Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

التحقيق في الاستقطاب البلاعم عن طريق نخاع العظم الضامة المشتقة

doi: 10.3791/50323 Published: June 23, 2013

Summary

توضح هذه المقالة على التكيف السهل بسهولة

Abstract

توضح هذه المقالة على التكيف بسهولة سهلة في نموذج المختبر للتحقيق الاستقطاب البلاعم. في حضور GM-CSF/M-CSF، يتم توجيه الخلايا الجذعية المكونة للدم / السلف من نخاع العظام إلى التمايز الوحيدات، تليها التحفيز M1 أو M2. يمكن تتبع حالة التنشيط من خلال التغييرات في مستضدات سطح الخلية، التعبير الجيني ومسارات إشارات الخلية.

Introduction

متميزة من الاستجابات الالتهابية الكلاسيكية، الضامة التي تتسلل الأنسجة كثيرا ما عرض حالة التنشيط الاستقطاب التي تلعب دورا حاسما في تنظيم الوظائف الفسيولوجية الأنسجة المضيفة 1-8. على التحفيز، يمكن فرز تنشيط البلاعم إلى الكلاسيكية (M1) والبديلة (M2) التنشيط 2، 4، 9. M1 تنشيط البلاعم يعتمد على تول مثل مستقبلات (TLRs) وتفعيل العامل النووي كابا B (NFκB) / ج يونيو N-محطة كيناز 1 (JNK1)، مما يؤدي إلى إنتاج السيتوكينات الالتهابية، مثل TNF-α و IL- 1β وتفعيل iNOS أن يؤدي إلى زيادة إنتاج أنواع الاكسجين التفاعلية مثل أكسيد نيتريد (NO) 10، 11. في المقابل، M2 بلعم المجندين تفعيل PPARγ، PPARδ، أو IL-4-STAT6 مسارات، مما يؤدي إلى بديل، المضادة للالتهابات (M2) التنشيط مقترن upregulation من مستقبلات المانوز CD206، وأرجيناز 1 (ARG1) 6، 12 - 14 </ سوب>.

نخاع العظام المستمدة الضامة (BMDM) تقديم نموذج مثالي في المختبر لفهم آليات السيطرة على الاستقطاب من الضامة المنشط 15. على وجه التحديد، وتفعيل الضامة M1 يمكن أن يتسبب بواسطة lipopolysaccharides (LPS) التحفيز، في حين الاستقطاب الضامة M2 يمكن أن يتسبب بواسطة IL-4 و / أو IL-13. ويمكن تحديد الناضجة نخاع العظام المستمدة الضامة والضامة تفعيلها من خلال تحليل التدفق الخلوي للتعبير عن المستضدات السطحية، بما في ذلك CD11b، F4/80، CD11c و، CD206، CD69، CD80 CD86 و 9 و 16 و 17. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن قياس التغيرات في إنتاج السيتوكينات ومسارات إشارات الخلية المرتبطة الاستقطاب البلاعم التي كتبها الكمي RT-PCR والغربية النشاف، على التوالي. وباختصار، يمكن الماوس نخاع العظام المستمدة الضامة نموذجا ذات الصلة لدراسة الاستقطاب البلاعم في المختبر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. عزل خلايا نخاع العظام

  1. عزل عظم الفخذ وعظام الساق 6-8 الفئران منذ أسبوع، وشطف الشعر ثم قطع مفتوحة العظام.
  2. استخدام إبرة 21G و 10 مل حقنة لطرد نخاع في برنامج تلفزيوني الباردة +2٪ الحرارة المعطل مصل بقري جنيني (FBS) (3-5 مل / الماوس).
  3. تمرير نخاع من خلال إبرة 21G 4-6 مرات لفصل الخلايا.
  4. تمر الخلايا من خلال 70 ميكرومتر مصفاة الخلية لإزالة كتل الخلايا والعظام والشعر والخلايا / الأنسجة الأخرى.
  5. إضافة 3 حجم NH 4 حل الكلورين (0.8٪ NH 4 الكلورين حل، Stemcell التكنولوجيا)، واحتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة لإزالة خلايا الدم الحمراء.
  6. تدور باستمرار خلايا في 500 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
  7. Resuspend وبيليه الخلية في برنامج تلفزيوني الباردة +2٪ FBS (20-50 مل، اعتمادا على كمية من الخلايا).

2. الاستقراء تشكيل BMDM

  1. Resuspend معزولة خلايا نخاع العظام في BMDM متوسطة النمو (الخلايا 2x10 6 / مل).

BMDM النمو المتوسطة:

متوسط ​​Iscove في التعديل Dulbecco ل(IMDM) + 10٪ FBS + 15٪ تصفيتها (0.2 ميكرومتر) L-929 خلية (ATCC، CCL-1) ثقافة طاف (التي تحتوي على عامل تحفيز الوحيدات مستعمرة، M-CSF) أو 10 نانوغرام / مل M -CSF.

ملاحظة: L-929 طاف الخلية تحتوي M-CSF 18. لضمان النشاط الفعال المتوسطة مكيفة، 5 × 5 10 L-929 هي المصنفة الخلايا في T75 سم 2 قوارير لأيام 6-7، يتم جمع المتوسطة الهواء وتمريرها من خلال مرشح 0.45 ميكرون قبل الاستخدام. مأخوذة المتوسطة يمكن استخدامها على الفور أو تخزينها في -80 درجة مئوية لمدة 1-2 أشهر.

  1. خلايا البذور في 6 أو 12 جيدا لوحات زراعة الأنسجة (اعتمادا على التصميم التجريبي) (كورنينج COSTAR).
  2. تغيير الطازجة المتوسطة النمو BMDM في اليوم 3.
  3. في يوم 7، يتم تقييم تشكيل BMDM ناضجة باستخدام تحليل التدفق الخلويوfluorophore الأجسام المضادة مترافق للكشف عن الخلايا معربا عن CD11b وF4/80.

3. BMDM تنشيط الاستقطاب

  1. في يوم 7، تغيير إلى متوسطة التحفيز الطازجة: لتفعيل M1، استخدم IMDM التي تحتوي على FBS 10٪ و 100 نانوغرام / مل LPS أو 100 نانوغرام / مل LPS مع 50 نانوغرام / مل IFNγ؛ لتفعيل M2، استخدم IMDM تحتوي على 10٪ FBS مع 10 نانوغرام / مل IL-4 و / أو 10 نانوغرام / مل IL-13.
  2. جمع BMDMs يحفزه فصل لهم من الطبق باستخدام دافئة 0.05٪ التربسين، تليها غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني يحتوي على FBS 10٪.

ملاحظة: لفصل و resuspend الضامة ناضجة بعد التمايز، 0.05٪ حل التربسين (التي تحتوي على 0.48 ملي EDTA، إينفيتروجن) أو 2-5 ملي EDTA في الكالسيوم والمغنيسيوم وخالية من برنامج تلفزيوني أو عازلة متوازن هانك (HBSS) يمكن استخدامها. عند استخدام الجهاز الهضمي المتوسطة التي تحتوي على التربسين، يتم التعامل مع الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة أقل من 10 دقيقة لتجنب فقدان سوروجه البروتينات بسبب الإفراط في الهضم.

  1. استخدام الأجسام المضادة للكشف عن التعبير عن مستضدات سطح الخلية، بما في ذلك CD11b، F4/80، CD11c و، CD206، CD69، CD80 CD86 أو عند نقاط زمنية مختلفة باستخدام الإجراءات تلطيخ التدفق الخلوي القياسية.
  2. تحديد التعبير عن الجينات المميزة من الضامة M1 و M2 المنشط بما في ذلك IL-1β، TNF-α و IL-6 (تفعيل M1) أو IL-10، IL-13، arginase1 وPPARγ (تفعيل M2) باستخدام QRT-PCR. تحديد تفعيل مسارات إشارات الخلية المشاركة في تفعيل الضامة M1 أو M2 من خلال تحليل النشاف الغربية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويرد وصف تخطيطي لإجراء الجيل BMDM (الشكل 1). ويمكن ملاحظة نقاء عالية من الضامة ناضجة في يوم 7 عندما تمثل 95-99٪ من CD11b + F4/80 + الخلايا (الشكل 2). يمكن فحص الضامة الاستقطاب باستخدام الأجسام المضادة ضد CD11b، F4/80، وCD11c وCD206 تليها تحليل التدفق الخلوي. كما هو مبين في الشكل 3، ويتم الكشف عن الضامة M1 كما CD11b + + CD11c و+ F4/80 CD206 خلايا (Q2)، في حين الضامة M2 هي CD11b + + CD11c و-F4/80 CD206 + الخلايا (Q4). ويمكن التأكد من حالة التنشيط BMDM عن طريق زيادة حجم الخلوية (الشكل 4A، وتحول الحق في FSC-A) وزيادة وفرة من المستضدات السطحية CD69، CD80، CD86 أو على الضامة (بوابة: CD11b + F4/80 +) كما هو مبين في الشكل 4B. إنتاج السيتوكينات، التعبير الجيني والخلايا مما يشير تفعيل المسار في الضامة M1 أو M2 يمكن تقييمها باستخدام كمية RT-PCR أو الغربية النشاف. Aق هو مبين في الشكل (5)، وأرجيناز 1 (ARG1) ومستويات PPARγ زيادة في الضامة M2 على 10 نانوغرام / مل IL-4 التحفيز، في حين تمت زيادة إنتاج IL-1β وTNFα في الضامة (M1) حفز مع 100 نانوغرام / مل LPS ، الذي يكون مصحوبا P65 التنشيط (الشكل 6).

الشكل 1
الشكل 1. وصفت مخطط لعزل، وتشكيل وتحفيز BMDMs الماوس. خطوة خطوة الإجراءات في النص. وباختصار، عظم الفخذ والساق العظام يتم جمعها من 6-8 أسابيع الفئران وخلايا نخاع العظام يخرجوا باستخدام PBS تستكمل مع FBS 2٪ الحرارة المعطل. بعد هي lysed خلايا الدم الحمراء مع حل NH4Cl، يتم استزراع الخلايا في BMDM متوسط ​​النمو لمدة 7 أيام تليها النضج وتحليل لنقاء السكان الخلية. لتحليل بلعم ص. وحفز larization، والخلايا مع LPS أو LPS + IFNγ لM1، أو IL-4 و / أو IL-13 من أجل التنشيط M2. يمكن تقييم الضامة الاستقطاب على أساس التغييرات في مورفولوجية الخلية، عرض علامة السطح، وإنتاج السيتوكينات الخلية يشير مسار تفعيلها.

الشكل 2
الشكل 2. تحليل التدفق الخلوي من تشكيل BMDM. (A) كانت أول BMDMs بوابات على FSC وSSC لإزالة الحطام وتقارن. (B) وقد تم تحديد BMDMs الناضجة كما CD11b + F4/80 + المجموعات السكانية الفرعية (أعلى اليمين) مع نقاء عرض كنسبة مئوية من السكان الأصل بوابات على FSC / SSC.

s/ftp_upload/50323/50323fig3highres.jpg "/>
الشكل (3). يتم تعريف تحليل الأنسجة الضامة الاستقطاب بلعم تسلل كما CD11b + F4/80 + الخلايا؛ الضامة M1 هي CD11b + + CD11c و+ F4/80 CD206 الخلايا، في حين الضامة M2 هي CD11b + + CD11c و-F4/80 CD206 + الخلايا.

الشكل 4
الشكل 4. التحليل بالتنشيط بلعم بواسطة التدفق الخلوي. (A) عند التنشيط، وحجم الضامة زيادة كما يتضح من التحول من FSC-A من M1 أو M2 الضامة في 24 ساعة بعد التحفيز مقارنة M0 (غير المعالجة) الضامة. (B) والتنشيط وقد تم تحليل علامات سطح ذات الصلة من قبل التدفق الخلوي بعد IL4 أو LPS التحفيز. تم تقييم أوائل CD69 علامة الاستجابة في 5 أو 24 ساعة بعد التحفيز؛ CD80 CD86 و CROSS وسائلوقد تم تحليل RS في 48 ساعة بعد التحفيز. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

الرقم 5
الشكل 5. تم جمع تفعيل البديل الضامة. الضامة حفز مع 10 نانوغرام / مل IL-4 لمدة 24 ساعة والحمض النووي الريبي مجموع المستخرج. تم الكشف عن أرجيناز مرتفعة 1 (ARG1) وPPARγ التعبير في الضامة M2 بالمقارنة مع الضامة غير المعالجة باستخدام التحليل الكمي RT-PCR.

الشكل (6)
الشكل (6). تفعيل الكلاسيكية الضامة. (A) تم استخراج الحمض النووي الريبي مجموع من الضامة حفز مع 100 نانوغرام / مل LPS لمدة 24 ساعة وتستخدم في تحليل كمي RT-PCR. زيادة التعبير عن السيتوكينات proinflammatory بما في ذلك IL-1β وTNFα في الضامة M1. (B) وكان المستحث تفعيل المسار NFκB بواسطة LPS كما هو محدد باستخدام الأجسام المضادة لP65 و P65 فسفرته في التحليلات النشاف الغربية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

نفيدكم هنا إجراء بسيط وقابلة للتكيف بسهولة في المختبر للحث على تفعيل الضامة المستمدة من الخلايا الاصلية نخاع العظام. هذا الإجراء يمكن أن تستخدم للتحقيق في الآليات المسؤولة عن استقطاب الضامة. نقاء الضامة ناضجة تم الحصول عليها باستخدام هذا البروتوكول المتوسطات 95-99٪، وليس هناك حاجة لإجراءات تنقية إضافية. للتحقيق في وظيفة الجينات المحددة للمصالح في سياق الاستقطاب بلعم، والتعبير خارج الرحم أو الجينات ضربة قاضية محددة يمكن إجراء ترنسفكأيشن التالية من الخلايا في يوم 7. سوف يشكل هذا البروتوكول أيضا توفير نافذة الثقافة لمدة 7 أيام للتحقيق في آثار عوامل معينة أو الجينات التي تؤثر على تكوين، ونضوج النمط الظاهري الضامة.

الضامة تنشيط عرض ملامح الخلوية والجزيئية المعقدة مع اللدونة كبيرة في الاستجابة للمؤثرات المختلفة 3، 9، 19. إلىسبيل المثال، LPS يثير ردود M1 الموالية للالتهابات القوية التي يمكن تعزيزه في وجود IFNγ أو عامل نخر الورم (TNF) وIL-4 و IL-13 على حد سواء تحفيز تفعيل M2، إلا أن ملامح التنشيط لا تتداخل تماما 3، 4، 9، 15، 19، 20. النتائج المعروضة في هذا البروتوكول لا تمثل سوى نتائج نموذجية من التجارب مع نخاع العظام المستمدة الضامة تحليلها من قبل التدفق الخلوي، الكمي RT-PCR والغربية النشاف. عرض المستضد السطحي ومسارات إشارات الخلية المرتبطة تفعيل الضامة تختلف كما لوحظ في دراسات واسعة النطاق على الاستقطاب بلعم 1-8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل جمعية القلب الأمريكية (BGIA 7850037 للدكتور Beiyan تشو).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IMDM Thermo Scientific SH30259.01
Fetal bovine serum Invitrogen 10438-026
Murine GM-CSF PeproTech 315-03
NH4Cl StemCell Technologies 7850
L-929 ATCC CCL-1
70 μm cell strainer BD Biosciences 352350
10 x PBS Thermo Scientific AP-9009-10
Anti-mouse CD11b-APC eBioscience 17-0112-81
Anti-mouse F4/80-FITC eBioscience 11-4801-81
Anti-mouse CD69-PE eBioscience 12-0691-81
Anti-mouse CD86-PE eBioscience 12-0862-81
Propidium Iodine Invitrogen P3566

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Meng, Z. X., Wang, G. X., Lin, J. D. A microrna circuitry links macrophage polarization to metabolic homeostasis. Circulation. (2012).
  2. Lumeng, C. N., Bodzin, J. L., Saltiel, A. R. Obesity induces a phenotypic switch in adipose tissue macrophage polarization. J. Clin. Invest. 117, 175-184 (2007).
  3. Gordon, S., Taylor, P. R. Monocyte and macrophage heterogeneity. Nat. Rev. Immunol. 5, 953-964 (2005).
  4. Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).
  5. Tabas, I. Macrophage death and defective inflammation resolution in atherosclerosis. Nat. Rev. Immunol. 10, 36-46 (2010).
  6. Odegaard, J. I., Ricardo-Gonzalez, R. R., Goforth, M. H., Morel, C. R., Subramanian, V., Mukundan, L., Eagle, A. R., Vats, D., Brombacher, F., Ferrante, A. W., Chawla, A. Macrophage-specific pparg controls alternative activation and improves insulin resistance. Nature. 447, 1116-1120 (2007).
  7. Odegaard, J. I., Ricardo-Gonzalez, R. R., Red Eagle, A., Vats, D., Morel, C. R., Goforth, M. H., Subramanian, V., Mukundan, L., Ferrante, A. W., Chawla, A. Alternative m2 activation of kupffer cells by ppard ameliorates obesity-induced insulin resistance. Cell Metabolism. 7, 496-507 (2008).
  8. Vats, D., Mukundan, L., Odegaard, J. I., Zhang, L., Smith, K. L., Morel, C. R., Greaves, D. R., Murray, P. J., Chawla, A. Oxidative metabolism and pgc-1[beta] attenuate macrophage-mediated inflammation. Cell Metabolism. 4, 13-24 (2006).
  9. Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8, 958-969 (2008).
  10. Arkan, M. C., Hevener, A. L., Greten, F. R., Maeda, S., Li, Z. -W., Long, J. M., Wynshaw-Boris, A., Poli, G., Olefsky, J., Karin, M. Ikk-b links inflammation to obesity-induced insulin resistance. Nat. Med. 11, 191-198 (2005).
  11. Saberi, M., Woods, N. -B., de Luca, C., Schenk, S., Lu, J. C., Bandyopadhyay, G., Verma, I. M., Olefsky, J. M. Hematopoietic cell-specific deletion of toll-like receptor 4 ameliorates hepatic and adipose tissue insulin resistance in high-fat-fed mice. Cell Metab. 10, 419-429 (2009).
  12. Kang, K., Reilly, S. M., Karabacak, V., Gangl, M. R., Fitzgerald, K., Hatano, B., Lee, C. -H. Adipocyte-derived th2 cytokines and myeloid ppard regulate macrophage polarization and insulin sensitivity. Cell Metabolism. 7, 485-495 (2008).
  13. Bouhlel, M. A., Derudas, B., Rigamonti, E., Dievart, R., Brozek, J., Haulon, S., Zawadzki, C., Jude, B., Torpier, G., Marx, N., Staels, B., Chinetti-Gbaguidi, G. Pparg activation primes human monocytes into alternative m2 macrophages with anti-inflammatory properties. Cell Metabolism. 6, 137-143 (2007).
  14. Bronte, V., Zanovello, P. Regulation of immune responses by l-arginine metabolism. Nat. Rev. Immunol. 5, 641-654 (2005).
  15. Zhuang, G., Meng, C., Guo, X., Cheruku, P. S., Shi, L., Xu, H., Li, H., Wang, G., Evans, A. R., Safe, S., Wu, C., Zhou, B. A novel regulator of macrophage activation: Mir-223 in obesity-associated adipose tissue inflammation. Circulation. 125, 2892-2903 (2012).
  16. Kradin, R. L., McCarthy, K. M., Preffer, F. I., Schneeberger, E. E. Flow-cytometric and ultrastructural analysis of alveolar macrophage maturation. J. Leukoc. Biol. 40, 407-417 (1986).
  17. Stein, M., Keshav, S., Harris, N., Gordon, S. Interleukin 4 potently enhances murine macrophage mannose receptor activity: A marker of alternative immunologic macrophage activation. J. Exp. Med. 176, 287-292 (1992).
  18. Strassmann, G., Bertolini, D. R., Kerby, S. B., Fong, M. Regulation of murine mononuclear phagocyte inflammatory products by macrophage colony-stimulating factor. Lack of il-1 and prostaglandin e2 production and generation of a specific il-1 inhibitor. J. Immunol. 147, 1279-1285 (1991).
  19. Biswas, S. K., Mantovani, A. Macrophage plasticity and interaction with lymphocyte subsets: Cancer as a paradigm. Nat. Immunol. 11, 889-896 (2010).
  20. Sica, A., Mantovani, A. Macrophage plasticity and polarization: In vivo veritas. J. Clin. Invest. 122, 787-795 (2012).
التحقيق في الاستقطاب البلاعم عن طريق نخاع العظم الضامة المشتقة
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Ying, W., Cheruku, P. S., Bazer, F. W., Safe, S. H., Zhou, B. Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages. J. Vis. Exp. (76), e50323, doi:10.3791/50323 (2013).More

Ying, W., Cheruku, P. S., Bazer, F. W., Safe, S. H., Zhou, B. Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages. J. Vis. Exp. (76), e50323, doi:10.3791/50323 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter