Summary
Artikeln beskriver en lätt enkel adaptiv
Abstract
Artikeln beskriver en lätt enkel adaptiv in vitro modell för att undersöka makrofager polarisering. I närvaro av GM-CSF/M-CSF är hematopoietiska stam / progenitorceller från benmärgen riktad in monocytisk differentiering, följt av M1 eller M2 stimulering. Aktiveringen status kan spåras genom förändringar i cellyteantigener, genuttryck och cell vägar signalering.
Introduction
Distinkt från klassiska inflammatoriska svar, makrofager som infiltrerar vävnad visar ofta polariserad aktivering status som spelar en avgörande roll i regleringen värdvävnad fysiologiska funktioner 1-8. Vid stimulering, kan makrofagaktivering sorteras i classic (M1) och alternativ (M2) aktivering 2, 4, 9. M1 makrofagaktivering beror på Toll-like receptors (TLR) och aktivering av nukleär faktor kappa B (NFkB) / c-Jun N-terminal kinas 1 (JNK1), vilket leder till produktion av inflammatoriska cytokiner, såsom TNF-α och IL- 1β och aktivering av iNOS som resulterar i ökad produktion av reaktiva syrespecies såsom nitrid oxid (NO) 10, 11. Däremot M2 makrofagaktivering rekryterar PPARy, PPARö, eller IL-4-STAT6 vägar, som leder till en alternativ, antiinflammatoriska (M2) aktivering som är associerad med uppreglering av mannosreceptor CD206, och arginas 1 (Arg1) 6, 12 - 14 </ Sup>.
Benmärg härledda makrofager (BMDM) presenterar ett ideal in vitro-modell för att förstå de mekanismer som styr polariseringen av aktiverade makrofager 15. Specifikt kan aktivering av M1 makrofager induceras av lipopolysackarider (LPS) stimulering, medan polarisering av M2 makrofager kan induceras genom IL-4 och / eller IL-13. Äldre benmärg makrofager och aktiverade makrofager kan identifieras genom flödescytometri analys för uttryck av ytantigener, inklusive CD11b, F4/80, CD11c, CD206, CD69, CD80 och CD86 9, 16, 17. Dessutom kan förändringar i cytokinproduktion och cell vägar signalering associerade med makrofag polarisering mätas genom kvantitativ RT-PCR och Western blotting, respektive. Sammanfattningsvis kan musbenmärg härledda makrofager tjäna som en relevant modell för att studera makrofager polarisering in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ett. Isolering av benmärgsceller
- Isolera lårbenet och skenbenet ben alltifrån 6-8 veckor gamla möss, skölj håret och sedan skära upp benet.
- Använd en 21G nål och 10 ml spruta för att spola ut märg in i kall PBS 2% värmeinaktiverat fetalt bovint serum (FBS) (3-5 ml / mus).
- Passera märg genom en 21G nål 4-6 gånger för att skilja cellerna.
- Passera celler genom en 70 ìm cell sil för att avlägsna celler klumpar, ben, hår och andra celler / vävnader.
- Lägg 3 volym av NH4Cl-lösning (0,8% NH4Cl-lösning, Stemcell Technology), och inkubera på is under 10 min för att avlägsna röda blodkroppar.
- Centrifugera ner cellerna vid 500 xg under 5 min vid 4 ° C.
- Resuspendera cellpelleten i kall PBS 2% FBS (20-50 ml, beroende på mängden av celler).
2. Induktion BMDM Formation
- Resuspendera isolerade benmärgsceller i BMDM odlingsmedium (2x10 6 celler / ml).
BMDM tillväxt medium:
Iscoves modifierade Dulbeccos medium (IMDM) + 10% FBS + 15% filtrerades (0,2 | im) L-929-cell (ATCC, CCL-1) odlingssupernatanten (innehållande monocyt-kolonistimulerande faktor, M-CSF) eller 10 ng / ml M -CSF.
Anmärkning: L-929 cellsupernatant innehåller M-CSF 18. För att säkerställa effektiv aktivitet av konditionerat medium, 5 X 10 5 L-929 celler sås i T75 cm 2 flaskor för 6-7 dagar, konditionerat medium uppsamlades och leddes genom ett 0,45 um filter före användning. Medium alikvoter kan användas omedelbart eller förvaras i -80 ° C under 1 till 2 månader.
- Seed celler i 6 eller 12 brunnars vävnadsodlingsplattor (beroende på experimentell design) (Corning Costar).
- Ändra färskt medium BMDM tillväxt på dag 3.
- På dag 7, är bildningen av mogna BMDM utvärderades med användning av flödescytometrianalysoch fluoroforen konjugerade antikroppar för att detektera celler som uttrycker CD11b och F4/80.
Tre. BMDM Polarized Aktivering
- På dag 7, byta till färskt stimuleringsmedium: för M1 aktivering, använd IMDM innehållande 10% FBS och 100 ng / ml LPS eller 100 ng / ml LPS med 50 ng / ml IFNy, för M2 aktivering, använd IMDM innehållande 10% FBS med 10 ng / ml IL-4 och / eller 10 ng / ml IL-13.
- Samla stimulerade BMDMs genom att ta loss dem från skålen med varmt 0,05% trypsin, följt av tvättning av cellerna två gånger med PBS innehållande 10% FBS.
Obs: Om du vill ta bort och slamma mogna makrofager efter differentiering, 0,05% trypsinlösning (innehållande 0,48 mM EDTA, Invitrogen) eller 2-5 mM EDTA i Ca-och Mg-fri PBS eller Hanks balanserade buffert (HBSS) kan användas. Vid användning av mag-medium innehållande trypsin behandlas celler vid 37 ° C under mindre än 10 minuter för att undvika förlust av suransikte proteiner på grund av över-matsmältningen.
- Använd antikroppar för att detektera uttryck av antigener på cellytan, inklusive CD11b, F4/80, CD11c, CD206, CD69, CD80 eller CD86 vid olika tidpunkter med vanliga flöde förfaranden cytometry färgning.
- Bestäm uttryck av gener karakteristiska för aktiverade M1 och M2 makrofager inklusive IL-1β, TNF-α och IL-6 (M1 aktivering) eller IL-10, IL-13, arginase1 och PPARy (M2 aktivering) med användning av QRT-PCR. Bestäm aktivering av signalvägar involverade i aktivering av M1 eller M2 makrofager med Western blotting analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En schematisk beskrivning av det BMDM generationen förfarandet lämnas (Figur 1). Hög renhet mogna makrofager kan observeras på dag 7 när de står för 95 till 99% av CD11b + F4/80 + celler (Figur 2). Polariserade makrofager kan undersökas med hjälp av antikroppar mot CD11b, F4/80, följt CD11c och CD206 med flödescytometri analys. Såsom visas i figur 3, är M1 makrofager detekteras som CD11b + F4/80 + CD11c + CD206-celler (Q2), medan M2 makrofager är CD11b + F4/80 + CD11c-CD206 + celler (Q4). Den BMDM aktivering status kan bekräftas genom ökad cellulär storlek (Figur 4A, höger skift i FSC-A) och ökad förekomst av ytantigener CD69, CD80, eller CD86 på makrofager (Gate: CD11b + F4/80 +) som visas i figur 4B. Cytokinproduktion, genuttryck och cell signalväg aktiveringen i M1 eller M2 makrofager kan utvärderas med hjälp av kvantitativ RT-PCR eller Western blotting. ETTs som visas i figur 5, var arginas 1 (Arg1) och nivåer PPARy ökat i M2 makrofager vid 10 ng / ml IL-4 stimulering, medan IL-1β och TNFa-produktion ökade hos makrofager (M1) stimulerade med 100 ng / ml LPS , vilket åtföljs av p65 aktivering (Figur 6).
Figur 1. Schema för isoleringen, bildning och stimulering av mus BMDMs. Steg för steg-anvisningar finns beskrivna i texten. I korthet, lårben och skenben ben samlas in från 6-8 veckor möss och benmärgsceller spolas ut med användning av PBS kompletterat med 2% värmeinaktiverat FBS. Efter röda blodkroppar lyseras med NH4Cl-lösning, odlas celler i BMDM grogrund för 7 dagar, följt av mognad och analys för renhet av cellen befolkningen. För analys av makrofag po sation, celler stimulerades med LPS eller LPS + IFNy för M1, eller IL-4 och / eller IL-13 för M2 aktivering. Polariserade makrofager kan utvärderas på basis av förändringar i cellernas morfologi, ytmarkör presentation, cytokin produktion och cell signalväg aktiveras.
Figur 2. Flödescytometrianalys av BMDM formation. (A) BMDMs var första styrda på FSC och SSC för att avlägsna skräp och konjugat. (B) Äldre BMDMs definierades som CD11b + F4/80 + subpopulationer (uppe till höger) med renhet visas som procentandel av föräldrapopulationen gated på FSC / SSC.
s/ftp_upload/50323/50323fig3highres.jpg "/>
Figur 3. . Makrofag polarisering analys Tissue infiltrerade makrofager definieras som CD11b + F4/80 + celler, M1 makrofager är CD11b + F4/80 + CD11c + CD206-celler, medan M2 makrofager är CD11b + F4/80 + CD11c-CD206 + celler.
Figur 4. Makrofagaktivering analys med flödescytometri. (A) Vid aktivering, storleken på makrofager ökar, vilket framgår av den förskjutning av FSC-A i M1 eller M2 makrofager vid 24 timmar efter stimulering jämfört med M0 (obehandlad) makrofager. (B) Aktiveringen -relaterade ytmarkörer analyserades genom flödescytometri efter IL4 eller LPS-stimulering. De tidiga svarande markör CD69 utvärderades vid 5 eller 24 timmar efter stimulering, CD80 och CD86 marknadsförs analyserades vid 48 timmar efter stimulering. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 5. Alternativ aktivering av makrofager. Makrofager stimulerade med 10 ng / ml IL-4 under 24 h uppsamlades och totalt RNA extraherades. Förhöjda arginas 1 (Arg1) och PPARy uttryck detekterades i M2 makrofager jämfört med obehandlade makrofager med användning kvantitativ RT-PCR-analys.
Figur 6. Classical aktivering av makrofager. (A) Totalt RNA extraherades från makrofager stimulerade med 100 ng / ml LPS under 24 timmar och används i kvantitativa RT-PCR-analyser. Expression av proinflammatoriska cytokiner, inklusive IL-1β och TNF ökade M1 makrofager. (B) Aktivering av NFkB banan framkallades genom LPS bestämd med antikroppar mot p65 och fosforyleras p65 i western blotting analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi rapporterar här en enkel och lätt anpassningsbar in vitro förfarande för att inducera aktivering av makrofager härledda från benmärgsstamceller. Detta förfarande kan användas för undersökning av mekanismer som ansvarar för polarisering av makrofager. Renheten av mogna makrofager som erhållits med hjälp av detta protokoll genomsnitt 95-99%, och inga ytterligare reningssteg förfaranden krävs. För att undersöka funktionen av specifika gener av intresse i samband med makrofag polarisering, ektopisk uttryck eller genspecifik knockdown kan genomföras efter transfektion av celler på dag 7. Detta protokoll kommer också att ge en 7-dagars odling fönstret för att undersöka effekterna av vissa faktorer eller gener som påverkar bildningen, mognad och fenotypen av makrofager.
Aktiverade makrofager visar komplicerade cellulära och molekylära profiler med stor plasticitet som svar på olika stimuli 3, 9, 19. FörExempelvis framkallar LPS potenta proinflammatoriska M1 reaktioner som kan förbättras ytterligare i närvaro av IFNy eller tumör-necrosis factor (TNF) och IL-4 och IL-13 både stimulera M2 aktivering, men gör aktiveringen profilerna inte helt överlappar 3, 4, 9, 15, 19, 20. De resultat som presenteras i detta protokoll endast utgör typiska resultat av experiment med ben härledda benmärg makrofager analyseras med flödescytometri, kvantitativ RT-PCR och Western blotting. Ytantigen presentation och cell vägar signalering associerad med aktivering av makrofager varierar vilket noterades i den omfattande litteraturen om makrofag polarisering 1-8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av American Heart Association (BGIA 7.850.037 till Dr Beiyan Zhou).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IMDM | Thermo Scientific | SH30259.01 | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10438-026 | |
| Murine GM-CSF | PeproTech | 315-03 | |
| NH4Cl | StemCell Technologies | 7850 | |
| L-929 | ATCC | CCL-1 | |
| 70 μm cell strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| 10 x PBS | Thermo Scientific | AP-9009-10 | |
| Anti-mouse CD11b-APC | eBioscience | 17-0112-81 | |
| Anti-mouse F4/80-FITC | eBioscience | 11-4801-81 | |
| Anti-mouse CD69-PE | eBioscience | 12-0691-81 | |
| Anti-mouse CD86-PE | eBioscience | 12-0862-81 | |
| Propidium Iodine | Invitrogen | P3566 |
References
- Meng, Z. X., Wang, G. X., Lin, J. D. A microrna circuitry links macrophage polarization to metabolic homeostasis. Circulation. , (2012).
- Lumeng, C. N., Bodzin, J. L., Saltiel, A. R. Obesity induces a phenotypic switch in adipose tissue macrophage polarization. J. Clin. Invest. 117, 175-184 (2007).
- Gordon, S., Taylor, P. R. Monocyte and macrophage heterogeneity. Nat. Rev. Immunol. 5, 953-964 (2005).
- Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).
- Tabas, I. Macrophage death and defective inflammation resolution in atherosclerosis. Nat. Rev. Immunol. 10, 36-46 (2010).
- Odegaard, J. I., Ricardo-Gonzalez, R. R., Goforth, M. H., Morel, C. R., Subramanian, V., Mukundan, L., Eagle, A. R., Vats, D., Brombacher, F., Ferrante, A. W., Chawla, A. Macrophage-specific pparg controls alternative activation and improves insulin resistance. Nature. 447, 1116-1120 (2007).
- Odegaard, J. I., Ricardo-Gonzalez, R. R., Red Eagle, A., Vats, D., Morel, C. R., Goforth, M. H., Subramanian, V., Mukundan, L., Ferrante, A. W., Chawla, A. Alternative m2 activation of kupffer cells by ppard ameliorates obesity-induced insulin resistance. Cell Metabolism. 7, 496-507 (2008).
- Vats, D., Mukundan, L., Odegaard, J. I., Zhang, L., Smith, K. L., Morel, C. R., Greaves, D. R., Murray, P. J., Chawla, A. Oxidative metabolism and pgc-1[beta] attenuate macrophage-mediated inflammation. Cell Metabolism. 4, 13-24 (2006).
- Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8, 958-969 (2008).
- Arkan, M. C., Hevener, A. L., Greten, F. R., Maeda, S., Li, Z. -W., Long, J. M., Wynshaw-Boris, A., Poli, G., Olefsky, J., Karin, M. Ikk-b links inflammation to obesity-induced insulin resistance. Nat. Med. 11, 191-198 (2005).
- Saberi, M., Woods, N. -B., de Luca, C., Schenk, S., Lu, J. C., Bandyopadhyay, G., Verma, I. M., Olefsky, J. M. Hematopoietic cell-specific deletion of toll-like receptor 4 ameliorates hepatic and adipose tissue insulin resistance in high-fat-fed mice. Cell Metab. 10, 419-429 (2009).
- Kang, K., Reilly, S. M., Karabacak, V., Gangl, M. R., Fitzgerald, K., Hatano, B., Lee, C. -H. Adipocyte-derived th2 cytokines and myeloid ppard regulate macrophage polarization and insulin sensitivity. Cell Metabolism. 7, 485-495 (2008).
- Bouhlel, M. A., Derudas, B., Rigamonti, E., Dievart, R., Brozek, J., Haulon, S., Zawadzki, C., Jude, B., Torpier, G., Marx, N., Staels, B., Chinetti-Gbaguidi, G. Pparg activation primes human monocytes into alternative m2 macrophages with anti-inflammatory properties. Cell Metabolism. 6, 137-143 (2007).
- Bronte, V., Zanovello, P. Regulation of immune responses by l-arginine metabolism. Nat. Rev. Immunol. 5, 641-654 (2005).
- Zhuang, G., Meng, C., Guo, X., Cheruku, P. S., Shi, L., Xu, H., Li, H., Wang, G., Evans, A. R., Safe, S., Wu, C., Zhou, B. A novel regulator of macrophage activation: Mir-223 in obesity-associated adipose tissue inflammation. Circulation. 125, 2892-2903 (2012).
- Kradin, R. L., McCarthy, K. M., Preffer, F. I., Schneeberger, E. E. Flow-cytometric and ultrastructural analysis of alveolar macrophage maturation. J. Leukoc. Biol. 40, 407-417 (1986).
- Stein, M., Keshav, S., Harris, N., Gordon, S. Interleukin 4 potently enhances murine macrophage mannose receptor activity: A marker of alternative immunologic macrophage activation. J. Exp. Med. 176, 287-292 (1992).
- Strassmann, G., Bertolini, D. R., Kerby, S. B., Fong, M. Regulation of murine mononuclear phagocyte inflammatory products by macrophage colony-stimulating factor. Lack of il-1 and prostaglandin e2 production and generation of a specific il-1 inhibitor. J. Immunol. 147, 1279-1285 (1991).
- Biswas, S. K., Mantovani, A. Macrophage plasticity and interaction with lymphocyte subsets: Cancer as a paradigm. Nat. Immunol. 11, 889-896 (2010).
- Sica, A., Mantovani, A. Macrophage plasticity and polarization: In vivo veritas. J. Clin. Invest. 122, 787-795 (2012).
