Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

إسكات طويلة الأجل من Intersectin-1S في الرئتين الماوس عن طريق المتكررة تسليم سيرنا محددة عبر الليبوزومات الموجبة. تقييم تأثيرات ضربة قاضية بواسطة المجهر الإلكتروني

Published: June 21, 2013 doi: 10.3791/50316
Automatic Translation
*1, *1,2, 1,2
1Department of Pharmacology, Rush University, 2Pulmonary and Critical Care Department, Rush University
* These authors contributed equally

Summary

تكرار الحقن الرجعية المدارية من liposomes/siRNA/ITSN-1s الموجبة المجمعات في الفئران، كل 72 ساعة لمدة 24 يوما، وتقديم كفاءة دوبلكس سيرنا إلى الماوس الرئة الأوعية الدموية الدقيقة الحد مرنا ITSN-1S والتعبير البروتين بنسبة 75٪. هذا الأسلوب هو تكرار للغاية في نموذج حيواني، ليس له آثار سلبية والابتعاد عن حالة وفاة.

Abstract

وأظهرت دراسات سابقة أن ضربة قاضية من ITSN-1S (KD ITSN)، وهو البروتين التقامي تشارك في تنظيم الرئة نفاذية الأوعية الدموية والخلايا البطانية (ECS) البقاء على قيد الحياة، يسببها موت الخلايا أفكارك، عقبة رئيسية في تطوير نظام زراعة الخلايا لفترات طويلة مع ITSN-1S تثبيط 1. باستخدام الجسيمات الشحمية الموجبة وناقلات، ونحن استكشاف إسكات الجينات ITSN-1S في الرئتين الماوس عن طريق الإدارة النظامية من سيرنا استهداف ITSN-1 الجين (ITSN سيرنا). الجسيمات الشحمية الموجبة توفر العديد من المزايا للتسليم سيرنا: آمن مع الجرعات المتكررة، nonimmunogenic، غير سام، وسهلة لإنتاج 2. أداء الجسيمات الشحمية والنشاط البيولوجي تعتمد على حجمها، تهمة، الدهون تكوين والاستقرار، جرعة وطريقة التعاطي 3 هنا وكفاءة وITSN دينار كويتي محددة في الرئتين الماوس قد تم الحصول عليها باستخدام مزيج بروميد الأمونيوم dioctadecyl الكولسترول وثنائي ميثيل. التسليم في الوريدمن ITSN سيرنا / المجمعات الحويصلية الموجبة طرقت عابر أسفل البروتين ITSN-1S ومرنا في الرئتين الماوس في يوم 3، والذي تعافى بعد 3 أيام إضافية. الاستفادة من الجسيمات الشحمية الموجبة باعتبارها الناقل آمنة للتكرار، وسعت الدراسة لمدة 24 يوما. وهكذا، كانت تدار العلاج الرجعية المدارية مع المجمعات ولدت حديثا كل يوم 3، الأمر الذي أدى ITSN دينار كويتي مستمرة طوال فترة الدراسة 4. وتعرض الأنسجة الماوس جمعها في عدة نقاط زمنية ITSN بعد سيرنا إلى المجهر (EM) تحليلات الإلكترون لتقييم آثار دينار كويتي ITSN المزمنة، في البطانة الرئة. سمح عالية الدقة EM التصوير لنا لتقييم التغيرات المورفولوجية التي تسببها KDITSN في السرير الوعائي الرئوي (أي تعطل حاجز البطانية، انخفض عدد caveolae وupregulation من مسارات نقل بديلة)، وخصائص غير القابلة للكشف بواسطة المجهر الضوئي. عموما أنشئت هذه النتائج والمجمدةدور تانت من ITSN-1S في وظيفة ECS والتوازن الرئة، في حين توضح فعالية تسليم سيرنا-الجسيمات الشحمية في الجسم الحي.

Introduction

سيرنا المجردة لا يمكن أن تخترق غشاء الخلية، ويجري سالبة الشحنة، وأنه هو المتدهورة بسهولة عن طريق الانزيمات في الدم والأنسجة، والخلايا. حتى مع مؤخرا تعديلات هيكلية لتحسين الاستقرار، وتراكم سيرنا في الموقع المستهدف بعد تناوله منخفضة للغاية ويتطلب وسيلة فعالة داخل الخلايا 5. ظهرت الجسيمات الشحمية الموجبة كما آمن الأحماض النووية ناقلات مع القدرة على نقل قطع كبيرة من الحمض النووي / الحمض النووي الريبي في الخلايا عن طريق التغليف وحماية الأحماض النووية من تدهور الأنزيمية 6. أيضا، الجسيمات الشحمية الموجبة تتفاعل تلقائيا مع DNA / RNA، وبالتالي تعزيز نقل الجينات إلى الخلايا 2. وفي الآونة الأخيرة تم تطبيق الجسيمات الشحمية لتقديم اللقاحات والأدوية الجزيئي المنخفض الوزن 7. تسليم الليبوسومال من الرنا الميكروي-7-معربا عن البلازميد يتغلب عامل نمو البشرة مستقبلات التيروزين كيناز المانع للمقاومة في خلايا سرطان الرئة 8. عند استهدافبطانة الأوعية الدموية، والتسليم في الوريد أمر ضروري لأن المجمعات من غير المرجح أن عبور حاجز البطانية ويتسرب في النسيج الخلالي إلى 9. وعلى سبيل المقارنة إلى أعضاء أخرى، ECS من الأوعية الدموية الدقيقة في الرئة يكون لها أكبر امتصاص واستيعاب بشوق الحويصلية الموجبة وDNA / RNA المجمعات، يليه الغدد الليمفاوية وبقع باير 9. وقد ثبت التسليم عن طريق الوريد في نماذج القوارض من سيرنا عبر حقن الوريد الرجعية المدارية أو الذيل غير مؤذية حتى في تركيزات عالية، مثل 50 مغ / كغ 10. في الكتابات المنشورة تكوين الجسيمات الشحمية الموجبة يختلف، استنادا إلى صياغة الدهون ونسبة متساوي المولية من 11 و 12. هناك طائفة واسعة من التطبيقات المحتملة باستخدام الجسيمات الشحمية الموجبة للتسليم الجينات في الجسم الحي، سواء استهداف down-regulation/over-expression من البروتينات، والتسليم لقاحات أو علاجات المضادة للورم 13-15. المهم أن نتذكرغير أن كفاءة DNA / RNA الخلوية التفاعل غشاء ينظم شكل اقتران بين المجمعات ولدت والدهون غشاء. هذا يشير إلى أن الخياطة تكوين الدهون إلى ملامح الغشاء الخلوي المستهدف قد يكون مفيدا ويؤدي إلى ارتفاع معدلات ترنسفكأيشن في نوع خلية معينة 6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. الليبوزومات الموجبة التحضير

  1. الأوتوكلاف قارورة جولة القاع نظيفة لاستخدامها في إعداد lipososmes.
  2. إعداد حلول الأوراق المالية:
    1. - ذوب 200 ملغ من ثنائي ميثيل بروميد الأمونيوم dioctadecyl (DOAB) في 10 مل كلوروفورم باستخدام زجاجة صغيرة.
    2. - ذوب 200 ملغ من الكولسترول في 10 مل كلوروفورم باستخدام زجاجة صغيرة.
    3. - إعداد والأوتوكلاف لتعقيم 5٪ جلوكوز في 100 مل من الحمض النووي الريبي / الحمض النووي بورصة عمان الماء المقطر مجانا.
  3. شطف قارورة جولة القاع مع الكلوروفورم. أضف 5-10 مل إلى قارورة، دوامة، والسماح لها الجلوس لبضع دقائق. الحفاظ على قارورة مغطاة بورق الألمنيوم في جميع الأوقات. إفراغ الكلوروفورم من القارورة.
  4. إعداد الليبوزومات:
    1. - إضافة 315 ميكرولتر من محلول المخزون DOAB إلى قارورة جولة القاع.
    2. - إضافة 200 ميكرولتر من محلول المخزون الكولسترول إلى القارورة.
    3. - إضافة 9.5 مل من الكلوروفورم إلى قارورة منالثانية خلط من قبل دوامة.
  5. تعيين rotavapor عند 37 ° C، 100 التناوب في الدقيقة الواحدة (دورة في الدقيقة) أو أكثر (100-120 دورة في الدقيقة). يجب أن تكون متصلا rotavapor إلى عنصر تحكم فراغ مضخة المياه مع أنبوب الشفط تعلق بشكل صحيح.
  6. ربط خزان غاز الارجون وrotavapor.
  7. نعلق القارورة إلى rotavapor وضبط الإعدادات المثلى قبل خفضه في حمام مائي. فتح صمام الأولى لالأرجون تماما بتحويلها عكس اتجاه عقارب الساعة. فتح دائما وإغلاق هذا الصمام الأول. صمام الثانية تسيطر على الأرجون تهب في لقارورة الضغط. يجب أن يكون الضغط دائما لطيف.
  8. خفض rotavapor في حمام الماء، وهو ما يكفي لقارورة للمس الماء دون أن مغمورة تماما وبدوره على السرعة.
  9. انتظر حتى يتبخر كل كلوروفورم، حوالي 10 دقيقة. ثم وقف آلة.
  10. إيقاف سرعة rotavapor وصمامات خزان الأرجون. الآن يجب إزالة القارورة.
  11. إضافة 2 مل من 5٪ غلوكوز إلى اله قارورة بحل الدهون.
  12. خدش الجزء السفلي من القارورة جيدا باستخدام 1 مل طرف ماصة بحل جميع الدهون. بعد الخدش، وإزالة أي الدهون المتبقية من طرف 1 مل في القارورة، إذا لزم الأمر، مع طرف الثاني.
  13. احتضان الحل التي تم الحصول عليها في 42 ° C حمام الماء بينما vortexing لببطء (15 دورة في الدقيقة) القارورة.
  14. ملء ضريبة القيمة المضافة sonicator بالماء البارد. يصوتن الحل لمدة 20-30 دقيقة على الأقل مع القارورة التي عقدت حتى والجزء السفلي مجرد لمس بالكاد الماء.
  15. تسخين القارورة في حمام مائي وrotavapor لمدة 20 دقيقة عند 42 درجة مئوية، عند مستوى الصفر السرعة، مع الجزء السفلي جولة مغمورة في الماء، وهذه المرة.
  16. تحديد الجسيمات الشحمية من خلال ميكرون 0.47 وبعد ذلك، 0.22 ميكرون مرشحات حقنة.
  17. باستخدام الطارد صغيرة، تصفية الجسيمات الشحمية من خلال غشاء نانومتر 50 لتوليد السكان متجانسة من الحويصلات الحويصلية unilamellar.
  18. نقل الجسيمات الشحمية إلى أنبوب إيبندورف ووضعه على الجليد.

2. إعداد الليبوزومات: سيرنا-ITSN-1 مولات

  1. Resuspend وعلى المستهدفة الماوس ITSN سيرنا في المخزن سيرنا تحتوي على 20 ملي HEPES و150MM كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.4، إلى تركيز النهائي من 2 ميكروغرام / ميكرولتر. يبقيه على الجليد قبل الاختلاط.
  2. إعداد الليبوزومات: المجمعات ITSN سيرنا في نسبة الجسيمات الشحمية 8 نانومول: 2 RNA ميكروغرام (أو الجسيمات الشحمية 400 نانومول: 100 ميكروغرام ITSN سيرنا). في الدراسة الحالية، واضاف نحن 50 ميكرولتر من ITSN سيرنا من محلول المخزون (50 ميكرومتر) إلى 100 ​​ميكرولتر من الجسيمات الشحمية الطازجة باستخدام الحمض النووي الريبي / الحمض النووي بورصة عمان الحرة إيبندورف أنبوب. لاحظ أن تركيز ITSN سيرنا مهم جدا لمدة أقصاها 150 ميكرولتر من خليط يمكن أن يكون ثنائيا والرجعية المدارية حقن في الماوس في وقت واحد.
  3. الحفاظ على الخليط على الجليد في انتظار لحقن الفئران.

3. الماوس الرجعية المدارية حقن الوريد (زاوية الداخلية للمحجر العين)

jove_content "> وقد وافق جميع التجارب التي أجريت في الماوس وفقا للمبادئ التوجيهية من جامعة راش المؤسسي رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام.

  1. تخدير الماوس عن طريق الحقن داخل الصفاق من 50 ملغم / كغم من وزن الجسم الكيتامين و 5 ملغم / كغم من وزن الجسم زيلازين (خليط متوفر تجاريا). اعتمادا على وزن الحيوان والسن، وضبط حجم التخدير والتركيز. الفئران المستخدمة في الدراسة هي CD1 الفئران الفئران الذكور، 6-8 أسابيع من العمر وتزن حوالي 25 غراما. المحاقن هي السلين 1 نوع مل مع إبرة المرفقة.
  2. عقد آذان الفأر مع يد واحدة وتحويل الماوس لأسفل على الجانب لفضح زاوية الداخلية للعين. تهدف الإنسي إلى الثنية الهلالية، وتجنب لمس مقلة العين.
  3. نقترب من لحيمة الدمعية للعين عقد حقنة تحتوي على خليط في درجة زاوية 45 في جميع المحاور الثلاثة.
  4. حقن ببطء الخليط، والسماح للماوس على التعافي مع الجانب حقن ما يصل. إذا كان السائل كبيرةأشكال الحبرية في المكان الإدراج إبرة، سحب الإبرة، وشفط الظهر الحبرية في حقنة وحاول مرة أخرى. تكرار الحقن والأفضل القيام بالتناوب عيون، للسماح الانتعاش الكمال. إذا لم تكن متأكدا، هذه التقنية يمكن التحقق عن طريق حقن صبغة زرقاء (50 ميكرولتر، 0.5٪ البنفسجي الكريستال في الميثانول) وتعريض الرئتين الماوس لمراقبة الأوعية الدموية الأزرق.
  5. تم حقن الفئران في هذه الدراسة كل يوم 3 طريق لمدة 3 أسابيع دون وفيات أو آثار ضارة.

4. الماوس الإرواء الرئة ومجموعة الأنسجة للدراسات بيوكيميائية

  1. تعيين مضخة تحوي لتشغيلها في 1.5 مل / دقيقة.
  2. إعداد الإعداد: التنفس الصناعي، جدول التشغيل، والأدوات، ومسحات القطن المعقم، Q-نصائح، سلاسل، الأكواب، الماء المقطر، والملح متوازن هانك، التتبع.
  3. تخدير الماوس عن طريق الحقن داخل الصفاق من خليط مخدر (100 ملغ / كغ من وزن الجسم الكيتامين و 10 ملغم / كغم من وزن الجسم زيلازين). على مستوى العنق، وإزالة الغدد اللعابية وفضح القصبة الهوائية.
  4. تبدأ مع فتح البطن والمكوس الحجاب الحاجز، واتبع مع بضع الصدر، وتعريض الرئتين والقلب.
  5. إزالة الغدة الصعترية.
  6. باستخدام المجهر الضوئي للحصول على أفضل دقة، يقثطر الشريان الرئوي.
  7. هل القصبة الهوائية وينبب الماوس باستخدام tracheostoma. تعيين جهاز التنفس الصناعي إلى معدل 150 السكتات الدماغية / دقيقة، وحجم المخ من 150 ميكرولتر.
  8. كما منفذ، فتح الأذين الأيسر.
  9. يروي الماوس الأوعية الدموية الرئوية خالية من الدم لمدة 5 دقائق، وذلك باستخدام مضخة تحوي والحل هانك في درجة حرارة عند 37 درجة مئوية.
  10. يروي التتبع (8 نانومتر الذهب الزلال 16) لمدة 10 دقيقة إضافية في معدل تدفق نفسه.
  11. مسح التتبع غير منضم من قبل 5 دقائق نضح الرئة مع حل هانك.
  12. اتبع مع ​​تثبيت الموقع من الرئتين من قبل 10 دقيقة نضح من 4٪ (وزن / المجلد) الفورمالديهايد، 2.5٪ غلوتارالدهيد، وحمض التانيك 1٪ في 0.1 أنابيبالعازلة، ودرجة الحموضة 7.2.
  13. جمع الرئتين، وإزالة الأنسجة المفرطة، وقطع كتل صغيرة (3/3 مم)، ووضعها في قارورة التلألؤ إلى المسمى تحتوي على 2 مل من خليط تثبيتي.

سوف تنتهي الفئران تخدير كامل أثناء العملية.

5. الماوس الرئة معالجة الأنسجة لEM

  1. إعداد حلول المخزون: 1٪ Palade أوسو 4، خلات veronal، وكيلينبرغر العازلة.
    1. - 1٪ Palade-أوسو 4 العازلة تحتوي على: 1 مل خلات الأسهم veronal، 1.25 مل 4٪ أوسو 4، 1 مل من حمض الهيدروكلوريك 0.1 N، والماء المقطر تصل إلى 5 مل من الحجم النهائي.
    2. - يتم الحصول على خلات veronal حل الأسهم عن طريق إذابة 1.15 غرام الصوديوم خلات andydrous و2.94 ز الباربيتال في 100 مل من الماء المقطر.
    3. حل كيلينبرغر يحتوي على 2 مل من خلات veronal الأسهم، و 2.8 مل من حمض الهيدروكلوريك 0.1 N، 0.05 غ خلات اليورانيل، و 5.1 ملمن الماء المقطر، ودرجة الحموضة = 6.
  2. غسل كتل الرئة في 0.1 M الصوديوم كاكوديلات العازلة، ودرجة الحموضة = 7.4، لفترة وجيزة 3 مرات.
  3. إصلاح العينات في 4٪ (وزن / المجلد) والفورمالديهايد، غلوتارالدهيد 2.5٪ في 0.1 أنابيب العازلة، ودرجة الحموضة 7.2، لمدة 1 ساعة، في درجة حرارة الغرفة.
  4. بعد إصلاح مع 1٪ Palade-الأزميوم لمدة 1 ساعة في غطاء محرك السيارة، على الجليد، في الظلام.
  5. شطف مرة واحدة مع كلينبرغر العازلة.
  6. احتضان العينات في كيلينبرغر العازلة لمدة 2 ساعة ليلة وضحاها، في درجة حرارة الغرفة.
  7. شطف مرة واحدة في 50٪ من الإيثانول.
  8. يذوى مع سلسلة متدرجة من الايثانول، 5 دقيقة / كل: 70٪، 95٪، ثم 2 × 15 دقيقة الإيثانول بنسبة 100٪.
  9. التبديل إلى 100٪ أكسيد البروبيلين، 2 × 15 دقيقة.
  10. إزالة أكسيد البروبيلين وإضافة خليط من 50٪ أكسيد البروبيلين و 50٪ EPON 812، واحتضان بين عشية وضحاها، وتناوب على عجلة، في درجة حرارة الغرفة.
  11. صباح اليوم التالي، وإزالة الخليط وإضافة EPON الطازجة 812، على الأقل لمدة 4-5 ساعة على عجلة القيادة.
  12. باستخدام قوالب مدبب الضعف، وشغلنصف الطريق مع الطازجة 100٪ EPON 812، إضافة العينات المختارة ووضعها على حواف.
  13. نقل القوالب إلى مجموعة حاضنة عند 60 درجة مئوية والسماح لهم علاج لمدة 48-72 ساعة.
  14. عندما بلمرة، وإرسال كتل لتكون رقيقة (60-70 نانومتر سميكة) مقطوع.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وتم رصد مستويات البروتين ITSN-1S ومرنا في عدة نقاط وقت بعد سيرنا تسليم ITSN بواسطة لطخة غربية وPCR التقليدية والكمي كما هو الحال في 4. وكانت مستويات البروتين ITSN-1S ومرنا في سيرنا الرئتين الماوس المعالجة ITSN-أقل بحوالي 75٪ بالرجوع إلى الضوابط خلال ضربة قاضية المستمر من ITSN-1S لمدة 21 يوما. دون ITSN-1S، dynamin-2، لا يتم تجنيدهم شريكا رئيسيا للاعب التفاعل ITSN-1S وأساسيا في مفرزة من caveolae من غشاء البلازما بكفاءة إلى موقع التقامي وبالتالي، مفرزة caveolae من غشاء البلازما وتشكيل حويصلي مجانا تعطل شركات الطيران 1، 17. لذلك، تسبب عدم فعالية الانشطار الغشاء وتشكيل ضعف من الناقلين حويصلي مجانا الإلتقام ناقصة والنقل transendothelial، تعطيل حاجز بين البطانية وذمة رئوية (الشكل 1). وعلاوة على ذلك، أسفل تنظيم ITSN-1S حتى ينظم بديل TRansport مسارات للتعويض عن نقص الإلتقام. لاحظنا حلقات الغشائي (أرقام 2A و 2A1)، الأنابيب متعدد الأشكال (الشكل 2B)، وتضخم الإندوسومات تنصهر مع caveolae نموذجي (الشكل 2C) تشارك بنشاط في امتصاص ونقل الذهب الزلال. اكتشاف مهم هو انخفاض في عدد caveolae في ITSN-1S ناقص الماوس البطانة الرئة بالرجوع إلى ضوابط، الجدول 1. المطول تثبيط ITSN-1S لمدة 24 يوما عن طريق التسليم المتكرر للالجسيمات الشحمية الموجبة / ITSN سيرنا خفض الوذمة الرئوية في الفئران من خلال استعادة جزئيا المشتركة بين البطانية سلامة الجدار. وأظهرت الدراسات المورفولوجية EM أن 8nm التتبع الذهب الزلال لا يمكن أن تخترق تقاطعات بين البطانية، في هذه المرحلة الزمنية. بدلا من ذلك، فإنها شكلت مخلفات الترشيح في اللحن الافتتاحي اللمعية من مفترق الطرق (الشكل 3). ومع ذلك، أظهرت المساحات المحيطة بالأوعية بعض تمدد ومعتدلوذمة، مما يوحي بأن تقاطعات غير منفذ للحجم هذه الجسيمات، ولكن لا تزال تتسرب منها المياه. أيضا، وسيطة المورفولوجية للمسارات بديلة التقامي نشطة وموجودة في أرقام أعلى. بشكل ملحوظ، أشارت التحليلات المورفومترية أن عدد خاتم غشائي / الأنابيب وصفت من قبل جزيئات الذهب الزلال بنسبة 14 أضعاف في ITSN-1S المزمنة نقص الماوس البطانة الرئة بالمقارنة مع الضوابط، الجدول 1. يتم استعادة عدد Caveolae جزئيا، فقط 17.8٪ انخفاضا، بالرجوع إلى ضوابط. وهكذا، نتائجنا تثبت أن تسليم المتكررة من الجسيمات الشحمية الموجبة / المجمعات ITSN سيرنا هي منهجية مناسبة لدراسة آثار ضربة قاضية البروتين على المدى الطويل في الجسم الحي.

الشكل 1
الشكل 1. الميكروسكوب الإلكتروني ممثل تظهر تقاطعات interendothelial المفتوحة (IEJs) المسمى عشرroughout طولها بنسبة 8 نانومتر جزيئات الذهب الزلال. السهم في تضخيم وA1، يشير إلى ثلاثة أو أربعة جزيئات الذهب الزلال تقع قريبة من بعضها البعض في نفس الخطة، مما يدل على فتحة واسعة من IEJ. ترتبط جزيئات الذهب أيضا مع خروج مجافي اللمعة من IEJs (A، B - سهام). نلاحظ أيضا عدد محدود من caveolae وتمدد من جهاز كمبيوتر شخصى الفضاء المحيطة بالشعيرات؛ العلامات النجمية). القضبان: 200 نانومتر (A) و 100 نيوتن متر (B، A1).

الشكل 2
الشكل 2. اضطراب حاد في التعبير ITSN-1S يدفع متعدد الأشكال التقامي / transcytotic سيطة. الممثل EM الصور من حلقات الغشائي (A، A1)، وعناصر أنبوبي (B، السهام) والإندوسومات الموسع (C، النصال)، محملة 8 نانومتر الذهب الزلال و يرتبط caveolae مثلمورفولوجيا. نلاحظ أيضا تمدد شديد في الفضاء حول الوعاء (ص ف) وذمة البروتينية (A). القضبان: 250 نانومتر (A)، 200 نانومتر (B) 100 نيوتن متر (A1، C).

الشكل (3)
الشكل (3). تثبيط مزمن في التعبير ITSN-1S يعيد جزئيا IEJ النزاهة. مخلفات الترشيح في اللحن الافتتاحي اللمعية من IEJ (رأس السهم). تمدد خفيفة (*) من PVS يوحي التسرب من IEJs. الهيئات عديد الحويصلات (MVB)، على مقربة من غشاء البلازما بعض الحويصلات الصغيرة الداخلية، وصفت من قبل 8 نانومتر جزيئات الذهب الزلال. شريط: 100 نانومتر.

الجدول 1. تثبيط مزمن في التعبير ITSN-1S يتسبب في تفعيل المسارات التقامي / transcytotic البديلة ويستعيد جزئيا عدد caveolae. تم تطبيع * النتائج لكل 100 ميكرون طول EC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

استنادا إلى الدراسات السابقة التي نشرت من قبل الآخرين ولنا 9 1، 18 وضعنا هذه المنهجية على المدى الطويل نهدم من ITSN-1S في الجسم الحي بواسطة الوريد المتكررة (كل ساعة 72، لمدة 24 يوما متتالية) من سيرنا محددة / المجمعات الحويصلية. هذا النهج التجريبي هو كفاءة، ويمكن استخدامها بأمان وبشكل متكرر، ويمكن أن تمتد بسهولة لدراسة تورط الجينات ترميز أي بروتين من الفائدة في البطانة الرئة والتوازن الرئوي. تحت الظروف التجريبية التي أنشأها لنا لسيرنا المتكررة / تسليم الجسيمات الشحمية، ظهر الفئران العادية مع عدم وجود علامات على سمية أو الاستجابات المناعية. الإدارة النظامية من سيرنا ITSN / الحويصلية المجمعات هو الطريق الأكثر ذات الصلة سريريا للمؤشرات والسرطان والأمراض الاستقلابية الأخرى. الرئة هي أول سرير الشعرية من قبل سيرنا / الحويصلية المجمعات حقن عن طريق الوريد وهذا قد يفسر كفاءة دينار كويتي ITSN اجهفي الرئة.

واحد الحد من هذه الدراسة هو الوقت التجميع المستمر تعتمد على الجسيمات الشحمية الموجبة 2. للتغلب على ذلك، تم تسليم سيرنا / الحويصلية المجمعات قريبا (أقل من 2 ساعة) بعد جيل والحفاظ على الجليد في جميع الأوقات قبل الاستخدام. ويقترح الجسيمات الشحمية الموجبة التقليدية، مثل تلك المستخدمة في دراستنا إلى أن يتم مسح من قبل النظام الشبكي البطاني. معدل يصل تتخذ من قبل البالعات يمكن دي انخفضت بنسبة من مضاد الليبوسومال. استقرار الفراغية مع البولي ايثيلين جلايكول (PEG) طلاء يطيل زمن الدوران الجسيمات الشحمية 'في حين وجود توزيع أكثر حتى نسيجي. هذه العوامل تصبح الخصائص المهمة جدا في العلاجات المضادة للسرطان حيث هو المطلوب تداولها لفترة طويلة من وكلاء العلاج الكيميائي 12.

فيما يتعلق الإجراء EM، ينبغي تعويض المبالغ دقيقة من النظر فيه من قبل الأنسجة لمنهجية واسعة النطاق المورفولوجية وموتحليل rphometric وكذلك عن طريق الفحص من المقاطع المسلسل، عند الحاجة.

بينما منهجيتنا يحسن الجدول الزمني للتسليم جرعة مستمرة وفعالية سيرنا، وهناك حاجة إلى مزيد من الدراسات للتركيز على تحديد كفاءة عالية من الأهداف الحق وبشأن تقييم المخاطر / الفوائد المعلمات المعنيين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل المعهد الوطني للصحة منح R01HL089462 ليرة سورية.

Materials

هياكل التقامي / transcytotic السيطرة سيرنا ITSN-1S، 72 ساعة سيرنا ITSN-1S، 24 د
Caveolae فتح إلى التجويف * 106.6 ± 9.5 50.46 ± 4.8 87.15 ± 5.9
Caveolae يبدو الحرة في العصارة الخلوية 173.5 ± 12.0 77.41 ± 6.3 143.0 ± 9.5
مجموع caveolae (اللمعية وحرة في العصارة الخلوية) 280.1 ± 21.5 127.86 ± 11.1 230.14 ± 15.4
هياكل التقامي غير طبيعية (موسع الإندوسومات) 2.65 ± 0.34 11.29 ± 2.7 14.93 ± 3.8
مجموعات Caveolae 3.95 ± 0.4 5.64 ± 1.6 11.3 ± 2.5
حلقات الغشائي 1.33 ± .04 9.47 ± 2.4 12.8 ± 2.8
الأنابيب .88 ± .05 4.0 ± 1.3 18.84 ± 3.4
Name Company Catalog Number Comments
Dimethyl Dioctadecyl Ammonium Bromide (DOAB) Sigma-Aldrich D2779
LiposoFast stabilizer (mini-extruder) Avestin Inc. LF-STB
Polycarbonate membrane, 19 mm diameter, 50 nm pore Avestin Inc. LFM-50
Cholesterol Sigma-Aldrich C-8667
Chloroform Mallinckrodt Chemicals 4432-04
Hank's balanced salts Sigma-Aldrich H1387
Round-bottom flask Fisher Scientific FHB-275-030X
Mouse siRNAITSN - on target Dharmacon/ThermoScientific J-046912-11
Peristaltic pump Ismatec REGLO-CDF digital with RHOO pump head
Ventilator Hugo Sachs Electronik NA
Barbital Sigma-Aldrich B-0500
Uranyl acetate EM Sciences 22400
Epon812 EM Sciences Discontinued by the manufacturer
Propylene oxide EM Sciences 20400
Embedding molds EM Sciences 69923-05
Tannic acid EM Sciences 21710
8 nm gold-albumin tracer Prepared in the laboratory as in16
Comments
Equipped with 2 Avestin 1 ml gas-tight syringes (cat. # LF-1)
Pyrex, 100 ml
Modified siRNA, in vivo
Part of IDEX corp.
D-79232 March, Germany
Replaced with Embed812, cat. # 14120

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Predescu, S. A., Predescu, D. N., Knezevic, I., Klein, I. K., Malik, A. B. Intersectin-1s regulates the mitochondrial apoptotic pathway in endothelial cells. J. Biol. Chem. 282 (282), 17166-17178 (2007).
  2. Uddin, S. Cationic lipids used in non-viral gene delivery systems. Biotechnology and Molecular Biology Review. 2 (2), 58-67 (2007).
  3. Barenholz, Y., et al. Influence of lipid composition on the thermotropic behavior and size distribution of mixed cationic liposomes. J. Colloid Interface Sci. (356), 46-53 (2011).
  4. Predescu, D. N., Neamu, R., Bardita, C., Wang, M., Predescu, S. A. Impaired caveolae function and upregulation of alternative endocytic pathways induced by experimental modulation of intersectin-1s expression in mouse lung endothelium. Biochem. Res. Int.. (2012), 672705 (2012).
  5. Higuchi, Y., Kawakami, S., Hashida, M. Strategies for in vivo delivery of siRNAs: recent progress. BioDrugs. 24 (24), 195-205 (2010).
  6. Caracciolo, G., Amenitsch, H. Cationic liposome/DNA complexes: from structure to interactions with cellular membranes. Eur. Biophys. J. , (2012).
  7. Barnier Quer, C., Elsharkawy, A., Romeijn, S., Kros, A., Jiskoot, W. Cationic liposomes as adjuvants for influenza hemagglutinin: more than charge alone. Eur. J. Pharm. Biopharm. 81 (81), 294-302 (2012).
  8. Rai, K., et al. Liposomal delivery of MicroRNA-7-expressing plasmid overcomes epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor-resistance in lung cancer cells. Mol. Cancer Ther. (10), 1720-1727 (2011).
  9. McLean, J. W., et al. Organ-specific endothelial cell uptake of cationic liposome-DNA complexes in mice. Am. J. Physiol. (273), H387-H404 (1997).
  10. Soutschek, J., et al. Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs. Nature. (432), 173-178 (2004).
  11. Barenholz, Y. Liposomes enhance bioremediation of oil-contaminated soil. J. Liposome Res. (13), 1-8 (2003).
  12. Zamboni, W. C. Liposomal, nanoparticle, and conjugated formulations of anticancer agents. Clin. Cancer Res. (11), 8230-8234 (2005).
  13. Newman, M. S., Colbern, G. T., Working, P. K., Engbers, C., Amantea, M. A. Comparative pharmacokinetics, tissue distribution, and therapeutic effectiveness of cisplatin encapsulated in long-circulating, pegylated liposomes (SPI-077) in tumor-bearing mice. Cancer Chemother Pharmacol. (43), 1-7 (1999).
  14. Martino, S., et al. Efficient siRNA delivery by the cationic liposome DOTAP in human hematopoietic stem cells differentiating into dendritic cells. J. Biomed. Biotechnol. (2009), 410260 (2009).
  15. Zhang, G., et al. A delivery system targeting bone formation surfaces to facilitate RNAi-based anabolic therapy. Nat. Med. 18 (18), 307-314 (2012).
  16. Predescu, D., Palade, G. E. Plasmalemmal vesicles represent the large pore system of continuous microvascular endothelium. Am. J. Physiol. (265), H725-H733 (1993).
  17. Koh, T. W., Verstreken, P., Bellen, H. J. Dap160/intersectin acts as a stabilizing scaffold required for synaptic development and vesicle endocytosis. Neuron. (43), 193-205 (2004).
  18. Miyawaki-Shimizu, K., et al. Lung Cell Mol. Physiol. (290), L405-L413 (2006).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 76، الهندسة الطبية الحيوية، الكيمياء الحيوية، علم الوراثة، علم الأحياء الجزيئي، علم الأحياء الخلوي، علم التشريح، علم وظائف الأعضاء، الطب، علم المناعة، علم الأدوية، النماذج الحيوانية، أمراض القلب والأوعية الدموية، intersectin-1S، سيرنا، الجسيمات الشحمية، حقن الرجعية المدارية، الحاد والمزمن ضربة قاضية ITSN-1S، الفئران المعدلة وراثيا، الحويصلية، والخلايا البطانية، الأنسجة، والرئة، ونضح، المجهر الإلكتروني، نموذج حيواني
إسكات طويلة الأجل من Intersectin-1S في الرئتين الماوس عن طريق المتكررة تسليم سيرنا محددة عبر الليبوزومات الموجبة. تقييم تأثيرات ضربة قاضية بواسطة المجهر الإلكتروني
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bardita, C., Predescu, D., Predescu, … More

Bardita, C., Predescu, D., Predescu, S. Long-term Silencing of Intersectin-1s in Mouse Lungs by Repeated Delivery of a Specific siRNA via Cationic Liposomes. Evaluation of Knockdown Effects by Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (76), e50316, doi:10.3791/50316 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter