Summary

양이온 성 리포좀을 통해 특정의 siRNA 반복 전달하여 마우스 폐 Intersectin-1의 장기 침묵. 전자 현미경에 의한 넉다운 효과의 평가

Published: June 21, 2013
doi:

Summary

생쥐의 양이온 liposomes/siRNA/ITSN-1s 단지 24 일 동안 72 시간마다 반복적으로 복고풍 궤도 주사 효율적으로 75 %에 ITSN – 초 발현 및 단백질 발현을 감소 마우스 폐 미세 혈관에 siRNA의 양면을 제공합니다. 이 기술은 동물 모델에서 높은 재현성, 부작용이없고 사망을 방지합니다.

Abstract

이전 연구는 ITSN – 초 (KD ITSN), 폐 혈관 투과성과 내피 세포 (내피) 생존에 의한 세포 사멸 세포 죽음, ITSN – 초 장기와 세포 배양 시스템 개발의 주요 장애물을 조절에 관여 endocytic 단백질의 최저를 보였다 억제 1. 사업자로서 양이온 성 리포좀을 사용하여, 우리는 ITSN-1 유전자 (의 siRNA ITSN) 대상의 siRNA의 전신 투여가 마우스 폐에 ITSN – 초 유전자의 침묵을 탐구. 2 생산, 반복 투여에 안전 nonimmunogenic, 비 독성, 쉬운 : 양이온 리포좀의 siRNA 전달을위한 몇 가지 장점을 제공합니다. 리포솜의 성능 및 생물 학적 활동은 콜레스테롤과 디메틸 dioctadecyl 암모늄 브로마이드 조합을 사용하여 크기, 전하, 지질 구성, 안정성, 용량 및 투여 3의 경로를 여기에, 효율적으로 획득 한 마우스의 폐에서 특정 KD ITSN에 따라 달라집니다. 정맥 배달의 siRNA ITSN의 / 양이온 성 리포좀과의 복합체는 일시적으로 추가 3 일 후에 회수 3 일에서 마우스 폐 ITSN – 초 단백질 발현을 무너 뜨렸다. 반복 안전한 항공사로서 양이온 성 리포좀의 활용, 연구는 24 일 연장했다. 따라서, 갓 생성 된 단지 레트로 궤도 치료 연구 4에 걸쳐 지속적인 KD ITSN을 유도마다 3 일 투여 하였다. 여러 시점 이후의 siRNA ITSN에서 수집 마우스 조직은 폐 내피에서, 만성 KD ITSN의 효과를 평가하기 위해 전자 현미경 (EM) 분석을 실시 하였다. 고해상도 EM 영상은 우리가 폐 혈관 침대에 KDITSN에 의한 형태 학적 변화를 평가 할 수 광학 현미경으로 특성을 비 감지 (내피 장벽 즉, 중단, caveolae의 수 및 대체 수송 경로의 upregulation를 감소). 전반적으로 이러한 연구 결과는 impor에 설립ECS의 기능과 폐 항상성 ITSN-1의 TANT 역할, 생체 내에서의 siRNA – 리포좀 전달의 효과를 설명하면서.

Introduction

알몸의 siRNA는 세포막을 통과 할 수없는 부정 청구되고, 그것은 혈액에있는 효소, 조직, 세포로 쉽게 저하됩니다. 심지어 안정성을 향상시키기 위해 최근 구조 변경과 함께 투여 후 대상 사이트에서 siRNA의 축적은 매우 낮고 효율적으로 세포 내 자동차는 5 필요합니다. 양이온 성 리포좀 캡슐화 및 효소 분해 6에서 핵산을 보호하여 세포에 DNA / RNA의 큰 조각을 전송하는 잠재적 인 안전 핵산 항공사로 나타났다. 또한, 양이온 성 리포좀은 저절로 따라서 세포 2 유전자 전달을 촉진, DNA / RNA와 상호 작용합니다. 더 최근 리포솜 백신과 저 분자량 약 7을 제공하기 위해 적용되었습니다. 플라스미드 마이크로 RNA-7-표현의 리포좀 전달 폐암 세포 8 표피 성장 인자 수용체 티로신 키나제 억제제 저항을 극복한다. 을 대상으로 할 때단지는 내피 장벽을 통과하고 간질 9에 extravasate 할 가능성이 있기 때문에 혈관 내피 세포는 정맥 배달이 필수적이다. 다른 기관과 비교하여 폐의 미세 혈관에서 ECS 가장 큰 이해를 가지고 탐욕스럽게 림프절과 Peyer의 패치를 9 다음에 양이온 성 리포좀과 DNA / RNA 복합체를 내면화. 복고풍 궤도 또는 꼬리 정맥 주사를 통해 siRNA의의 설치류 모델에서 정맥 배송은 심지어 50 ㎎ / ㎏ 10 높은 농도에 무해 입증되었습니다. 게시 된 문헌에서 양이온 성 리포솜의 구성은 지질 정립과 같은 몰 비율이 11, 12에 따라 다릅니다. 백신이나 항 종양 치료 13-15의 전달 단백질의 down-regulation/over-expression을 대상으로하는지, 생체 내 유전자 전달을위한 양이온 리포좀을 사용하여 잠재적 인 응용 프로그램의 광범위한 배열이 있습니다. 기억하는 것이 중요합니다DNA / RNA-세포막 상호 작용의 효율성이 생성 단지와 막 지질 사이의 결합 형태에 의해 규제되는 것입니다. 이 대상 세포막의 프로필에 지질 성분을 맞게하는 특정 세포 유형 6 형질의 높은 속도에 유익하고 결과가 될 수 있다는 것을 제안합니다.

Protocol

1. 양이온 성 리포좀 준비 lipososmes 준비에 사용되는 깨끗한 둥근 바닥 플라스크를 압력솥. 주식 솔루션을 준비 : – 작은 유리 병을 사용하여 10 ㎖의 클로로포름에 디메틸 dioctadecyl 암모늄 브로마이드 (DOAB)의 200 밀리그램을 녹인다. – 작은 유리 병을 사용하여 10 ㎖의 클로로포름 콜레스테롤 200 mg의 녹인다. – 준비 및 100 RNA의 ML / DNA-ASE 무료 증류수에 5 …

Representative Results

ITSN – 초 단백질과 mRNA의 수준은 서양 얼룩과 4에서와 같이 기존의 정량 PCR로의 siRNA ITSN 배달 후 몇 시간 지점에서 관찰되었다. siRNA를 ITSN 처리 쥐의 폐에있는 ITSN – 초 단백질과 mRNA의 수준 21 일 ITSN-1의 연속 최저 동안 컨트롤을 참조하여 약 75 % 감소했다. ITSN – 초없이, dynamin를-2, 세포막에서 caveolae의 박리 ITSN-1과 핵심 선수의 주요 상호 작용 파트너를 효율적으로 endocytic 사?…

Discussion

우리가 장기적으로 특정 siRNA의 / 리포좀 복합체의 반복 정맥 주사 (연속 24 일 동안 매일 72 시간)에 의해 생체 내에서 ITSN-1의 노크에 대해이 방법을 개발 한 사람 9 우리 1, 18에 의해 출판 이전의 연구에 기초를 두는. 이 실험 방법은 효율적이며 안전하고 반복적으로 사용할 수 있으며, 그것은 쉽게 폐 내피 세포 및 폐 항상성에 대한 관심의 단백질을 코딩하는 유전자의 참여?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 SP에 건강 보조금 R01HL089462의 국립 연구소에 의해 지원되었다.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number
Dimethyl Dioctadecyl Ammonium Bromide (DOAB) Sigma-Aldrich D2779
LiposoFast stabilizer (mini-extruder) Avestin Inc. LF-STB
Polycarbonate membrane, 19 mm diameter, 50 nm pore Avestin Inc. LFM-50
Cholesterol Sigma-Aldrich C-8667
Chloroform Mallinckrodt Chemicals 4432-04
Hank’s balanced salts Sigma-Aldrich H1387
Round-bottom flask Fisher Scientific FHB-275-030X
Mouse siRNAITSN – on target Dharmacon/ThermoScientific J-046912-11
Peristaltic pump Ismatec REGLO-CDF digital with RHOO pump head
Ventilator Hugo Sachs Electronik NA
Barbital Sigma-Aldrich B-0500
Uranyl acetate EM Sciences 22400
Epon812 EM Sciences Discontinued by the manufacturer
Propylene oxide EM Sciences 20400
Embedding molds EM Sciences 69923-05
Tannic acid EM Sciences 21710
8 nm gold-albumin tracer Prepared in the laboratory as in16
Comments
Equipped with 2 Avestin 1 ml gas-tight syringes (cat. # LF-1)
Pyrex, 100 ml
Modified siRNA, in vivo
Part of IDEX corp.
D-79232 March, Germany
Replaced with Embed812, cat. # 14120

References

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Bardita, C., Predescu, D., Predescu, S. Long-term Silencing of Intersectin-1s in Mouse Lungs by Repeated Delivery of a Specific siRNA via Cationic Liposomes. Evaluation of Knockdown Effects by Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (76), e50316, doi:10.3791/50316 (2013).

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