Summary
El artículo describe una adaptación fácil fácil
Abstract
El artículo describe una adaptación fácil fáciles modelo in vitro para investigar la polarización de macrófagos. En la presencia de GM-CSF/M-CSF, las células madre / progenitoras hematopoyéticas de la médula ósea se dirigen en la diferenciación monocítica, seguido por la estimulación M1 o M2. El estado de activación puede ser rastreado por los cambios en antígenos de superficie celular, expresión de genes y vías de señalización celulares.
Introduction
A diferencia de las respuestas inflamatorias clásicas, macrófagos que infiltran tejidos a menudo muestran el estado de activación polarizada que juega un papel crucial en la regulación de las funciones fisiológicas del tejido huésped 1-8. Después de la estimulación, la activación de los macrófagos puede ser ordenada en clásicos (M1) y (M2) de activación alternativa 2, 4, 9. La activación de macrófagos M1 depende de los receptores de tipo Toll (TLR) y la activación del factor nuclear kappa B (NFkB) / c-Jun N-terminal quinasa 1 (JNK1), conducen a la producción de citoquinas inflamatorias, como el TNF-α e IL- 1β y la activación de iNOS que resulta en aumento de la producción de especies reactivas del oxígeno, tales como óxido de nitruro (NO) 10, 11. En contraste, la activación de macrófagos M2 reclutas PPAR, PPAR, o IL-4-STAT6 vías, que conduce a la activación alternativa, anti-inflamatoria (M2) que se asocia con la regulación positiva de CD206 receptor de manosa, y arginasa 1 (Arg 1) 6, 12 - 14 </ Sup>.
Macrófagos derivados de médula ósea (BMDM) presentan un ideal modelo in vitro para entender los mecanismos que controlan la polarización de macrófagos activados 15. Específicamente, la activación de los macrófagos M1 puede ser inducida por lipopolisacáridos (LPS) de estimulación, mientras que la polarización de los macrófagos M2 puede ser inducida por la IL-4 y / o IL-13. Macrófagos derivados de médula ósea y macrófagos maduros activados pueden ser identificados a través de análisis de citometría de flujo para la expresión de antígenos de superficie, incluyendo CD11b, F4/80, CD11c, CD206, CD69, CD80 y CD86 9, 16, 17. Además, los cambios en la producción de citoquinas y vías de señalización celular asociadas con la polarización de macrófagos pueden ser medidos por RT-PCR cuantitativa y Western Blot, respectivamente. En resumen, macrófagos derivados de médula ósea de ratón pueden servir como un modelo relevante para estudiar la polarización de macrófagos in vitro.
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Protocol
1. Aislamiento de células de médula ósea
- Aislar huesos fémur y tibia 6-8 semanas de edad ratones, enjuagar el cabello y luego cortar el hueso.
- Utilice una aguja 21G y una jeringa 10 ml para eliminar ósea en PBS 2% inactivado por calor suero fetal bovino frío (FBS) (3-5 ml / ratón).
- Pasar ósea a través de una aguja 21G 4-6 veces para disociar las células.
- Pasar las células a través de un filtro de células de 70 micras para eliminar grupos de células, hueso, pelo y otras células / tejidos.
- Añadir 3 volumen de solución de NH4Cl (0,8% solución de NH 4 Cl, Stemcell Tecnología), e incubar en hielo durante 10 min para eliminar las células rojas de la sangre.
- Centrifugar las células a 500 xg durante 5 min a 4 ° C.
- Resuspender el sedimento celular en PBS frío 2% de FBS (20-50 ml, dependiendo de la cantidad de células).
2. Formación BMDM Inducción
- Resuspender las células de médula ósea aisladas en medio de crecimiento BMDM (2x10 6 células / ml).
BMDM medio de crecimiento:
Medio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM) + 10% de FBS + 15% filtrada (0,2 micras) L-929 células (ATCC, CCL-1) sobrenadante de cultivo (que contiene el factor estimulante de colonias de monocitos, M-CSF) o 10 ng / ml de M -CSF.
Nota: L-929 sobrenadante celular contiene M-CSF 18. Para garantizar la actividad eficaz de medio condicionado, 5 X 10 5 L-929 células se sembraron en matraces T75 cm 2 durante 6-7 días, se recogió el medio acondicionado y se hace pasar a través de un filtro de 0,45 mM antes de su uso. Mediano alícuotas se pueden utilizar inmediatamente o se almacenan en -80 ° C durante 1-2 meses.
- Se siembran las células en 6 o 12 placas de cultivo de tejidos (dependiendo del diseño experimental) (Corning Costar).
- Cambio de medio de crecimiento fresco en BMDM día 3.
- En el día 7, se evalúa la formación de BMDM madura usando análisis de citometría de flujoy anticuerpos conjugados con fluoróforo para detectar células que expresan CD11b y F4/80.
3. BMDM activación polarizada
- En el día 7, cambiar a medio de estimulación fresco: para la activación M1, utilizar IMDM que contenía 10% de FBS y 100 ng / ml de LPS o 100 ng / ml de LPS con 50 ng / ml de IFN; para la activación M2, utilizar IMDM que contenía 10% de FBS con 10 ng / ml de IL-4 y / o 10 ng / ml de IL-13.
- Recoger BMDMs estimuladas por separarlas de la placa caliente usando 0,05% de tripsina, seguido por lavado de las células dos veces con PBS que contenía 10% de FBS.
Nota: Para separar y volver a suspender los macrófagos maduros después de la diferenciación, solución de tripsina 0,05% (que contiene 0,48 mM de EDTA, Invitrogen) o 2-5 mM de EDTA en-Ca y Mg libre de PBS o tampón equilibrada de Hank (HBSS) se puede utilizar. Cuando se usa medio digestivo que contiene tripsina, las células se tratan a 37 ° C durante menos de 10 min para evitar la pérdida de surproteínas de la cara debido a la sobre-digestión.
- Usar anticuerpos para detectar la expresión de antígenos de superficie celular, incluyendo CD11b, F4/80, CD11c, CD206, CD69, CD80 o CD86 en varios puntos de tiempo utilizando los procedimientos de tinción de citometría de flujo estándar.
- Determinar la expresión de genes característicos de los macrófagos M1 y M2 activados incluyendo IL-1β, TNF-α e IL-6 (activación M1) o IL-10, IL-13, arginase1 y PPAR? (Activación M2) utilizando QRT-PCR. Determinar la activación de vías de señalización celular implicadas en la activación de los macrófagos M1 o M2 por análisis de Western Blot.
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Representative Results
Se presenta una descripción esquemática del procedimiento de generación de BMDM (Figura 1). De alta pureza de los macrófagos maduros se puede observar en el día 7 cuando representan 95 a 99% de las células CD11b + F4/80 + (Figura 2). Macrófagos polarizadas se pueden examinar utilizando anticuerpos contra CD11b, F4/80, CD11c y CD206 seguidos por análisis de citometría de flujo. Como se muestra en la Figura 3, los macrófagos M1 se detectan como CD11b + F4/80 + CD11c + CD206-células (Q2), mientras que los macrófagos M2 son CD11b + F4/80 + células CD11c + CD206-(Q4). El estado de activación BMDM puede confirmarse por el aumento de tamaño celular (Figura 4A, desplazamiento a la derecha en el FSC-A) y aumento de la abundancia de los antígenos de superficie CD69, CD80, o CD86 en macrófagos (Puerta: CD11b + F4/80 +) como se muestra en la figura 4B. La producción de citocinas, la expresión de genes y la activación de la vía de señalización celular en macrófagos M1 o M2 pueden ser evaluados utilizando RT-PCR cuantitativa o Western Blot. Las se muestra en la Figura 5, 1 arginasa (Arg 1) y los niveles de PPAR? se incrementaron en los macrófagos M2 a 10 ng / ml de IL-4 estimulación, mientras que la producción de IL-1β y TNF se incrementaron en los macrófagos (M1) estimuladas con 100 ng / ml de LPS , que se acompaña de la activación de p65 (Figura 6).
Figura 1. Esquema para el aislamiento, la formación y la estimulación de BMDMs ratón. Paso a paso los procedimientos se describen en el texto. En resumen, el fémur y la tibia huesos se recogen 6-8 semanas los ratones y las células de la médula ósea purgada con PBS suplementado con 2% de FBS inactivado por calor. Después de las células rojas de la sangre se lisan con solución de NH4Cl, las células se cultivan en medio de crecimiento BMDM durante 7 días, seguido de maduración y el análisis de la pureza de la población de células. Para el análisis de los macrófagos po vascularización, las células fueron estimuladas con LPS o LPS + IFN para M1, o IL-4 y / o IL-13 para la activación M2. Macrófagos polarizadas se pueden evaluar sobre la base de los cambios en la morfología celular, presentación marcador de superficie, la producción de citoquinas y la vía de señalización de células activadas.
Figura 2. El análisis de citometría de flujo de la formación de BMDM. (A) BMDMs fueron primero cerrada en FSC y SSC para eliminar los restos y conjugados. (B) BMDMs maduros se definieron como CD11b + F4/80 + subpoblaciones (superior derecha) con la pureza se muestra como porcentaje de población de padres cerrada en FSC / SSC.
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Figura 3. . Análisis de polarización de macrófagos de tejido macrófagos infiltrados se definen como células CD11b + F4/80 +; macrófagos M1 son CD11b + F4/80 + CD11c + CD206-células, mientras que los macrófagos M2 son células CD11b + F4/80 + CD11c-CD206 +.
La Figura 4. El análisis por activación de macrófagos por citometría de flujo. (A) Tras la activación, el tamaño de los macrófagos incrementado, como demuestra el cambio de FSC-A de M1 o M2 macrófagos a las 24 h después de la estimulación en comparación con M0 (sin tratar) los macrófagos. (B) La activación marcadores de superficie relacionados se analizaron por citometría de flujo después de la estimulación con LPS o IL-4. Los primeros que respondieron marcador CD69 se evaluó en 5 o 24 horas después de la estimulación; CD80 y CD86 Markers se analizaron a las 48 h después de la estimulación. Haz clic aquí para ver más grande la figura .
Figura 5. Activación alternativa de macrófagos. Los macrófagos estimulados con 10 ng / ml de IL-4 durante 24 horas se recogió y se extrajo el ARN total. Arginasa elevada 1 (Arg 1) y PPAR expresión se detectó en los macrófagos M2 en comparación con los macrófagos no tratados utilizando análisis de RT-PCR cuantitativa.
La Figura 6. La activación clásica de macrófagos. (A) ARN total fue extraído a partir de macrófagos estimulados con 100 ng / ml de LPS durante 24 horas y se utiliza en los análisis cuantitativos RT-PCR. La expresión de citoquinas proinflamatorias incluyendo IL-1β y TNF aumentó en los macrófagos M1. (B) de activación de la vía de NFkB fue inducida por LPS como se determina utilizando anticuerpos frente a p65 y p65 fosforilada en los análisis de Western Blot.
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Discussion
Se presenta aquí un procedimiento simple y fácilmente adaptable in vitro para inducir la activación de los macrófagos derivados de células progenitoras de médula ósea. Este procedimiento se puede utilizar para la investigación de los mecanismos responsables de la polarización de los macrófagos. La pureza de los macrófagos maduros obtuvo utilizando este protocolo promedios 95 a 99%, y no se requieren procedimientos de purificación adicionales. Para investigar la función de los genes específicos de interés en el contexto de la polarización de macrófagos, la expresión ectópica o derribo de genes específicos puede llevar a cabo después de la transfección de las células en el día 7. Este protocolo también proporcionará una ventana de cultivo de 7 días para investigar los efectos de ciertos factores o genes que afectan a la formación, la maduración y el fenotipo de los macrófagos.
Los macrófagos activados muestran perfiles celulares y moleculares complicadas con gran plasticidad en respuesta a diversos estímulos 3, 9, 19. Paraejemplo, LPS provoca potentes respuestas M1 pro-inflamatorias que pueden ser aún más mejorada en presencia de IFN o el factor de necrosis tumoral (TNF) e IL-4 e IL-13 tanto estimular la activación M2, sin embargo, los perfiles de activación no se solapan completamente 3, 4, 9, 15, 19, 20. Los resultados presentados en este protocolo sólo representan resultados típicos de los experimentos con macrófagos de médula ósea derivados analizados por citometría de flujo, cuantitativos de RT-PCR y Western Blot. Superficie de la presentación de antígenos y vías de señalización celular asociada con la activación de los macrófagos varían como se ha indicado en la extensa literatura sobre macrófagos polarización 1-8.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la American Heart Association (BGIA 7850037 al Dr. Beiyan Zhou).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IMDM | Thermo Scientific | SH30259.01 | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10438-026 | |
| Murine GM-CSF | PeproTech | 315-03 | |
| NH4Cl | StemCell Technologies | 7850 | |
| L-929 | ATCC | CCL-1 | |
| 70 μm cell strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| 10 x PBS | Thermo Scientific | AP-9009-10 | |
| Anti-mouse CD11b-APC | eBioscience | 17-0112-81 | |
| Anti-mouse F4/80-FITC | eBioscience | 11-4801-81 | |
| Anti-mouse CD69-PE | eBioscience | 12-0691-81 | |
| Anti-mouse CD86-PE | eBioscience | 12-0862-81 | |
| Propidium Iodine | Invitrogen | P3566 |
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