Summary

Silenciar a largo plazo de Intersectin-1 en los pulmones de ratones por entrega repetida de un siRNA específico a través de liposomas catiónicos. Evaluación de Efectos desmontables de Microscopía Electrónica

Published: June 21, 2013
doi:

Summary

Inyecciones retro-orbitales repetidas de complejos catiónicos liposomes/siRNA/ITSN-1s en ratones, cada 72 horas durante 24 días, eficiente entregar el dúplex siARN de la microvasculatura pulmonar del ratón la reducción de ARNm ITSN-1s y expresión de la proteína en un 75%. Esta técnica es altamente reproducible en un modelo animal, no tiene efectos adversos y evita accidentes mortales.

Abstract

Estudios anteriores mostraron que desmontables de ITSN-1s (KD ITSN), una proteína implicada en la regulación endocítica permeabilidad vascular pulmonar y células endoteliales (EC) la supervivencia, la muerte celular apoptótica inducida, un obstáculo importante en el desarrollo de un sistema de cultivo celular con prolongada ITSN-1s inhibición 1. Utilizando liposomas catiónicos como vehículos, exploramos el silenciamiento de genes ITSN-1 en los pulmones de ratones mediante la administración sistémica de siRNA dirigidos ITSN-1 gen (ITSN siRNA). Los liposomas catiónicos ofrecen varias ventajas para la salida del siRNA: caja fuerte con dosificación repetida, no inmunogénico, no tóxico, y fácil de producir 2. Los liposomas rendimiento y la actividad biológica dependen de su tamaño, carga, composición de lípidos, la estabilidad, la dosis y la vía de administración 3 Aquí, eficiente y ITSN KD específica en los pulmones del ratón se ha obtenido mediante una combinación bromuro de amonio y dimetil dioctadecil colesterol. La administración intravenosade ITSN siRNA / complejos de liposomas catiónicos transitoriamente derribaron proteína ITSN-1 y mRNA en los pulmones de ratones en el día 3, que se recuperó después de 3 días adicionales. Tomando ventaja de los liposomas catiónicos como un portador seguro repetible, el estudio extendió durante 24 días. Por lo tanto, el tratamiento retro-orbital con complejos recién generados se administró cada 3 días, induciendo ITSN KD sostenida a lo largo del estudio 4. Tejidos de ratón recogidos en varios puntos de tiempo post-siRNA ITSN fueron sometidos a análisis de microscopía electrónica (EM) para evaluar los efectos de la crónica KD ITSN, en el endotelio pulmonar. De alta resolución de imágenes EM nos permitió evaluar los cambios morfológicos causados ​​por KDITSN en el lecho vascular pulmonar (es decir, la interrupción de la barrera endotelial, disminución del número de caveolae y la regulación positiva de las vías de transporte alternativos), las características no detectables por microscopía de luz. En general estos resultados establecieron un importantetante papel de ITSN-1 en la función de EC y la homeostasis de pulmón, mientras que ilustra la eficacia de la entrega de siRNA-liposomas in vivo.

Introduction

ARNsi desnudo no puede penetrar la membrana celular, siendo cargado negativamente, y es fácilmente degradado por enzimas en la sangre, tejidos y células. Incluso con recientemente modificaciones estructurales para mejorar la estabilidad, la acumulación de siRNA en el sitio diana después de la administración es extremadamente baja y requiere un vehículo intracelular eficiente 5. Los liposomas catiónicos surgieron como seguras ácidos nucleicos portadores con el potencial de transferir grandes piezas de ADN / ARN en las células mediante la encapsulación y la protección de los ácidos nucleicos a partir de la degradación enzimática 6. También, los liposomas catiónicos espontáneamente interactúan con el ADN / ARN, promoviendo así la transferencia de genes a las células 2. Más recientemente, los liposomas se han aplicado para entregar vacunas y fármacos de bajo peso molecular 7. Entrega liposomal de microARN-7-plásmido que expresa supera factor de crecimiento epidérmico receptor de la tirosina quinasa inhibidor de la resistencia en las células de cáncer de pulmón 8. Cuando el objetivo es laendotelio vascular, la administración intravenosa es esencial, ya que los complejos son poco probable que cruzar la barrera endotelial y extravasación en el intersticio 9. En comparación a otros órganos, ECs de la microvasculatura del pulmón tener el mayor absorción y ávidamente internalizar liposomas catiónicos y complejos de ADN / ARN, seguido por los ganglios linfáticos y los parches de Peyer 9. La entrega por vía intravenosa en modelos de roedores de ARNsi a través de inyecciones en la vena retro-orbital o de la cola ha sido probado ser inofensivas incluso en altas concentraciones, tales como 50 mg / kg 10. En la literatura publicada la composición de los liposomas catiónicos es diferente, basada en la formulación de lípidos y su relación equimolar 11, 12. Hay una amplia gama de aplicaciones potenciales utilizando liposomas catiónicos para la entrega de genes in vivo, ya sea dirigiéndose down-regulation/over-expression de las proteínas, la entrega de vacunas o terapias anti-tumorales 13-15. Es importante recordares que la eficiencia de ADN / ARN-interacción membrana celular está regulada por el acoplamiento de forma entre los complejos generados y lípidos de membrana. Esto sugiere que la adaptación de la composición de los lípidos de los perfiles de la membrana celular específicos puede ser beneficioso y el resultado en altas tasas de transfección en un tipo de célula particular 6.

Protocol

1. Los liposomas catiónicos Preparación Autoclave un matraz limpio para ser utilizado para la preparación lipososmes. Preparar soluciones madre: – Disolver 200 mg de bromuro de dimetil dioctadecil amonio (Doab) en 10 ml de cloroformo usando una botella de vidrio pequeño. – Disolver 200 mg de colesterol en 10 ml de cloroformo usando una botella de vidrio pequeño. – Preparar y esterilizar en autoclave para esterilizar el 5% de glucosa en 100 ml de ARN /…

Representative Results

Los niveles de proteína ITSN-1s y el ARNm se controlaron a varios puntos de tiempo después de siRNA entrega ITSN por Western blot y PCR convencional y cuantitativo como en 4. Los niveles de proteína ITSN-1s y ARNm en siRNA ITSN pulmones tratados con ratón fueron aproximadamente 75% más baja por referencia a los controles durante la caída continua de ITSN-1s durante 21 días. Sin ITSN-1s, dynamin-2, una importante interacción socio de jugador ITSN-1s y esencial en el desprendimient…

Discussion

Con base en estudios anteriores publicados por otros 9 y nosotros 1, 18 hemos desarrollado esta metodología para el largo plazo derribar de ITSN-1 in vivo mediante la administración intravenosa repetida (cada 72 horas, durante 24 días consecutivos) de siRNA / liposoma. Este enfoque experimental es eficaz, se puede utilizar de forma segura y en repetidas ocasiones y que se puede extender fácilmente para estudiar la implicación de un gen que codifica cualquier proteína de interés en e…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Salud Subvenciones R01HL089462 a SP.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number
Dimethyl Dioctadecyl Ammonium Bromide (DOAB) Sigma-Aldrich D2779
LiposoFast stabilizer (mini-extruder) Avestin Inc. LF-STB
Polycarbonate membrane, 19 mm diameter, 50 nm pore Avestin Inc. LFM-50
Cholesterol Sigma-Aldrich C-8667
Chloroform Mallinckrodt Chemicals 4432-04
Hank’s balanced salts Sigma-Aldrich H1387
Round-bottom flask Fisher Scientific FHB-275-030X
Mouse siRNAITSN – on target Dharmacon/ThermoScientific J-046912-11
Peristaltic pump Ismatec REGLO-CDF digital with RHOO pump head
Ventilator Hugo Sachs Electronik NA
Barbital Sigma-Aldrich B-0500
Uranyl acetate EM Sciences 22400
Epon812 EM Sciences Discontinued by the manufacturer
Propylene oxide EM Sciences 20400
Embedding molds EM Sciences 69923-05
Tannic acid EM Sciences 21710
8 nm gold-albumin tracer Prepared in the laboratory as in16
Comments
Equipped with 2 Avestin 1 ml gas-tight syringes (cat. # LF-1)
Pyrex, 100 ml
Modified siRNA, in vivo
Part of IDEX corp.
D-79232 March, Germany
Replaced with Embed812, cat. # 14120

References

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Bardita, C., Predescu, D., Predescu, S. Long-term Silencing of Intersectin-1s in Mouse Lungs by Repeated Delivery of a Specific siRNA via Cationic Liposomes. Evaluation of Knockdown Effects by Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (76), e50316, doi:10.3791/50316 (2013).

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