Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

골수 유래 대 식세포를 사용하여 대식 세포 분극 조사

doi: 10.3791/50323 Published: June 23, 2013

Summary

이 문서는 쉽게 쉽게 적응을 설명

Abstract

이 문서는 대식 세포 분극을 조사하기 위해 체외 모델에서 쉽게 쉽게 적응을 설명합니다. GM-CSF/M-CSF의 면전에서, 골수에서 조혈 줄기 / 전구 세포 M1 또는 M2 자극 한 다음, 단핵구 분화에 연결됩니다. 활성 상태는 세포 표면 항원 유전자 발현 및 세포 신호 전달 경로의 변화에​​ 의해 추적 할 수 있습니다.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

고전적인 염증 반응, 조직을 침투 대식 세포의 구별은 종종 호스트 조직 생리 기능 1-8 조절에 중요한 역할을 편광 정품 인증 상태를 표시합니다. 자극에, 대식 세포 활성화는 고전 (M1) 및 대체 (M2) 활성화 2, 4, 9로 정렬 할 수 있습니다. M1 대 식세포의 활성화는 TNF-α와 같은 염증성 사이토 카인의 생산에 이르는 수신자 같은 수용체 (TLR은) 핵 인자 카파 B (NFκB) / C 6 월 N-말단 키나제 1 (JNK1)의 활성화에 따라 IL- iNOS의의 1β 및 활성화하는 등의 질화물 산화물 (NO) 10, 11와 같은 활성 산소 종의 생산 증가의 결과. 반면, M2 대식 세포 활성화 모집 PPARγ, PPARδ, 또는 IL-4-STAT6 경로는 대체 만노오스 수용체 CD206의 상향 조절과 연관되어, 항 염증 (M2) 활성화 및 arginase 1 (이며 Arg1) 6, 12로 이어지는 - 14 </>을 먹다.

골수 유래 대 식세포 (BMDM)는 활성화 된 대 식세포 15 편광을 제어하는 메커니즘을 이해하는 체외 모델의 이상을 제시한다. M2 대식 세포의 편광은 IL-4 및 / 또는 IL-13에 의해 유도 될 수 있지만, 특히 M1 대 식세포의 활성화는 리포 다당류 (LPS) 자극에 의​​해 유도 될 수있다. 성숙한 골수 유래 대 식세포 활성화 된 대 식세포는 CD11b, F4/80, CD11c, CD206, CD69, CD80 및 CD86 9, 16, 17 등의 표면 항원의 발현 유동 세포 계측법 분석을 통해 식별 할 수 있습니다. 또한, 시토 킨 생산 및 대식 세포 분극과 관련된 세포 신호 전달 경로의 변화는 정량적 RT-PCR 및 웨스턴 각각 내듯 측정 할 수 있습니다. 요약하면, 마우스 골수 유래 대 식세포는 체외에서 대식 세포 분극을 연구하는 중요한 모델이 될 수 있습니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. 골수 세포의 분리

  1. 6-8주 오래된 마우스에서 대퇴골과 경골 뼈를 분리, 머리를 헹구어 낸 후 뼈를 자르면.
  2. 차가운 PBS 2 %의 열 비활성화 태아 소 혈청 (FBS) (3-5 ML / 마우스)에 골수를 플러시 21G 바늘과 10 ML의 주사기를 사용합니다.
  3. 세포를 해리 21G 바늘을 통해 4-6 번 골수를 전달합니다.
  4. 세포 덩어리, 뼈, 머리 및 다른 세포 / 조직을 제거하기 위해 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 세포를 전달합니다.
  5. NH 4 염소 용액 (0.8 % NH 4 망할 CIA 솔루션 스템 셀 기술) 3 볼륨을 추가하고, 적혈구를 제거하는 10 분 동안 얼음에 품어.
  6. 4 ° C.에서 5 분 500 XG에서 세포를 스핀 다운
  7. 차가운 PBS 2 % FBS (20 ~ 50 ml의 세포의 양에 따라)에있는 세포 펠렛을 resuspend.

2. 유도 BMDM 형성

  1. BMDM 성장 배지에서 분리 된 골수 세포 (2 × 10 6 세포 / M resuspend을L).

BMDM 성장 매체 :

Iscove의 수정 된 Dulbecco의 중간 (IMDM) + 10 % FBS + 15 % 여과 (0.2 μm의) L-929 세포 (ATCC, CCL-1) 문화 상층 액 (단핵구 콜로니 자극 인자, M-CSF를 포함) 또는 10 NG / ML M -CSF.

참고 : L-929 세포의 상층 액은 M-CSF 18이 포함되어 있습니다. 에어컨 중간, 5의 효과적인 활동을 보장하기 위해 X 10 5 L-929 세포 6-7일에 대한 T75 cm 2 플라스크에 씨앗을 품고 있으며, 에어컨 매체를 사용하기 전에 필터 0.45 μm의를 통해 수집하고 전달됩니다. 중간 분주은 1-2 개월 동안 즉시 사용할 또는 -80 ° C에 저장할 수 있습니다.

  1. 6 12 잘 조직 배양 플레이트 (실험 설계에 따라 다름) (코닝 공연자)의 씨앗 세포.
  2. 3 일 신선한 BMDM 성장 매체를 변경합니다.
  3. 하루에 7, 성숙 BMDM의 형성은 유동 세포 계측법 분석을 사용하여 평가됩니다및 형광 결합 항체는 CD11b 및 F4/80을 표현하는 세포를 감지합니다.

3. BMDM 편광 활성화

  1. 7 일째에 신선한 자극을 매체로 변경 M1 활성화, IMDM 50 NG / ML IFNγ와 10 % FBS, 100 NG / ML LPS 또는 100 NG / ML LPS를 포함한 사용, M2 활성화와 10 % FBS를 포함 IMDM을 사용 10 NG / ML IL-4 및 / 또는 10 NG / ML IL-13.
  2. 따뜻한 0.05 % 트립신을 사용하여 요리에서 그들을 분리에 의해 자극 BMDMs를 수집 PBS 10 % FBS를 포함한 두 번 세포를 세척 한 다음.

참고 : 차별화 후 성숙 식세포, 0.05 % 트립신 용액 (0.48 mM의 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), Invitrogen의를 포함) 또는 칼슘과 마그네슘이없는 PBS 또는 행크의 균형 버퍼 (HBSS)에 2-5 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)를 분리하고 resuspend을 위해 사용할 수 있습니다. 트립신을 포함하는 소화 매체를 사용하는 경우, 셀 쉬르의 손실을 방지하기 위해보다 10 분 동안 37 ° C에서 처리됩니다얼굴에 소화에 의한 단백질.

  1. CD11b, F4/80, CD11c, CD206, CD69, CD80 또는 표준 유동 세포 계측법 염색 프로 시저를 사용하여 다양한 시간 지점에서 CD86를 포함하여, 세포 표면 항원의 발현을 검출하기 위하여 항체를 사용합니다.
  2. QRT-PCR을 이용하여 IL-1β, TNF-α와 IL-6 (M1 활성화) 또는 IL-10, IL-13, arginase1 및 PPARγ (M2 활성화) 등의 활성화 M1 및 M2 대식 세포의 특징적인 유전자의 발현을 확인합니다. 웨스턴 블롯 분석에 의한 M1 또는 M2 대식 세포의 활성화에 관련된 세포 신호 전달 경로의 활성화를 결정합니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

BMDM 생성 과정의 개략적 인 설명은 (그림 1) 표시됩니다. 그들은 CD11b + F4/80 + 세포의 95-99% (그림 2)를 나타냅니다 때 성숙한 대식 세포의 순도는 7 일에 관찰 할 수 있습니다. 편광 식세포가 CD11b, F4/80에 대한 항체를 사용하여 검사 할 수 있습니다, CD11c와 CD206는 유동 세포 계측법 분석에 의해 따랐다. 그림 3에서와 같이, M1 대 식세포는 다음과 같이 발견 된 CD11b + F4/80 + CD11c + CD206-세포 (Q2), M2 대식 세포는 CD11b 반면 + F4/80 + CD11c-CD206 + 세포 (Q4). BMDM 활성화 상태가 증가 세포의 크기 (그림 4A, FSC-A에서 오른쪽으로 이동) 및 표면 항원의 증가 풍부한 CD69, CD80, 또는 대식 세포에서 CD86에 의해 확인 될 수있다 (문 : CD11b + F4/80 +) 그림에서와 같이 4B. 시토 킨 생산, 유전자 발현 및 M1 또는 M2 대식 세포의 세포 신호 전달 경로의 활성화는 정량적 RT-PCR이나 웨스턴 블로 팅을 사용하여 평가할 수 있습니다.의 그림 5와 같이 arginase 1 (이며 Arg1)와 PPARγ 수준은 10 NG / ML IL-4 자극에 M2 대식 세포에서 증가 하였다, IL-1β와 TNFα 생산이 100 NG / ML LPS로 자극 식세포 (M1) 증가 하였다 반면 , 어떤은 P65 활성화 (그림 6)에 의해 동반됩니다.

그림 1
그림 1. 격리, 형성 및 마우스 BMDMs의 자극에 대한 계획. 단계 절차에 의해 단계는 텍스트에 설명되어 있습니다. 간단한, 대퇴골 및 경골 뼈 PBS가 2 % 열 불 활성화 FBS와 보충하여 플러시 6~8주 마우스 골수 세포에서 수집됩니다. 적혈구는 NH4Cl 용액으로 용해 된 후, 세포는 세포 인구의 순도 성숙과 분석에 의해 다음 칠일에 대한 BMDM 성장 배지에서 배양된다. 대식 포의 분석 larization, 세포 M2 활성화를 위해 + IFNγ M1, 또는 IL-4 및 / 또는 IL-13 LPS 또는 LPS로 자극 하였다. 극화 된 대 식세포는 세포 형태의 변화, 표면 마커 프레 젠 테이션, 시토 킨 생산 및 활성화 세포 신호 전달 경로의 기준으로 평가할 수 있습니다.

그림 2
그림 2. BMDM 형성 유동 세포 계측법 분석. (A) BMDMs 파편과 복합체를 제거하는 FSC와 SSC에 처음 문이었다. (B) 성숙한 BMDMs는 다음과 같이 정의 된 CD11b의 백분율로 표시되는 순도 + F4/80 + 모집단 (오른쪽) FSC / SSC에 문이 부모의 인구.

s/ftp_upload/50323/50323fig3highres.jpg "/>
그림 3. . 대식 세포 편광 분석 조직 침투 대식 세포는 CD11b + F4/80 + 세포로 정의되며, M1 대 식세포는 CD11b 있습니다 + F4/80 + CD11c + CD206-세포, M2 대식 세포는 CD11b + F4/80 + CD11c-CD206 + 세포 수 있습니다 반면.

그림 4
그림 4. 유동 세포 계측법에 의한 대 식세포의 활성 분석. (A) 활성화되면, 대식 세포의 크기는 M0 (치료) 대 식세포에 비해 자극 후 24 시간에서 M1 또는 M2 대식 세포의 FSC-A의 변화에 의해 입증 증가한다. (B) 활성화 관련 표면 마커는 IL4이나 LPS 자극 후 유동 세포 계측법에 의해 분석 하였다. 초기 응답 마커 CD69는 5 또는 24 시간 후 자극에서 평가되었다 CD80 및 CD86 마르크RS는 자극 후 48 시간에서 분석 하였다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 5
그림 5. 대식 세포의 대안 활성화. 24 시간 동안 10 NG / ML IL-4로 자극 식세포를 수집하고 총 RNA가 추출되었다. 정량적 RT-PCR 분석을 사용하여 치료 대식 세포에 비해 높은 arginase 1 (이며 Arg1)와 PPARγ 발현 M2 대식 세포에서 발견되었다.

그림 6
그림 6. 대 식세포의 고전 활성화. (A) 총 RNA 100 NG / ML L로 자극 대식 세포에서 추출 된24 시간 정량적 RT-PCR 분석에 사용을위한 PS. IL-1β와 TNFα 등의 염증성 사이토 카인의 발현은 M1 대식 세포에서 증가했다. P65에 대한 항체를 사용하여 결정하고 서양 블롯 분석에서 P65을 인산화로 (B) NFκB 경로의 활성화는 LPS에 의해 유도되었다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

우리는 여기에서 골수 전구 세포에서 유래 대 식세포의 활성화를 유도 할 수있는 간단하고 체외에서 쉽게 적응할 수있는 절차를보고합니다. 이 절차는 대식 세포의 편광에 대한 책임 메커니즘의 연구에 사용할 수 있습니다. 성숙한 대식 세포의 순도는이 프로토콜의 평균에게 95-99%을 사용하여 얻은하고 추가 정제 과정이 필요하지 않습니다. 대식 세포 분극, 자궁외 식 또는 유전자의 특정 최저의 맥락에서 이해 특정 유전자의 기능을 조사하려면 하루 7 세포의 다음과 같은 형질을 수행 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 또한 형성, 성숙과 대식 세포의 표현형에 영향을 미치는 특정 요인이나 유전자의 영향을 조사하기 위해 7 일 문화의 창을 제공합니다.

활성화 된 대 식세포는 다양한 자극 3, 9, 19에 대한 응답으로 좋은 가소성을 가진 복잡한 세포 및 분자 프로파일을 표시합니다. 용그러나, 활성 프로파일이 완전히 중복되지 않는 예, LPS는 IFNγ 또는 종양 괴사 인자 (TNF)와 IL-4와 IL-13 M2 활성화를 자극 모두의 존재 더욱 강화 될 수있다 강력한 프로 염증성 M1 반응을 이끌어 3, 4, 9, 15, 19, 20. 이 프로토콜에 제시된 결과는 유동 세포 계측법, 정량적 RT-PCR과 웨스턴 블롯으로 분석 골수 유래 대 식세포와 실험의 일반적인 결과를 나타냅니다. 대 식세포의 활성화와 관련된 표면 항원 프레 젠 테이션 및 세포 신호 경로는 같은 대식 세포 분극 1-8 광범위한 문헌에 언급 달라집니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

이 작품은 미국 심장 협회 (박사 Beiyan 저우에 BGIA 7,850,037)에 의해 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IMDM Thermo Scientific SH30259.01
Fetal bovine serum Invitrogen 10438-026
Murine GM-CSF PeproTech 315-03
NH4Cl StemCell Technologies 7850
L-929 ATCC CCL-1
70 μm cell strainer BD Biosciences 352350
10 x PBS Thermo Scientific AP-9009-10
Anti-mouse CD11b-APC eBioscience 17-0112-81
Anti-mouse F4/80-FITC eBioscience 11-4801-81
Anti-mouse CD69-PE eBioscience 12-0691-81
Anti-mouse CD86-PE eBioscience 12-0862-81
Propidium Iodine Invitrogen P3566

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Meng, Z. X., Wang, G. X., Lin, J. D. A microrna circuitry links macrophage polarization to metabolic homeostasis. Circulation. (2012).
  2. Lumeng, C. N., Bodzin, J. L., Saltiel, A. R. Obesity induces a phenotypic switch in adipose tissue macrophage polarization. J. Clin. Invest. 117, 175-184 (2007).
  3. Gordon, S., Taylor, P. R. Monocyte and macrophage heterogeneity. Nat. Rev. Immunol. 5, 953-964 (2005).
  4. Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).
  5. Tabas, I. Macrophage death and defective inflammation resolution in atherosclerosis. Nat. Rev. Immunol. 10, 36-46 (2010).
  6. Odegaard, J. I., Ricardo-Gonzalez, R. R., Goforth, M. H., Morel, C. R., Subramanian, V., Mukundan, L., Eagle, A. R., Vats, D., Brombacher, F., Ferrante, A. W., Chawla, A. Macrophage-specific pparg controls alternative activation and improves insulin resistance. Nature. 447, 1116-1120 (2007).
  7. Odegaard, J. I., Ricardo-Gonzalez, R. R., Red Eagle, A., Vats, D., Morel, C. R., Goforth, M. H., Subramanian, V., Mukundan, L., Ferrante, A. W., Chawla, A. Alternative m2 activation of kupffer cells by ppard ameliorates obesity-induced insulin resistance. Cell Metabolism. 7, 496-507 (2008).
  8. Vats, D., Mukundan, L., Odegaard, J. I., Zhang, L., Smith, K. L., Morel, C. R., Greaves, D. R., Murray, P. J., Chawla, A. Oxidative metabolism and pgc-1[beta] attenuate macrophage-mediated inflammation. Cell Metabolism. 4, 13-24 (2006).
  9. Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8, 958-969 (2008).
  10. Arkan, M. C., Hevener, A. L., Greten, F. R., Maeda, S., Li, Z. -W., Long, J. M., Wynshaw-Boris, A., Poli, G., Olefsky, J., Karin, M. Ikk-b links inflammation to obesity-induced insulin resistance. Nat. Med. 11, 191-198 (2005).
  11. Saberi, M., Woods, N. -B., de Luca, C., Schenk, S., Lu, J. C., Bandyopadhyay, G., Verma, I. M., Olefsky, J. M. Hematopoietic cell-specific deletion of toll-like receptor 4 ameliorates hepatic and adipose tissue insulin resistance in high-fat-fed mice. Cell Metab. 10, 419-429 (2009).
  12. Kang, K., Reilly, S. M., Karabacak, V., Gangl, M. R., Fitzgerald, K., Hatano, B., Lee, C. -H. Adipocyte-derived th2 cytokines and myeloid ppard regulate macrophage polarization and insulin sensitivity. Cell Metabolism. 7, 485-495 (2008).
  13. Bouhlel, M. A., Derudas, B., Rigamonti, E., Dievart, R., Brozek, J., Haulon, S., Zawadzki, C., Jude, B., Torpier, G., Marx, N., Staels, B., Chinetti-Gbaguidi, G. Pparg activation primes human monocytes into alternative m2 macrophages with anti-inflammatory properties. Cell Metabolism. 6, 137-143 (2007).
  14. Bronte, V., Zanovello, P. Regulation of immune responses by l-arginine metabolism. Nat. Rev. Immunol. 5, 641-654 (2005).
  15. Zhuang, G., Meng, C., Guo, X., Cheruku, P. S., Shi, L., Xu, H., Li, H., Wang, G., Evans, A. R., Safe, S., Wu, C., Zhou, B. A novel regulator of macrophage activation: Mir-223 in obesity-associated adipose tissue inflammation. Circulation. 125, 2892-2903 (2012).
  16. Kradin, R. L., McCarthy, K. M., Preffer, F. I., Schneeberger, E. E. Flow-cytometric and ultrastructural analysis of alveolar macrophage maturation. J. Leukoc. Biol. 40, 407-417 (1986).
  17. Stein, M., Keshav, S., Harris, N., Gordon, S. Interleukin 4 potently enhances murine macrophage mannose receptor activity: A marker of alternative immunologic macrophage activation. J. Exp. Med. 176, 287-292 (1992).
  18. Strassmann, G., Bertolini, D. R., Kerby, S. B., Fong, M. Regulation of murine mononuclear phagocyte inflammatory products by macrophage colony-stimulating factor. Lack of il-1 and prostaglandin e2 production and generation of a specific il-1 inhibitor. J. Immunol. 147, 1279-1285 (1991).
  19. Biswas, S. K., Mantovani, A. Macrophage plasticity and interaction with lymphocyte subsets: Cancer as a paradigm. Nat. Immunol. 11, 889-896 (2010).
  20. Sica, A., Mantovani, A. Macrophage plasticity and polarization: In vivo veritas. J. Clin. Invest. 122, 787-795 (2012).
골수 유래 대 식세포를 사용하여 대식 세포 분극 조사
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ying, W., Cheruku, P. S., Bazer, F. W., Safe, S. H., Zhou, B. Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages. J. Vis. Exp. (76), e50323, doi:10.3791/50323 (2013).More

Ying, W., Cheruku, P. S., Bazer, F. W., Safe, S. H., Zhou, B. Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages. J. Vis. Exp. (76), e50323, doi:10.3791/50323 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter