Summary
המאמר מתאר את הסתגלות קלה בקלות
Abstract
המאמר מתאר את הסתגלות קלה בקלות במודל חוץ גופית לחקור קיטוב מקרופאג. בנוכחות GM-CSF/M-CSF, תאי גזע / אב hematopoietic ממח העצם מופנים אל התמיינות monocytic, ואחריו גירוי M1 או M2. מצב ההפעלה יכול להיות מועבר על ידי שינויים בפני שטח אנטיגנים תא, ביטוי גנים ומסלולי איתות סלולרי.
Introduction
להבדיל מתגובות דלקתיות הקלסיים, מקרופגים שלחדור רקמות לעתים קרובות להציג את מצב הפעלה של מקוטב שממלא תפקיד מכריע בויסות פונקציות פיסיולוגיות של רקמות מארחות 1-8. על הגירוי, הפעלת מקרופאג ניתן למיין לקלסית (M1) ואלטרנטיבית (M2) הפעלה 2, 4, 9. הפעלת מקרופאג M1 תלויה בקולטנית Toll-כמו (TLRs) והפעלה של פקטור הגרעיני kappa B (NFκB) / ג ביוני N-מסוף קינאז 1 (JNK1), מוביל לייצור של ציטוקינים דלקתיים, כגון TNF-α ו-IL- 1β והפעלה של INOS כי תוצאות בייצור מוגבר של מיני חמצן תגובתי כגון תחמוצת ניטריד (NO) 10, 11. בניגוד לכך, מגויסי M2 macrophage הפעלת PPARγ, PPARδ, או IL-4-Stat6 מסלולים, שהובילו להפעלה אלטרנטיבית, אנטי דלקתית (M2), כי הוא קשור עם גברת ביטוי של הקולטן מנוז CD206, ו1 arginase (ARG1) 6, 12 - 14 </ Sup>.
מקרופאגים שמקורם במח עצם (BMDM) להציג אידיאליים במודל חוץ גופית להבין את מנגנוני שליטה קיטוב של מקרופאגים הופעל 15. באופן ספציפי, הפעלה של מקרופאגים M1 יכולה להיגרם על ידי lipopolysaccharides (LPS) גירוי, בעוד שקיטוב של מקרופאגים M2 יכול להיגרם על ידי IL-4 ו / או IL-13. ניתן לזהות מקרופאגים בוגרים מח עצם נגזרות ומקרופגים מופעלים באמצעות ניתוח תזרים cytometry לביטוי של פני שטח אנטיגנים, כולל CD11b, F4/80, CD11c, CD206, CD69, CD80 ו CD86 9, 16, 17. בנוסף, ניתן למדוד שינויים בייצור ציטוקינים ומסלולי איתות סלולריים הקשורות לקיטוב מקרופאג על ידי כמותי RT-PCR והמערבי סופג, בהתאמה. לסיכום, מקרופאגים מח עצם נגזרות עכבר יכולים לשמש כמודל רלוונטי ללמוד קיטוב מקרופאג במבחנה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. בידוד של תאים במח עצם
- לבודד את עצם ירך ועצמות שוקה 6-8 עכברים ישנים שבוע, לשטוף את השיער ולאחר מכן לחתוך את העצם.
- שימוש במחט 21G ומזרק 10 מ"ל כדי לשטוף את מוח לסרום קר PBS 2% חום מומת שור עוברי (FBS) (3-5 מ"ל / עכבר).
- מח עובר דרך מחט 21G 4-6 פעמים לנתק את התאים.
- תאים עוברים דרך מסננת תא 70 מיקרומטר כדי להסיר גושי תאים, עצמות, שיער ותאים / רקמות אחרות.
- הוסף 3 נפח של פתרון Cl 4 NH (0.8% פתרון 4 Cl NH, StemCell טכנולוגיה), ולדגור על קרח במשך 10 דקות כדי להסיר את תאי דם אדומים.
- ספין למטה תאים ב XG 500 במשך 5 דקות ב 4 ° C.
- Resuspend התא גלולה ב PBS 2% FBS הקר (20-50 מ"ל, תלוי בכמות תאים).
2. גיבוש BMDM אינדוקציה
- Resuspend תאי מח העצם המבודדים במדיום גידול BMDM (2x10 6 תאים / מ 'יב).
מדיום גידול BMDM:
בינוני של של Iscove שינוי Dulbecco (IMDM) + 10% FBS + 15% מסוננים (0.2 מיקרומטר) תא (ATCC, CCL-1) התרבות supernatant (המכיל גורם המגרה מונוציטים מושבה, M-CSF) או 10 ng / ml M L-929 -CSF.
הערה: L-929 supernatant התא מכיל M-CSF 18. כדי להבטיח פעילות האפקטיבית של מדיום אוויר, 5 X 10 5 L-929 תאים הם זורעים בT75 ס"מ 2 צלוחיות עבור 6-7 ימים, בינונית מותנה נאסף ועבר דרך 0.45 מיקרומטר לסנן לפני השימוש. ניתן להשתמש בו באופן מיידי aliquots בינוני או מאוחסן ב-80 מעלות צלזיוס במשך 1-2 חודשים.
- תאי זרע ב6 או 12 צלחות תרבית רקמה כן (תלוי בעיצוב ניסיוני) (קורנינג שחקן משנה).
- שינוי מדיום גידול BMDM טרי ביום 3.
- ביום 7, היווצרות BMDM הבוגרת מוערכת באמצעות ניתוח תזרים cytometryוfluorophore נוגדנים מצומדות כדי לזהות תאי המבטאים CD11b וF4/80.
3. הפעלה מקוטבת BMDM
- ביום 7, לשנות לגירוי בינוני טרי: להפעלת M1, השתמש IMDM המכיל 10% FBS ו100 LPS ng / ml או 100 ng / ml LPS עם 50 ng / ml IFNγ; להפעלת M2, השתמש IMDM המכיל 10% FBS עם 10 ng / ml IL-4 ו / או 10 ng / ml IL-13.
- לאסוף BMDMs מגורה על ידי ניתוקם מהצלחת באמצעות 0.05% טריפסין חם, ואחריו על ידי שטיפה את התאים פעמיים עם PBS המכיל 10% FBS.
הערה: כדי לנתק וresuspend מקרופאגים הבשלים לאחר התמיינות, פתרון טריפסין 0.05% (המכיל 0.48 מ"מ EDTA, Invitrogen) או 2-5 מ"מ EDTA בCa-Mg וללא חיץ PBS או מאוזן של האנק (HBSS) יכולה להיות בשימוש. בעת שימוש במדיום עיכול המכיל טריפסין, טיפול בתאים על 37 מעלות צלזיוס במשך פחות מ -10 דקות כדי למנוע אובדן של סורפני חלבונים בשל יתר מערכת העיכול.
- השתמש בנוגדנים כדי לזהות ביטוי של פני שטח אנטיגנים תא, כולל CD11b, F4/80, CD11c, CD206, CD69, CD80 או CD86 בנקודות זמן שונים תוך שימוש בנהלים מכתים cytometry זרימה רגילות.
- קביעת ביטוי של גנים אופייניים למקרופאגים M1 ו-M2 הופעל כולל IL-1β, TNF-α ו-IL-6 (הפעלת M1) או IL-10, IL-13, וarginase1 PPARγ (הפעלת M2) באמצעות qRT-PCR. לקבוע הפעלה של מסלולי איתות תא המעורבים בהפעלה של מקרופאגים M1 או M2 על ידי ניתוח סופג מערבי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תיאור סכמטי של הליך דור BMDM מוצג (איור 1). טוהר גבוה של מקרופאגים בוגרים ניתן להבחין ביום 7, כאשר הם מייצגים 95-99% מCD11b + F4/80 + תאים (איור 2). ניתן לבחון מקרופאגים מקוטבות באמצעות נוגדנים נגד CD11b, F4/80, CD11c וCD206 ואחרי ניתוח cytometry זרימה. כפי שניתן לראות באיור 3, מקרופאגים M1 מזוהים כמו CD11b + + F4/80 CD11c + CD206-תאים (Q2), ואילו מקרופאגים M2 הם CD11b + + F4/80 CD11c-CD206 + תאים (Q4). מצב הפעלת BMDM יכול להיות מאושר על ידי גודל מוגבר סלולרי (איור 4 א, Shift הימני בFSC-) ושפע מוגבר של פני שטח אנטיגנים CD69, CD80, או CD86 על מקרופאגים (שער: CD11b + F4/80 +) כפי שמוצג באיור 4 ב. ייצור ציטוקינים, ביטוי גנים והפעלת מסלול איתות תא במקרופאגים M1 או M2 ניתן להעריך כמותית באמצעות RT-PCR או מערבי סופג.ים מוצג באיור 5, 1 arginase (ARG1) ורמות PPARγ הוגדלו במקרופאגים M2 על גירוי 10 ng / ml IL-4, ואילו ייצור IL-1β וTNFα הוגדלו במקרופאגים (M1) מגורה עם 100 LPS ng / ml , אשר מלווה p65 הפעלה (איור 6).
איור 1. תכנית לבידוד, והיווצרות גירוי של BMDMs העכבר. צעד אחר צעד נהלים מתוארות בטקסט. בעצמות קצרה, עצם ירך ועצם שוק נאספים 6-8 שבועות עכברים ותאי מח עצם סמוקים החוצה באמצעות PBS בתוספת FBS מומת חום 2%. לאחר תאי דם אדומים lysed עם פתרון NH4Cl, תאים בתרבית במדיום גידול BMDM למשך 7 ימים ואחרי התבגרות וניתוח לטוהר אוכלוסיית התא. לניתוח של מקרופאג פו larization, תאים היו מגורה עם LPS או LPS + IFNγ לM1, או IL-4 ו / או IL-13 לצורך הפעלת M2. ניתן להעריך מקרופאגים מקוטבות על בסיס שינויים במורפולוגיה של תאים, הצגת סמן פני השטח, ייצור ציטוקינים ומסלול איתות תא הופעל.
איור 2. ניתוח cytometry זרימה של היווצרות BMDM. () BMDMs היה מגודר בFSC וSSC הראשון כדי להסיר שאריות וconjugates. (ב ') BMDMs בוגר הוגדרו כCD11b + + F4/80 subpopulations (למעלה מימין) עם טוהר מוצג כאחוז אוכלוסיית הורים מגודרת בFSC / SSC.
s/ftp_upload/50323/50323fig3highres.jpg "/>
איור 3. . ניתוח קיטוב מקרופאג מקרופאגים הסתננות רקמות מוגדר כCD11b + + תאי F4/80; מקרופאגים M1 הם CD11b + + F4/80 CD11c + CD206-תאים, ואילו מקרופאגים M2 הם CD11b + + F4/80 CD11c-CD206 + תאים.
איור 4. ניתוח הפעלת מקרופאג ידי cytometry הזרימה. () עם ההפעלה, בגודל של מקרופאגים להגדיל כפי שמעיד המשמרת של FSC-M1 של מקרופאגים או M2 ב24 שעות לאחר גירוי בהשוואה לM0 (ללא טיפול) מקרופאגים. (ב) ההפעלה משטח סמנים הקשורים לנותחו על ידי cytometry זרימה לאחר IL4 או LPS גירוי. את סמן CD69 שדיווחו מוקדם הוערך ב 5 או 24 שעות שלאחר גירוי; CD80 ו CD86 markeRS נותח ב 48 שעות לאחר גירוי. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 5. הפעלה אלטרנטיבית של מקרופאגים. המקרופאגים מגורה עם 10 ng / ml IL-4 למשך 24 שעות נאספו וRNA הכולל חילוץ. arginase המוגבה 1 (ARG1) וPPARγ הביטוי התגלה במקרופאגים M2 לעומת מקרופאגים שלא טופלו באמצעות ניתוח RT-PCR כמותי.
איור 6. הפעלה הקלסית של מקרופאגים. () סה"כ RNA הופק ממקרופאגים מגורה עם 100 ng / ml Lנ.ב. למשך 24 שעות ומשמשים בניתוחי RT-PCR כמותיים. ביטוי של ציטוקינים מעודדי דלקת כולל IL-TNFα 1β וגדל במקרופאגים M1. (ב) ההפעלה של מסלול NFκB הייתה מושרה על ידי LPS כפי שנקבעה באמצעות נוגדנים לp65 וphosphorylated p65 בניתוחים מערביים סופגים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אנו מדווחים כאן הליך פשוט וישימה בקלות במבחנה כדי לגרום להפעלה של מקרופאגים הנגזרים מתאי אב במח עצם. הליך זה יכול לשמש לחקירה של מנגנונים אחראים לקיטוב של מקרופאגים. טוהר מקרופאגים בוגרים הושג באמצעות ממוצעי פרוטוקול זה 95-99%, ואין הליכי טיהור נוספים נדרשים. כדי לחקור את תפקידם של גנים ספציפיים של אינטרסים בהקשר של קיטוב מקרופאג, ביטוי חוץ רחמי או מציאה הגן ספציפית יכול להתנהל transfection הבאה של התאים ביום 7. פרוטוקול זה גם יספק חלון תרבות בן 7 ימים כדי לחקור את ההשפעות של גורמים מסוימים או גנים המשפיעים על היווצרות, התבגרות והפנוטיפ של מקרופאגים.
מקרופאגים הופעלו להציג פרופילים תאיים ומולקולריים מסובכים עם גמישות רבה בתגובה לגירויים שונים 3, 9, 19. עבורלמשל, LPS מעורר תגובות M1 פרו דלקתיות שניתן לשפר עוד יותר בנוכחות IFNγ או גורם גידול נמק (TNF) ו-IL-4 ו-IL-13 הן לעורר הפעלת M2, עם זאת, את פרופילי ההפעלה אינם חופפים לחלוטין 3, 4, 9, 15, 19, 20. התוצאות שהוצגו בפרוטוקול זה מייצגים רק תוצאות אופייניות של ניסויים עם מקרופאגים שמקורם במח עצם נותחו על ידי cytometry זרימה, כמותי RT-PCR והמערבי סופג. מצגת אנטיגן פני השטח ומסלולי איתות תא קשור עם הפעלה של מקרופאגים משתנים כאמור בספרות הענפה על קיטוב מקרופאג 1-8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי איגוד הלב האמריקאי (7,850,037 BGIA לד"ר Beiyan ג'ואו).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IMDM | Thermo Scientific | SH30259.01 | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10438-026 | |
| Murine GM-CSF | PeproTech | 315-03 | |
| NH4Cl | StemCell Technologies | 7850 | |
| L-929 | ATCC | CCL-1 | |
| 70 μm cell strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| 10 x PBS | Thermo Scientific | AP-9009-10 | |
| Anti-mouse CD11b-APC | eBioscience | 17-0112-81 | |
| Anti-mouse F4/80-FITC | eBioscience | 11-4801-81 | |
| Anti-mouse CD69-PE | eBioscience | 12-0691-81 | |
| Anti-mouse CD86-PE | eBioscience | 12-0862-81 | |
| Propidium Iodine | Invitrogen | P3566 |
References
- Meng, Z. X., Wang, G. X., Lin, J. D. A microrna circuitry links macrophage polarization to metabolic homeostasis. Circulation. , (2012).
- Lumeng, C. N., Bodzin, J. L., Saltiel, A. R. Obesity induces a phenotypic switch in adipose tissue macrophage polarization. J. Clin. Invest. 117, 175-184 (2007).
- Gordon, S., Taylor, P. R. Monocyte and macrophage heterogeneity. Nat. Rev. Immunol. 5, 953-964 (2005).
- Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).
- Tabas, I. Macrophage death and defective inflammation resolution in atherosclerosis. Nat. Rev. Immunol. 10, 36-46 (2010).
- Odegaard, J. I., Ricardo-Gonzalez, R. R., Goforth, M. H., Morel, C. R., Subramanian, V., Mukundan, L., Eagle, A. R., Vats, D., Brombacher, F., Ferrante, A. W., Chawla, A. Macrophage-specific pparg controls alternative activation and improves insulin resistance. Nature. 447, 1116-1120 (2007).
- Odegaard, J. I., Ricardo-Gonzalez, R. R., Red Eagle, A., Vats, D., Morel, C. R., Goforth, M. H., Subramanian, V., Mukundan, L., Ferrante, A. W., Chawla, A. Alternative m2 activation of kupffer cells by ppard ameliorates obesity-induced insulin resistance. Cell Metabolism. 7, 496-507 (2008).
- Vats, D., Mukundan, L., Odegaard, J. I., Zhang, L., Smith, K. L., Morel, C. R., Greaves, D. R., Murray, P. J., Chawla, A. Oxidative metabolism and pgc-1[beta] attenuate macrophage-mediated inflammation. Cell Metabolism. 4, 13-24 (2006).
- Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8, 958-969 (2008).
- Arkan, M. C., Hevener, A. L., Greten, F. R., Maeda, S., Li, Z. -W., Long, J. M., Wynshaw-Boris, A., Poli, G., Olefsky, J., Karin, M. Ikk-b links inflammation to obesity-induced insulin resistance. Nat. Med. 11, 191-198 (2005).
- Saberi, M., Woods, N. -B., de Luca, C., Schenk, S., Lu, J. C., Bandyopadhyay, G., Verma, I. M., Olefsky, J. M. Hematopoietic cell-specific deletion of toll-like receptor 4 ameliorates hepatic and adipose tissue insulin resistance in high-fat-fed mice. Cell Metab. 10, 419-429 (2009).
- Kang, K., Reilly, S. M., Karabacak, V., Gangl, M. R., Fitzgerald, K., Hatano, B., Lee, C. -H. Adipocyte-derived th2 cytokines and myeloid ppard regulate macrophage polarization and insulin sensitivity. Cell Metabolism. 7, 485-495 (2008).
- Bouhlel, M. A., Derudas, B., Rigamonti, E., Dievart, R., Brozek, J., Haulon, S., Zawadzki, C., Jude, B., Torpier, G., Marx, N., Staels, B., Chinetti-Gbaguidi, G. Pparg activation primes human monocytes into alternative m2 macrophages with anti-inflammatory properties. Cell Metabolism. 6, 137-143 (2007).
- Bronte, V., Zanovello, P. Regulation of immune responses by l-arginine metabolism. Nat. Rev. Immunol. 5, 641-654 (2005).
- Zhuang, G., Meng, C., Guo, X., Cheruku, P. S., Shi, L., Xu, H., Li, H., Wang, G., Evans, A. R., Safe, S., Wu, C., Zhou, B. A novel regulator of macrophage activation: Mir-223 in obesity-associated adipose tissue inflammation. Circulation. 125, 2892-2903 (2012).
- Kradin, R. L., McCarthy, K. M., Preffer, F. I., Schneeberger, E. E. Flow-cytometric and ultrastructural analysis of alveolar macrophage maturation. J. Leukoc. Biol. 40, 407-417 (1986).
- Stein, M., Keshav, S., Harris, N., Gordon, S. Interleukin 4 potently enhances murine macrophage mannose receptor activity: A marker of alternative immunologic macrophage activation. J. Exp. Med. 176, 287-292 (1992).
- Strassmann, G., Bertolini, D. R., Kerby, S. B., Fong, M. Regulation of murine mononuclear phagocyte inflammatory products by macrophage colony-stimulating factor. Lack of il-1 and prostaglandin e2 production and generation of a specific il-1 inhibitor. J. Immunol. 147, 1279-1285 (1991).
- Biswas, S. K., Mantovani, A. Macrophage plasticity and interaction with lymphocyte subsets: Cancer as a paradigm. Nat. Immunol. 11, 889-896 (2010).
- Sica, A., Mantovani, A. Macrophage plasticity and polarization: In vivo veritas. J. Clin. Invest. 122, 787-795 (2012).
