Silenciar a largo plazo de Intersectin-1 en los pulmones de ratones por entrega repetida de un siRNA específico a través de liposomas catiónicos. Evaluación de Efectos desmontables de Microscopía Electrónica

Summary

Inyecciones retro-orbitales repetidas de complejos catiónicos liposomes/siRNA/ITSN-1s en ratones, cada 72 horas durante 24 días, eficiente entregar el dúplex siARN de la microvasculatura pulmonar del ratón la reducción de ARNm ITSN-1s y expresión de la proteína en un 75%. Esta técnica es altamente reproducible en un modelo animal, no tiene efectos adversos y evita accidentes mortales.

Abstract

Estudios anteriores mostraron que desmontables de ITSN-1s (KD _ITSN), una proteína implicada en la regulación endocítica permeabilidad vascular pulmonar y células endoteliales (EC) la supervivencia, la muerte celular apoptótica inducida, un obstáculo importante en el desarrollo de un sistema de cultivo celular con prolongada ITSN-1s inhibición ^1. Utilizando liposomas catiónicos como vehículos, exploramos el silenciamiento de genes ITSN-1 en los pulmones de ratones mediante la administración sistémica de siRNA dirigidos ITSN-1 gen _(ITSN siRNA). Los liposomas catiónicos ofrecen varias ventajas para la salida del siRNA: caja fuerte con dosificación repetida, no inmunogénico, no tóxico, y fácil de producir ^2. Los liposomas rendimiento y la actividad biológica dependen de su tamaño, carga, composición de lípidos, la estabilidad, la dosis y la vía de administración ³ Aquí, eficiente y _ITSN KD específica en los pulmones del ratón se ha obtenido mediante una combinación bromuro de amonio y dimetil dioctadecil colesterol. La administración intravenosade _ITSN siRNA / complejos de liposomas catiónicos transitoriamente derribaron proteína ITSN-1 y mRNA en los pulmones de ratones en el día 3, que se recuperó después de 3 días adicionales. Tomando ventaja de los liposomas catiónicos como un portador seguro repetible, el estudio extendió durante 24 días. Por lo tanto, el tratamiento retro-orbital con complejos recién generados se administró cada 3 días, induciendo _ITSN KD sostenida a lo largo del estudio ^4. Tejidos de ratón recogidos en varios puntos de tiempo post-siRNA _ITSN fueron sometidos a análisis de microscopía electrónica (EM) para evaluar los efectos de la crónica KD _ITSN, en el endotelio pulmonar. De alta resolución de imágenes EM nos permitió evaluar los cambios morfológicos causados ​​por KDITSN en el lecho vascular pulmonar (es decir, la interrupción de la barrera endotelial, disminución del número de caveolae y la regulación positiva de las vías de transporte alternativos), las características no detectables por microscopía de luz. En general estos resultados establecieron un importantetante papel de ITSN-1 en la función de EC y la homeostasis de pulmón, mientras que ilustra la eficacia de la entrega de siRNA-liposomas in vivo.

Introduction

ARNsi desnudo no puede penetrar la membrana celular, siendo cargado negativamente, y es fácilmente degradado por enzimas en la sangre, tejidos y células. Incluso con recientemente modificaciones estructurales para mejorar la estabilidad, la acumulación de siRNA en el sitio diana después de la administración es extremadamente baja y requiere un vehículo intracelular eficiente ^5. Los liposomas catiónicos surgieron como seguras ácidos nucleicos portadores con el potencial de transferir grandes piezas de ADN / ARN en las células mediante la encapsulación y la protección de los ácidos nucleicos a partir de la degradación enzimática ^6. También, los liposomas catiónicos espontáneamente interactúan con el ADN / ARN, promoviendo así la transferencia de genes a las células ^2. Más recientemente, los liposomas se han aplicado para entregar vacunas y fármacos de bajo peso molecular ^7. Entrega liposomal de microARN-7-plásmido que expresa supera factor de crecimiento epidérmico receptor de la tirosina quinasa inhibidor de la resistencia en las células de cáncer de pulmón ^8. Cuando el objetivo es laendotelio vascular, la administración intravenosa es esencial, ya que los complejos son poco probable que cruzar la barrera endotelial y extravasación en el intersticio ^9. En comparación a otros órganos, ECs de la microvasculatura del pulmón tener el mayor absorción y ávidamente internalizar liposomas catiónicos y complejos de ADN / ARN, seguido por los ganglios linfáticos y los parches de Peyer ^9. La entrega por vía intravenosa en modelos de roedores de ARNsi a través de inyecciones en la vena retro-orbital o de la cola ha sido probado ser inofensivas incluso en altas concentraciones, tales como 50 mg / kg ^10. En la literatura publicada la composición de los liposomas catiónicos es diferente, basada en la formulación de lípidos y su relación equimolar ^{11, 12.} Hay una amplia gama de aplicaciones potenciales utilizando liposomas catiónicos para la entrega de genes in vivo, ya sea dirigiéndose down-regulation/over-expression de las proteínas, la entrega de vacunas o terapias anti-tumorales ^13-15. Es importante recordares que la eficiencia de ADN / ARN-interacción membrana celular está regulada por el acoplamiento de forma entre los complejos generados y lípidos de membrana. Esto sugiere que la adaptación de la composición de los lípidos de los perfiles de la membrana celular específicos puede ser beneficioso y el resultado en altas tasas de transfección en un tipo de célula particular ^6.

Protocol

1. Los liposomas catiónicos Preparación Autoclave un matraz limpio para ser utilizado para la preparación lipososmes. Preparar soluciones madre: – Disolver 200 mg de bromuro de dimetil dioctadecil amonio (Doab) en 10 ml de cloroformo usando una botella de vidrio pequeño. – Disolver 200 mg de colesterol en 10 ml de cloroformo usando una botella de vidrio pequeño. – Preparar y esterilizar en autoclave para esterilizar el 5% de glucosa en 100 ml de ARN /…

Representative Results

Los niveles de proteína ITSN-1s y el ARNm se controlaron a varios puntos de tiempo después de siRNA entrega ITSN por Western blot y PCR convencional y cuantitativo como en 4. Los niveles de proteína ITSN-1s y ARNm en siRNA ITSN pulmones tratados con ratón fueron aproximadamente 75% más baja por referencia a los controles durante la caída continua de ITSN-1s durante 21 días. Sin ITSN-1s, dynamin-2, una importante interacción socio de jugador ITSN-1s y esencial en el desprendimient…

Discussion

Con base en estudios anteriores publicados por otros ⁹ y nosotros ^{1, 18} hemos desarrollado esta metodología para el largo plazo derribar de ITSN-1 in vivo mediante la administración intravenosa repetida (cada 72 horas, durante 24 días consecutivos) de siRNA / liposoma. Este enfoque experimental es eficaz, se puede utilizar de forma segura y en repetidas ocasiones y que se puede extender fácilmente para estudiar la implicación de un gen que codifica cualquier proteína de interés en e…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number
Dimethyl Dioctadecyl Ammonium Bromide (DOAB)	Sigma-Aldrich	D2779
LiposoFast stabilizer (mini-extruder)	Avestin Inc.	LF-STB
Polycarbonate membrane, 19 mm diameter, 50 nm pore	Avestin Inc.	LFM-50
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C-8667
Chloroform	Mallinckrodt Chemicals	4432-04
Hank’s balanced salts	Sigma-Aldrich	H1387
Round-bottom flask	Fisher Scientific	FHB-275-030X
Mouse siRNAITSN – on target	Dharmacon/ThermoScientific	J-046912-11
Peristaltic pump	Ismatec	REGLO-CDF digital with RHOO pump head
Ventilator	Hugo Sachs Electronik	NA
Barbital	Sigma-Aldrich	B-0500
Uranyl acetate	EM Sciences	22400
Epon812	EM Sciences	Discontinued by the manufacturer
Propylene oxide	EM Sciences	20400
Embedding molds	EM Sciences	69923-05
Tannic acid	EM Sciences	21710
8 nm gold-albumin tracer		Prepared in the laboratory as in16
			Comments
			Equipped with 2 Avestin 1 ml gas-tight syringes (cat. # LF-1)
			Pyrex, 100 ml
			Modified siRNA, in vivo
			Part of IDEX corp.
			D-79232 March, Germany
			Replaced with Embed812, cat. # 14120