22400
Epon812 EM Sciences Discontinued by the manufacturer
Propylene oxide EM Sciences 20400
Embedding molds EM Sciences 69923-05
Tannic acid EM Sciences 21710
8 nm gold-albumin tracer Prepared in the laboratory as in16
Comments
Equipped with 2 Avestin 1 ml gas-tight syringes (cat. # LF-1)
Pyrex, 100 ml
Modified siRNA, in vivo
Part of IDEX corp.
D-79232 March, Germany
Replaced with Embed812, cat. # 14120

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References

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Bardita, C., Predescu, D., Predescu, S. Long-term Silencing of Intersectin-1s in Mouse Lungs by Repeated Delivery of a Specific siRNA via Cationic Liposomes. Evaluation of Knockdown Effects by Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (76), e50316, doi:10.3791/50316 (2013).

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