Silenciar a largo plazo de Intersectin-1 en los pulmones de ratones por entrega repetida de un siRNA específico a través de liposomas catiónicos. Evaluación de Efectos desmontables de Microscopía Electrónica

Cristina Bardita; Dan Predescu; Sanda Predescu

doi:10.3791/50316

Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

Silenciar a largo plazo de Intersectin-1 en los pulmones de ratones por entrega repetida de un siRNA específico a través de liposomas catiónicos. Evaluación de Efectos desmontables de Microscopía Electrónica

10.3K visualizaciones

⸱

DOI:

10.3791/50316

⸱

21 de junio de 2013

Cristina Bardita^*¹ , Dan Predescu^*¹^,² , Sanda Predescu¹^,²

¹Department of Pharmacology, Rush University, ²Pulmonary and Critical Care Department, Rush University

^* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Inyecciones retro-orbitales repetidas de complejos catiónicos liposomes/siRNA/ITSN-1s en ratones, cada 72 horas durante 24 días, eficiente entregar el dúplex siARN de la microvasculatura pulmonar del ratón la reducción de ARNm ITSN-1s y expresión de la proteína en un 75%. Esta técnica es altamente reproducible en un modelo animal, no tiene efectos adversos y evita accidentes mortales.

Resumen

Estudios anteriores mostraron que desmontables de ITSN-1s (KD _ITSN), una proteína implicada en la regulación endocítica permeabilidad vascular pulmonar y células endoteliales (EC) la supervivencia, la muerte celular apoptótica inducida, un obstáculo importante en el desarrollo de un sistema de cultivo celular con prolongada ITSN-1s inhibición ^1. Utilizando liposomas catiónicos como vehículos, exploramos el silenciamiento de genes ITSN-1 en los pulmones de ratones mediante la administración sistémica de siRNA dirigidos ITSN-1 gen _(ITSN siRNA). Los liposomas catiónicos ofrecen varias ventajas para la salida del siRNA: caja fuerte con dosificación repetida, no inmunogénico, no tóxico, y fácil de producir ^2. Los liposomas rendimiento y la actividad biológica dependen de su tamaño, carga, composición de lípidos, la estabilidad, la dosis y la vía de administración ³ Aquí, eficiente y _ITSN KD específica en los pulmones del ratón se ha obtenido mediante una combinación bromuro de amonio y dimetil dioctadecil colesterol. La administración intravenosade _ITSN siRNA / complejos de liposomas catiónicos transitoriamente derribaron proteína ITSN-1 y mRNA en los pulmones de ratones en el día 3, que se recuperó después de 3 días adicionales. Tomando ventaja de los liposomas catiónicos como un portador seguro repetible, el estudio extendió durante 24 días. Por lo tanto, el tratamiento retro-orbital con complejos recién generados se administró cada 3 días, induciendo _ITSN KD sostenida a lo largo del estudio ^4. Tejidos de ratón recogidos en varios puntos de tiempo post-siRNA _ITSN fueron sometidos a análisis de microscopía electrónica (EM) para evaluar los efectos de la crónica KD _ITSN, en el endotelio pulmonar. De alta resolución de imágenes EM nos permitió evaluar los cambios morfológicos causados por KDITSN en el lecho vascular pulmonar (es decir, la interrupción de la barrera endotelial, disminución del número de caveolae y la regulación positiva de las vías de transporte alternativos), las características no detectables por microscopía de luz. En general estos resultados establecieron un importantetante papel de ITSN-1 en la función de EC y la homeostasis de pulmón, mientras que ilustra la eficacia de la entrega de siRNA-liposomas in vivo.

Introducción

ARNsi desnudo no puede penetrar la membrana celular, siendo cargado negativamente, y es fácilmente degradado por enzimas en la sangre, tejidos y células. Incluso con recientemente modificaciones estructurales para mejorar la estabilidad, la acumulación de siRNA en el sitio diana después de la administración es extremadamente baja y requiere un vehículo intracelular eficiente ^5. Los liposomas catiónicos surgieron como seguras ácidos nucleicos portadores con el potencial de transferir grandes piezas de ADN / ARN en las células mediante la encapsulación y la protección de los ácidos nucleicos a partir de la degradación enzimática ^6. También, los li....