Summary
マウスでカチオンliposomes/siRNA/ITSN-1s錯体、24日間の72時間ごとの繰り返し眼窩注射は、効率75％でITSN-1 mRNAおよびタンパク質の発現を軽減マウス肺の微小血管系へのsiRNA二本鎖を提供します。この手法は、動物モデルにおいて非常に再現性がある、有害な影響を持っていないと死亡を回避することができます。
Abstract
これまでの研究では、ITSN-1S（KD ITSN）、肺血管透過性および内皮細胞の調節に関与してエンドサイトーシスタンパク質（ECS）生存、誘導されたアポトーシス細胞死、長引くITSN-1Sと細胞培養系を開発する上で大きな障害とノックダウンを示した阻害1。キャリアとしてカチオン性リポソームを使用して、我々はITSN-1遺伝子（のsiRNA ITSN）標的とするsiRNAの全身投与により、マウス肺でITSN-1遺伝子のサイレンシングを検討した。 2を生成するために、反復投与で安全非免疫原性、無毒、かつ簡単：カチオン性リポソームは、siRNAの送達のためのいくつかの利点を提供する。リポソームの性能と生物学的活性は、コレステロールおよびジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイドの組み合わせを使用してそれらのサイズ、電荷、脂質組成、安定性、用量および投与3の経路ここで、効率的で得られたマウスの肺内の特定KD ITSNに依存する。静脈内送達のsiRNA ITSNの/カチオン性リポソーム複合体は一時的にさらに3日後に回復した3日目でマウス肺におけるITSN-1Sタンパク質およびmRNAをノックダウン。再現性のある安全なキャリアとしてのカチオン性リポソームを利用して、研究では、24日間延長した。したがって、新たに生成された複合体と眼窩治療は研究4を通して持続KD ITSNを誘発、3日ごとに投与した。いくつかの時点後のsiRNA ITSNで収集されたマウス組織、肺内皮に、慢性KD ITSNの効果を評価するために電子顕微鏡（EM）分析に供した。高分解能EMイメージングは、私たちは、肺血管床でKDITSNによって生じる形態学的変化を評価することができ、光学顕微鏡によって特性が検出不能、（内皮障壁すなわち崩壊、カベオラの数と代替輸送経路のアップレギュレーションを減少させた）。全体として、これらの調査結果は重要を設立ECの機能と肺の恒常性におけるITSN-1の重要な役割、in vivoでのsiRNA-リポソームの配信の有効性を示す一方。
Introduction
裸のsiRNAは、細胞膜を透過できない負に帯電され、それは血液中の酵素、組織および細胞によって容易に分解される。さえ安定性を向上させるために、最近構造的修飾を、投与後の標的部位でのsiRNAの蓄積が極めて低く、効率的な細胞内の車両5を必要とする。カチオン性リポソームは、カプセル化酵素分解6から核酸を保護することによって、細胞へのDNA / RNAの大部分を転送する可能性のある安全な核酸キャリアとして浮上した。また、カチオン性リポソームは、自発的にこのようにセル2への遺伝子導入を推進し、DNA / RNAと相互作用する。より最近では、リポソームワクチン及び低分子量薬物7送達するために適用されている。のリポソーム送達、マイクロRNA-7発現プラスミドは、8肺癌細胞における上皮成長因子受容体チロシンキナーゼ阻害剤耐性を克服する。ターゲットとした場合複合体は内皮関門を通過し、間質9で浸出しにくいので、血管内皮は、静脈内送達が不可欠です。他の臓器との比較によって、肺微小血管からのECの最大吸収を有し、熱心にリンパ節およびパイエル板9に続くカチオン性リポソームおよびDNA / RNA複合体を、内在。眼窩または尾静脈注射を介したsiRNAの齧歯類モデルにおける静脈内送達は、50 mg / kgを10のような高濃度でも無害証明されています。公表された文献で は、カチオン性リポソームの組成物は、脂質製剤とそのモル比11、12に基づいて異なります。 、ワクチンや抗腫瘍療法13-15の配信をタンパク質のdown-regulation/over-expressionをターゲットにするかどうかを、in vivoでの遺伝子送達のためのカチオン性リポソームを用いた潜在的なアプリケーションの広い配列があります。覚えておくことが重要DNA / RNA-細胞膜との相互作用の効率が生成錯体、膜脂質の間のカップリングの形状によって規制されることである。これは、標的細胞膜プロファイルに脂質組成物を調整することは、特定の細胞型6にトランスフェクション率の高さに有益かつ結果であり得ることを示唆している。
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Protocol
1。カチオン性リポソームの調製
- lipososmesの調製に使用される清浄な丸底フラスコをオートクレーブ。
- ストック溶液を準備します。
- - 小さなガラスの瓶を用いて10ミリリットルのクロロホルムにジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（2本の川に挟まれた地域）の200mgのを溶かす。
- - 小さなガラスの瓶を用いて10ミリリットルのクロロホルム中コレステロール200 mgのを溶かす。
- - RNA / DNAアーゼフリーの蒸留水を100mlの5％ブドウ糖を殺菌するための準備をし、オートクレーブ。
- クロロホルムで丸底フラスコをすすぐ。フラスコ、渦に5-10 mlを加え、それが数分放置。すべての回で、アルミ箔で覆われたフラスコを保つ。フラスコからクロロホルムを空にします。
- リポソームの調製：
- - 丸底フラスコに2本の川に挟まれた地域ストック溶液315μLを加える。
- - フラスコにコレステロール原液200μlのを追加します。
- - フラスコにクロロホルムの9.5ミリリットルを追加ndは渦によって混ぜる。
- 37℃でロータリーエバポレーターを設定°C、100分当たりの回転数（rpm）以上（100-120 rpm）で。ロタベーパーが正しく接続され、吸引管の水ポンプ真空制御に接続する必要があります。
- アルゴンガスタンクとロータリーエバポレーターを接続します。
- 回転蒸発にフラスコを取り付け、水浴中でそれを下げる前に、最適な設定を調整します。それは反時計回りに回して完全にアルゴンのための最初のバルブを開きます。必ず最初にこのバルブを開いたり閉じたり。二弁は、フラスコに吹いアルゴン圧力を制御する。圧力は常に穏やかでなければなりません。
- 完全に水没されずに水に触れると速度をオンにするフラスコのために十分な、水浴中でロータリーエバポレーターを下げます。
- 約10分、すべてのクロロホルム蒸発するまで待ちます。その後、マシンを停止します。
- 回転蒸発速度とアルゴンタンクバルブをオフにします。今フラスコを削除する必要があります。
- 番目に、5％ブドウ糖2 mlを加えeはフラスコ脂質を溶解する。
- 完全にすべての脂質を溶解し、1mlのピペットチップを用いて、フラスコの底部を傷つける。必要に応じてスクラッチした後、第二のチップで、1ミリリットルの先端からフラスコ内に残っている脂質を除去。
- ゆっくり（15 rpm）でフラスコをボルテックスしながら42℃の水浴中で得られた溶液をインキュベートする。
- 冷たい水で超音波処理装置バットを埋める。持ちこたえフラスコとかろうじて水に触れる底の少なくとも20〜30分のためのソリューションを超音波処理。
- 42で20分間ロータリーエバポレーターの水浴°水に浸漬丸底でゼロ速度でC、、、この時点でフラスコを加熱する。
- 0.47ミクロン、その後、0.22ミクロンのシリンジフィルターを通してリポソームをフィルタリング。
- 小さな押出機を使用して、単層リポソームベシクルの均質の集団を生成するために50 nmの膜を介してリポソームをフィルタリング。
- エッペンドルフチューブに、リポソームを移し、氷の上に置きます。
2。リポソームを準備したsiRNA-ITSN-1複合体
- 2μgの/μlの最終濃度20mMのHEPESおよび150mMの塩化ナトリウム、pH7.4中、siRNAを含有する緩衝液中のターゲット上のマウスのsiRNA ITSNを再懸濁する。混合する前に、氷の上でそれを維持。
- 2μgのRNAを（または400 nmolのリポソーム：100μgのセンスsiRNA ITSN）8 nmolのリポソームの割合でのsiRNA ITSN複合体：リポソームを準備します。本研究では、原液（50μM）からのRNA / DNAアーゼフリーのエッペンドルフチューブを使用して新たに調製したリポソームの100μlにするsiRNA ITSN50μlのを追加しました。混合物150μlの最大が両側と眼窩一度マウスに注入することができるためのsiRNA ITSNの濃度が非常に重要であることに注意してください。
- マウスを注入するために待機している間に氷の上に混合物を保管してください。
3。マウス眼窩静脈注射（目のソケットの内角）
jove_content ">すべてのマウスの実験はラッシュ大学制度動物実験委員会のガイドラインに基づいて承認され、実施された。- 50 mg / kg体重のケタミンおよび5 mg / kg体重のキシラジン（市販の混合物）の腹腔内注射によってマウスを麻酔。動物の体重と年齢に応じて、麻酔薬の量と濃度を調整します。研究マウスで使用したマウスは、6〜8週齢CD1雄性マウスであり、25グラムの周りに重量を量る。注射器は、針を取り付けたツベルクリン1ミリリットルタイプです。
- 片手でマウスの耳を持ち、目の内角を公開する側の上でマウスを断る。半月襞の内側を目指し、眼球に触れないようにしてください。
- すべての3つの軸で45度の角度で混合物を含有する注射器を持って、目の涙丘に近づく。
- ゆっくり混合物を注入し、注入された側にまで回復するには、マウスを聞かせて。もし大規模な液体針挿入場所で滴形としては、注射器に針、吸引背中滴を撤回して、もう一度試してください。反復注射は最高の完璧な回復を可能にするために、目を交互にすることによって行われます。不明な場合は、この技術は、青色色素（50μlを、メタノール中の0.5％クリスタルバイオレット）を注入し、青色脈管構造を観察するために、マウスの肺を露光することによって確認することができる。
- 本研究ではマウスは死亡や副作用なしで3週間毎に3 日目に注射した。
4。生化学的研究のためのマウス肺血流と組織収集
- 1.5ml /分で実行するように蠕動ポンプを設定します。
- 人工呼吸器、手術台、楽器、滅菌綿棒、綿棒、文字列、ビーカー、蒸留水、ハンクス、トレーサー：設定を準備します。
- 麻酔薬混合物（100 mg / kg体重のケタミンおよび10 mg / kg体重のキシラジン）の腹腔内注射によってマウスを麻酔。 首のレベルでは、唾液腺を除去し、気管を露出する。
- 開腹、消費税ダイアフラムで始まり、肺と心臓を露出させ、開胸術とフォロー。
- 胸腺を削除します。
- 精度向上のために光学顕微鏡を用いて、肺動脈カテーテルを挿入。
- 気管切開を行い、気管切開を使用して、マウスを挿管。 150ストローク/分、150μlに行程容積率に人工呼吸器を設定します。
- 出口として、左心房を開きます。
- 蠕動ポンプと37℃で温めハンクス溶液℃までを使用して、5分間の血液の自由マウス肺血管系の灌流
- 同じ流速でさらに10分間トレーサー（8nmの金アルブミン16）を灌流。
- ハンクス溶液で5分間の肺灌流により非結合トレーサーをフラッシュします。
- 4％（重量/体積）ホルムアルデヒド、2.5％グルタルアルデヒド、および0.1 PIPES 1％タンニン酸の10分灌流により肺のその場固定ででフォロー緩衝液、pH 7.2。
- 肺を収集し、過剰な組織を除去する小さなブロック（3/3 mm）をカットし、固定液混合の2ミリリットルを含むラベルの付いたシンチレーションバイアルにそれらを配置する。
マウスは、手順の間に完全に麻酔期限切れになります。
5。 EMのマウス肺組織処理
- 1％パラディOSO 4、ベロナールアセテート、ケレンベルガーバッファー：ストック溶液を準備します。
- - 1％パラディ-OSO 4バッファが含まれています、1mlの酢酸ベロナール株式、1.25ミリリットル4％OSO 4、アップ最終容量5mlの1〜0.1 mlのN塩酸、蒸留水を。
- - アセテートベロナールストック溶液1.15グラムの酢酸ナトリウムandydrous及び蒸留水100ml中バルビタール2.94グラムに溶解したものである。
- -ケレン溶液は、酢酸ベロナール在庫2mlを、2.8mlの0.1 N塩酸、0.05グラムの酢酸ウラニル、および5.1ミリリットル含まれている蒸留水はpH = 6。
- 簡潔に、0.1Mカコジル酸ナトリウム緩衝液、pH = 7.4、3回の肺ブロックを洗ってください。
- 室温で、1時間、0.1 PIPES緩衝液中で4％（重量/体積）ホルムアルデヒド、2.5％グルタルアルデヒド、pHは7.2で標本を修正。
- 暗闇の中で、氷の上、フード内で1時間1％パラディ - オスミウムで後固定します。
- ケレンベルガーバッファで一回すすいでください。
- 室温で、一晩2時間ケレンバッファ内の試料をインキュベートする。
- 50％エタノールで一度すすいでください。
- 70％、95％、次いで2×15分、100％エタノール：エタノールの傾斜シリーズ、5分/各々に脱水する。
- 100％のプロピレンオキシド、2×15分間に切り替える。
- プロピレンオキシドを除去し、50％のプロピレンオキサイドと50％エポン812の混合物を加え、室温で、車輪に回転し、一晩インキュベートする。
- 翌朝、混合物を除去し、ホイールに少なくとも4-5時間、新鮮なエポン812を追加します。
- いっぱい、倍増テーパー型を使用した新鮮な100％エポン812との半分の方法は、選択された標本を追加し、エッジにそれらを配置します。
- 60℃インキュベーターセットに金型を移動し、それらを48〜72時間のために治すことができます。
- 重合すると、切片（厚さ60〜70 nm）と薄くするブロックを送信します。
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Representative Results
ITSN-1Sタンパク質およびmRNAレベルは、ウェスタンブロットおよび4と従来の定量PCRでのsiRNA ITSN配信後のいくつかの時点でモニターした。 siRNAをITSN処理マウスの肺におけるITSN-1Sタンパク質およびmRNAレベルは21日間ITSN-1Sの連続ノックダウン時にコントロールを参照することにより、約75％低かった。 ITSN-1がなければ、ダイナミン-2、形質膜からカベオラの剥離でITSN-1S、必要不可欠なプレーヤーの主要な相互作用パートナーを効率的にエンドサイトーシスのサイトに補充されておらず、原形質膜と遊離小胞の形成から、それによって、カベオラ剥離キャリアは1、17を中断されます。したがって、効果のない膜分裂や無料水疱キャリアの障害形成が欠損エンドサイトーシスと内皮輸送、インター内皮障壁の崩壊と肺水腫（ 図1）を引き起こした。 ITSN-1Sアップレギュレート代替TRのまた、ダウンレギュレーションansportはエンドサイトーシス欠損を補うために経路。我々は積極的に取り込みと輸送金アルブミンに関わる代表的なカベオラ（ 図2C）と融合した膜リング（ 図2Aおよび2A1）、多形細管（ 図2B）、およびエンドソーム拡大に気づいた。重要な発見は、コントロールへの参照によってITSN-1欠損マウスの肺内皮におけるカベオラ数の減少は 、 表1である。カチオン性リポソーム/のsiRNA ITSNの再配達で24日間延長されたITSN-1阻害は、部分的に間内皮障壁の完全性を復元することにより、マウスで肺水腫を減少させた。 EM形態学的研究は、8nmの金アルブミントレーサーが、この時点で、インター内皮接合部を貫通していないことを示した。代わりに、彼らは接合部の管腔の祭文でろ過残（ 図3）を形成。しかし、血管周囲のスペースは、いくつかの拡張を示し、軽度の浮腫、接合粒子のこのサイズに対して不透過性であるが、それでも漏洩することを示唆している。また、別のエンドサイトーシス経路の形態的中間体は、アクティブと高い数字に存在している。著しく、形態学的分析は、コントロール、 表1と比較した場合、金アルブミン粒子により標識膜リング/細管の数がITSN-1S慢性欠損マウス肺内皮に14倍に増加したことが示された。カベオラ番号が部分的にコントロールを参照することによって、わずか17.8％減少して復元される。したがって、我々の結果は、カチオン性リポソーム/のsiRNA ITSN複合体の再配達は、 生体内で長期的なタンパク質のノックダウンの影響を研究するのに適した方法論であることを実証。
図1。オープンinterendothelial接合（IEJs）ラベル番目を示す代表的な電子顕微鏡写真8 nmの金粒子アルブミン。アローヘッドによってその長さroughoutとポイントIEJの広い開口部を示す同計画の中で互いに近接して配置さ三から四金アルブミン粒子に、a1を拡大。 （ -矢印A、B）の金粒子もIEJsの管腔外終了に関連付けられています。アスタリスク）、また、カベオラとpericapillary宇宙個の拡張の数が限られて注意してください。バー：200nmの（）; 100nmの（B、A1）。
図2。 ITSN-1の発現の急性摂動は、多形性エンドサイトーシス/トランスサイトーシス中間体を誘導する。代表のEMが8nm金アルブミンでロード膜リングの画像（A1）、管状要素（B、矢印）と拡大がエンドソーム（C、矢印）を、そしてカベオラのように関連付けられている形態。また、血管周囲の空間（PVS）とタンパク性浮腫（）の激しい拡張に注意してください。バー：250nmの（）; 200nmの（B）は100nm（A1、C）。
図3。 ITSN-1の発現の阻害は、慢性的な部分IEJの整合性を復元します。IEJ（矢じり）の管祭文でろ過残。 PVSの軽度の拡張（*）はIEJsの漏出を示唆している。多小胞体（MVB）は、形質膜の近傍には8nmの金粒子で標識アルブミン、その内部小胞の一部を持っています。バー：100 nmである。
| エンドサイトーシス/トランスサイトーシス構造 | コントロール | ITSN-1 siRNAを、72時間 | ITSN-1 siRNAを、24 D |
| ルーメン*に開放カベオラ | 106.6±9.5 | 50.46±4.8 | 87.15±5.9 |
| 細胞質に明らかに自由にカベオラ | 173.5±12.0 | 77.41±6.3 | 143.0±9.5 |
| 合計カベオラ（腔側と細胞質内の空き） | 280.1±21.5 | 127.86±11.1 | 230.14±15.4 |
| 異常なエンドサイトーシス構造（拡大エンドソーム） | 2.65±0.34 | 11.29±2.7 | 14.93±3.8 |
| カベオラクラスター | 3.95±0.4 | 5.64±1.6 | 11.3±2.5 |
| 膜リング | 1.33±.04 | 9.47±2.4 | 12.8±2.8 |
| 細管 | 0.88±.05 | 4.0±1.3 | 18.84±3.4 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dimethyl Dioctadecyl Ammonium Bromide (DOAB) | Sigma-Aldrich | D2779 | |
| LiposoFast stabilizer (mini-extruder) | Avestin Inc. | LF-STB | |
| Polycarbonate membrane, 19 mm diameter, 50 nm pore | Avestin Inc. | LFM-50 | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C-8667 | |
| Chloroform | Mallinckrodt Chemicals | 4432-04 | |
| Hank's balanced salts | Sigma-Aldrich | H1387 | |
| Round-bottom flask | Fisher Scientific | FHB-275-030X | |
| Mouse siRNAITSN - on target | Dharmacon/ThermoScientific | J-046912-11 | |
| Peristaltic pump | Ismatec | REGLO-CDF digital with RHOO pump head | |
| Ventilator | Hugo Sachs Electronik | NA | |
| Barbital | Sigma-Aldrich | B-0500 | |
| Uranyl acetate | EM Sciences | 22400 | |
| Epon812 | EM Sciences | Discontinued by the manufacturer | |
| Propylene oxide | EM Sciences | 20400 | |
| Embedding molds | EM Sciences | 69923-05 | |
| Tannic acid | EM Sciences | 21710 | |
| 8 nm gold-albumin tracer | Prepared in the laboratory as in16 | ||
| Comments | |||
| Equipped with 2 Avestin 1 ml gas-tight syringes (cat. # LF-1) | |||
| Pyrex, 100 ml | |||
| Modified siRNA, in vivo | |||
| Part of IDEX corp. | |||
| D-79232 March, Germany | |||
| Replaced with Embed812, cat. # 14120 | |||
References
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