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Bioengineering

विकास, विस्तार, और Published: April 23, 2013 doi: 10.3791/50337
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2
1Department of Medicine (Hematology, Oncology, and Transplant), University of Minnesota, Minneapolis, 2Stem Cell Institute, University of Minnesota, Minneapolis
* These authors contributed equally

Summary

इस प्रोटोकॉल के विकास, विस्तार, और hESCs और iPSCs से व्युत्पन्न एन.के. कोशिकाओं के vivo इमेजिंग में वर्णन करता है.

Abstract

हम एक फीडर से मुक्त दृष्टिकोण का उपयोग undifferentiated hESCs और iPSCs से प्राकृतिक हत्यारा (एन.के. सेल) पाने के लिए एक तरीका मौजूद है. इस विधि 4 सप्ताह संस्कृति के बाद एन.के. कोशिकाओं के उच्च स्तर को जन्म देता है और कृत्रिम प्रतिजन कोशिकाओं के साथ आगे 2 लॉग विस्तार से गुजरना कर सकते हैं. इस प्रणाली में विकसित hESC और iPSC व्युत्पन्न एन.के. कोशिकाओं को एक परिपक्व phenotype और समारोह है. आनुवंशिक रूप से परिवर्तनीय एन.के. कोशिकाओं की बड़ी संख्या का उत्पादन दोनों बुनियादी यंत्रवत के साथ ही विरोधी ट्यूमर के अध्ययन के लिए लागू है. HESC व्युत्पन्न एन.के. कोशिकाओं में जुगनू luciferase की अभिव्यक्ति एक गैर इनवेसिव दृष्टिकोण एन.के. सेल engraftment, वितरण, और समारोह का पालन करने की अनुमति देता है. हम भी दो अलग सेल आबादी के अलग निगरानी और अधिक स्पष्ट vivo में उनकी बातचीत को अनुमति देता है कि एक दोहरे इमेजिंग योजना का वर्णन है. Vivo इमेजिंग में व्युत्पत्ति, विस्तार, और दोहरे का यह तरीका एक विश्वसनीय एन.के. कोशिकाओं के उत्पादन के लिए दृष्टिकोण और उनके evalu प्रदान करता हैवर्तमान एन.के. सेल दत्तक उपचार में सुधार के लिए आवश्यक है जो समझना.

Introduction

मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESCs) और प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSCs) असीमित आत्म नवीकरण और बहु ​​- वंश भेदभाव करने में सक्षम अविभाजित, pluripotent कोशिकाओं हैं. hESCs के सफलतापूर्वक 1-3 hematopoietic प्रणाली की कोशिकाओं सहित प्रत्येक रोगाणु परत की परिपक्व और कार्यात्मक कैंपेन्स, में भेदभाव किया गया है. प्राकृतिक हत्यारा (एन.के. सेल) stromal सेल लाइनों 1,2,6-8 साथ embryoid निकायों के गठन (ईबीएस) 4,5 या सह संस्कृति से hESCs से प्राप्त किया जा सकता है कि सहज प्रतिरक्षा प्रणाली की लिम्फोसाइटों हैं. एन.के. कोशिकाओं विरोधी वायरल और विरोधी ट्यूमर क्षमताओं के अधिकारी और वे पहले प्रतिजन उत्तेजना उनके प्रेरक कार्यों का निष्पादन करने की आवश्यकता नहीं है, के रूप में दुर्दमताओं का एक व्यापक रेंज के खिलाफ प्रभावी होने की संभावना है. इस प्रकार, hESC व्युत्पन्न एन.के. कोशिकाओं immunotherapy के लिए कोशिकाओं का एक आकर्षक स्रोत हैं. इसके अतिरिक्त, hESCs से एन.के. कोशिकाओं की व्युत्पत्ति सामान्य विकास का अध्ययन करने के लिए एक आनुवंशिक रूप से उत्तरदायी प्रणाली प्रदान करता है <उन्हें> इन विट्रो में.

वे एक आनुवंशिक विनयशील प्रणाली प्रदान करते हैं, hESC व्युत्पन्न एन.के. कोशिकाओं प्रयोगात्मक इन विट्रो और इन विवो में एन.के. सेल प्रेरक कार्यों का अध्ययन करने के लिए एक इष्टतम मॉडल उपलब्ध कराने फ्लोरोसेंट और bioluminescent पत्रकारों को व्यक्त करने के लिए संशोधित किया जा सकता है. hESC व्युत्पन्न एन.के. कोशिकाओं को एचआईवी 9, ल्यूकेमिया (K562) और अन्य प्रकार के कैंसर 7,8 सहित लक्ष्यों की एक श्रृंखला के खिलाफ गतिविधि के अधिकारी. हालांकि, क्षमता कुशलता से एक डिग्री कम है, एन.के. सेल विकास और कैंसर विरोधी कार्यों के vivo अध्ययन में व्यापक पूर्व नैदानिक ​​के लिए एक सीमा तक, इलाज के रोगियों में सक्षम पर्याप्त एन.के. कोशिकाओं नैदानिक ​​अनुवाद के लिए एक महत्वपूर्ण बाधा बनी हुई है और प्राप्त करने के लिए. यहाँ, हम hESCs 4,5,10 से hematopoietic पूर्वज प्राप्त करने के लिए एक स्पिन ईबी दृष्टिकोण का उपयोग करें. 11 दिनों के बाद स्पिन ईबीएस 28 दिनों के लिए फीडरों के साथ या बिना एन.के. सेल संस्कृति के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं. एन.के. सेल संस्कृति माध्यम में 4 हफ्तों के बाद, एन.के. कोशिकाओं ट्रॅन हैंकृत्रिम प्रतिजन कोशिकाओं (aAPCs) के रूप में सेवा करते हैं जो झिल्ली ही सीमित इंटरल्यूकिन 21 (आईएल -21), व्यक्त करने के लिए संशोधित K562 कोशिकाओं के साथ सह संस्कृति को sferred. इन कृत्रिम APCs 11,12 उपयोग कर परिधीय रक्त एन.के. कोशिकाओं के विस्तार के लिए एक प्रोटोकॉल आदत डाल, हम एक परिपक्व phenotype और साइटोटोक्सिक क्षमताओं को बनाए रखते हुए एन.के. कोशिकाओं 2 लॉग का विस्तार करने में सक्षम हैं.

विकास और विस्तार की यह प्रक्रिया विवो लक्षण वर्णन में व्यापक लिए पर्याप्त hESC व्युत्पन्न एन.के. कोशिकाओं प्रदान करता है. Vivo अध्ययन में, हम व्यक्त गैर invasively इंजेक्शन जुगनू luciferase की दीर्घकालिक engraftment और कैनेटीक्स निगरानी करने में सक्षम हैं (Fluc +) bioluminescence इमेजिंग का उपयोग कर hESC व्युत्पन्न एन.के. कोशिकाओं. इसके अलावा, हम एक दोहरी, bioluminescent या फ्लोरोसेंट इमेजिंग योजना का उपयोग कर ट्यूमर कोशिकाओं के साथ एन.के. सेल बातचीत का पालन करने में सक्षम हैं. हमारे समूह से पहले के एक अध्ययन ट्यूमर प्रगति और cle के पालन करने के लिए एक विरोधी ट्यूमर मॉडल में bioluminescence इमेजिंग का इस्तेमाल कियाविवो 7 में Fluc + K562 कोशिकाओं की Arance. अब, एक्सप्रेस जुगनू luciferase 13,14 को हमारे hESCs के इंजीनियरिंग द्वारा हम हाल ही में विशेषता फ्लोरोसेंट प्रोटीन, turboFP650 15 व्यक्त कि K562 ट्यूमर कोशिकाओं को एन.के. कोशिकाओं के biodistribution और तस्करी का पालन कर सकते हैं. हम एक साथ vivo में दो सेल आबादी (चित्रा 1) का पालन करने के लिए इस दोहरी संवाददाता प्रणाली को चुना है. हाल दोहरी इमेजिंग मॉडल दोहरे luciferase सिस्टम दिया गया है, लेकिन इन प्रणालियों के तकनीकी कारण coelenterazine का वितरण आवश्यकताओं के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है, सब्सट्रेट सबसे Renilla और Gaussia luciferase पत्रकारों 16-18 की अभिव्यक्ति के लिए आवश्यक है. फ्लोरोसेंट संवाददाताओं कई सेल लाइनों और इन विट्रो में निर्माणों की आसान निगरानी की अनुमति दी है, लेकिन कारण ऊतक और फर autofluorescence और कई सह के उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के बीच ओवरलैप करने के लिए vivo इमेजिंग में सीमित सफलता मिली हैmmonly GFP, dsRed, और tdTomato 15,19 सहित फ्लोरोसेंट संवाददाताओं से इस्तेमाल किया. यह चिंता का विषय है बेहतर ऊतक अंतर्वेधन और पृष्ठभूमि 15,19 की तुलना में अधिक विशिष्ट संकेत के लिए अनुमति देते हैं जो दूर तक लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन के विकास को प्रोत्साहित किया है. TurboFP650, इस प्रणाली में दिखाया फ्लोरोसेंट प्रोटीन, दूर लाल स्थानांतरित कर दिया है और रहने वाले जानवरों में इमेजिंग फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ जुड़े मुद्दों के कई काबू.

HESCs से व्युत्पन्न एन.के. कोशिकाओं के विकास और विस्तार के लिए इस विधि हमें आगे इन विट्रो में और बेहतर मौजूदा एन.के. सेल दत्तक उपचार में सुधार के एन.के. सेल समारोह और नैदानिक ​​महत्वपूर्ण समझ लेना जरूरी है, जो इन विवो में hESC व्युत्पन्न एन.के. कोशिकाओं को चिह्नित करने के लिए अनुमति दी गई है. यह भी व्युत्पत्ति और iPSC व्युत्पन्न एन.के. कोशिकाओं का विस्तार करने के लिए उत्तरदायी है. दोहरी फ्लोरोसेंट और bioluminescent इमेजिंग योजना हम यहाँ से पता चला है विरोधी ट्यूमर मॉडल की तुलना में अन्य प्रणालियों के लिए मोटे तौर पर लागू है.

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Protocol

1. स्पिन ईबी संस्कृति के लिए TrypLE में hESCs या iPSCs आदत डाल

  1. collagenase-passaged संस्कृतियों से ते / आईपीएस कालोनियों अपेक्षाकृत छोटे हैं तो TrypLE साथ प्रारंभिक हदबंदी सबसे अच्छा काम करता है. / आईपीएस आबादी कोशिकाओं होना चाहिए शुरू ते 4-5 दिन पहले से अब और नहीं पारित कर दिया. TrypLE पारित होने की दीक्षा से पहले 4-5 दिन, कोशिकाओं 4 दिनों के समय में ~ 70% मिला हुआ होना करने की अनुमति देगा एक घनत्व में ES कोशिकाओं से गुजरती हैं. TrypLE-passaged ES कोशिकाओं की संस्कृति के लिए नियमित रूप से ते मीडिया का प्रयोग करें. यहाँ, हम स्थिरतापूर्वक एक luciferase संवाददाता निर्माण (सामग्री तालिका) के साथ संशोधित hESCs के प्रयोग कर रहे हैं. प्रोटोकॉल भी hematopoietic पूर्वपुस्र्ष सेल और एन.के. सेल विकास की तुलना के लिए असंशोधित iPSCs उपयोग कर, iPSCs के साथ काम करता है.
  2. TrypLE पारित होने की दीक्षा से पहले चार दिन, एक सामान्य मार्ग प्रोटोकॉल के बाद, collagenase चतुर्थ के साथ ते / आईपीएस कोशिकाओं से गुजरती हैं. आम तौर पर हम TrypLE साथ पहले पारित होने में 01:01 गुजरती हैं. तदनुसार पहले से ते / आईपीएस कोशिकाओं का विस्तार.
    3. 5 कोशिकाओं / अच्छी तरह से कम 6 अच्छी तरह प्लेटें में TrypLE मार्ग, थाली MEFs की दीक्षा से पहले एक दिन. TrypLE से पहले पारित होने में (मुश्किल से अनुकूलन सेल लाइनों के लिए या कम घने संस्कृतियों के लिए या 2:1) 01:01 गुजरती हैं. इसलिए, आप TrypLE संस्कृति में डाल पर योजना हर ते / आईपीएस प्लेट के लिए 1 MEF थाली तैयार करते हैं.
  3. ध्यान TrypLE हदबंदी के लिए आगे बढ़ने से पहले विभेदित कालोनियों (एक घिरा सीमा कमी या तंतुप्रसू / उपकला विशेषताएं हैं जो उन) बंद उठाओ. विभेदित कोशिकाओं TrypLE बीतने के साथ अपेक्षाकृत आसानी संस्कृति पर ले जा सकते हैं, तो यह आपके प्रारंभ आबादी बहुत साफ है सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है.
  4. कुओं से मीडिया Aspirate और 1.0 मिलीलीटर पूर्व गर्म TrypLE प्रति अच्छी तरह से चुने जोड़ें.
  5. एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 5 मिनट के लिए TrypLE में सेते ते / आईपीएस कोशिकाओं. बाद 5 मिनट, अच्छी तरह से नीचे बंद धीरे पिपेट ES कोशिकाओं.
  6. कुओं से TrypLE सेल निलंबन लीजिए और एक शंक्वाकार ट्यूब को हस्तांतरण. जीई नीचे पिपेट औरntly 2-3 बार सबसे बड़े clumps को तोड़ने के अलावा करने के लिए प्रोत्साहित करने के लिए. कम से कम 1 बराबर मात्रा ते मीडिया और 1 बराबर मात्रा DPBS के साथ TrypLE पतला. TrypLE संस्कृति मीडिया से बुझती है, तो यह थाली से कोशिकाओं को हटाने के बाद मीडिया और DPBS के साथ TrypLE कमजोर करने के लिए महत्वपूर्ण है नहीं है. हम ते मीडिया को बचाने के लिए washes के लिए DPBS + मीडिया का उपयोग करें.
  7. प्रशीतित अपकेंद्रित्र में 5 मिनट (8 डिग्री सेल्सियस) के लिए 1500 rpm पर कोशिकाओं स्पिन.
  8. TrypLE दूर करने के लिए के रूप में ज्यादा तैरनेवाला के रूप में संभव बंद महाप्राण.
  9. 4 मिलीलीटर ते मीडिया प्लस 4 मिलीलीटर DPBS और TrypLE के शेष निशान से छुटकारा पाने के लिए स्पिन दोहराने में Resuspend कोशिकाओं.
  10. चढ़ाना के लिए उचित मात्रा ते मीडिया में सतह पर तैरनेवाला और resuspend बंद महाप्राण.
  11. प्लेट ES कोशिकाओं 01:01 ते मीडिया में कम घनत्व MEFs पर (या 2:1 अगर जरूरत हो).
  12. 24 घंटे के बाद, ताजा ES मीडिया के साथ कोशिकाओं को खिलाओ. सबसे अधिक संभावना संलग्न नहीं किया है कि कई एकल कक्षों की जाएगी. ते मीडिया के साथ दैनिक ES कोशिकाओं फ़ीड.
  13. ताजा MEFs (0.9-1 एक्स 10 पर TrypLE साथ दर्रा (उदाहरण के लिए मंगलवार और शुक्रवार) से ऊपर के रूप में एक ही मूल प्रक्रिया का उपयोग कर. आम तौर पर, आप TrypLE साथ पारित कोशिकाओं को लेने के लिए नहीं होना चाहिए.
  14. पहले कई मार्ग के लिए ऊपर (5-10 पारित होने के लिए), कोशिकाओं 1:1 में गुजर आवश्यकता होगी. यह कोशिकाओं के विस्तार के लिए मुश्किल बना देता है. हमारे अनुभव में, ES कोशिकाओं की दक्षता चढ़ाना 4-5 मार्ग के आसपास नाटकीय रूप से चला जाता है और फिर अंश के भीतर वापस ऊपर आता है. मार्ग 5-7 के बाद, आप अंततः 01:03 01:02 पर कोशिकाओं गुजर शुरू करने में सक्षम हो, और हो सकता है. पारित होने के 20 के अलावा, आप 1:05 या 1:06 पर कोशिकाओं गुजर शुरू करना पड़ सकता है. प्लेट एक उच्च घनत्व पहले 5-10 मार्ग पर ES कोशिकाओं के लिए सुनिश्चित करें. एक बार जब आप एक बात पर आते हैं जहां नीचे कुशलतापूर्वक पर्याप्त वे पारित होने के बाद, आप 1:02 पर गुजर शुरू करने की कोशिश कर सकते हैं, और अंत में या 1:03 पर पारित करने में सक्षम होना चाहिए दो दिनों के भीतर ~ 70% संगम तक पहुँच सकते हैं कि कोशिकाओं की थाली 01:04. iPSCs, विशेष रूप से, पूरी तरह से एक से पहले घनी पर्याप्त passaged अगर नहींdapted, अंतर करने के लिए करते हैं.

2. स्पिन ईबी संस्कृति की स्थापना के लिए स्टॉक समाधान तैयार करें

  1. IMDM में 10% BSA समाधान: 35 मिलीलीटर IMDM (एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार में) में बीएसए की 4 ग्राम निलंबित. बीएसए पूरी तरह से भंग करने के लिए अनुमति देने के लिए 1-2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर बैठने के लिए समाधान की अनुमति दें. 10% की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए IMDM के साथ 40 मिलीलीटर के लिए कुल मात्रा समायोजित करें. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध बीएसए ES कोशिकाओं को साइटोटोक्सिक हो सकता है. समाधान Deionizing cytotoxicity लिए क्षमता को कम कर सकते हैं. , Deionize बीएसए समाधान के 40 मिलीलीटर के लिए ~ 1.3 ग्राम राल मोती जोड़ने और मिश्रण को अच्छी तरह से मिलाने के लिए.
  2. 4 में जगह बीएसए समाधान (राल मोती के साथ) डिग्री सेल्सियस नीले, हरे से (विनिमय क्षमता समाप्त हो गया है कि यह दर्शाता है) पीले रंग के लिए मोती परिवर्तन रंग जब तक.
  3. समाधान विनिमय की सुविधा के लिए हर 20-30 मिनट शेक
  4. प्रत्येक विनिमय 2 घंटा तक लग सकते हैं. विनिमय के पूर्ण होने पर, ट्यूब के नीचे गोली मोतियों से 1000 rpm पर 2 मिनट के लिए समाधान अपकेंद्रित्र.
  5. रंजएक ताजा 50 मिलीलीटर शंक्वाकार में ette बीएसए समाधान, मोती त्याग करने के लिए छोड़ रहा है.
  6. दोहराएँ तीन या अधिक एक्सचेंजों की कुल के लिए 2.2-2.5 कम से कम दो अतिरिक्त समय ले जाता है. पिछले विनिमय के दौरान, मोतियों की क्षमता पूरी तरह से मोती के साथ के बाद भी दो घंटे ऊष्मायन थक नहीं किया जा सकता है.
  7. बीएसए समाधान और किसी भी शेष मोती हटाने बाँझ फिल्टर.
  8. बीएसए समाधान कम से कम 2 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर होना चाहिए.
  9. 5% PVA समाधान: उपाय 100 मिलीलीटर Millipore के एच 2 ओ 125 मिलीलीटर कांच की बोतल में.
  10. पानी के लिए 5 ग्राम PVA में जोड़ें. यह PVA में पूरी तरह से हो जाता है तो पानी के लिए PVA में जोड़ने के लिए महत्वपूर्ण है "गीला." आप PVA के लिए पानी जोड़ने PVA के समाधान में जाने के लिए, यह एक बहुत लंबा समय लगेगा.
  11. PVA के तुरंत भंग नहीं होगा. 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर जगह PVA / पानी के घोल.
  12. 37 में अगली सुबह, जगह PVA / पानी के घोल में 4-8 घंटे के लिए डिग्री सेल्सियस waterbath. PVA के अंत तक ज्यादातर समाधान में होना चाहिएऊष्मायन.
  13. एक अतिरिक्त 24-48 घंटे के लिए वापस 4 डिग्री सेल्सियस में जगह बोतल, या पूरी तरह से जब तक भंग. समाधान थोड़ा चिपचिपा हो सकता है.
  14. PVA समाधान कम से कम 6 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर होना चाहिए.
  15. Linoleic और linolenic एसिड (10,000 एक्स समाधान): 200 प्रूफ इथेनॉल में पतला करने के लिए 1 मिलीग्राम / एमएल. 10 मिलीलीटर इथेनॉल से 10 मिलीलीटर शुद्ध तेल जोड़ें. -20 डिग्री सेल्सियस पर अशेष और दुकान
  16. α-MTG शेयर समाधान: 1 मिलीलीटर IMDM में पतला 13 μl α-MTG.
  17. Ascorbic एसिड 2 फास्फेट समाधान (100X): एक 5 मिलीग्राम / एमएल समाधान करें. 250 मिलीग्राम एस्कॉर्बिक एसिड 2 फॉस्फेट 50 मिलीलीटर बाँझ, ऊतक संस्कृति ग्रेड में एच 2 ओ आसानी से घुल.

3. BPEL मीडिया की सभा (~ 200 मिलीलीटर कुल मात्रा के लिए)

  1. एक PVA-लिपिड मिश्रण (इस चरण फिल्टर हो जायेगा कि मध्यम में अघुलनशील बूंदों बनाने से PVA रोकता है) बनाओ.
  2. 20 से 50 मिलीलीटर IMDM और 20 मिलीलीटर एफ 12 पोषक तत्व मिश्रण जोड़ेंमिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब.
  3. 5% PVA के शेयर की 10 मिलीलीटर जोड़ें, 0.4 मिलीलीटर synthechol, 20 μl लिनोलेनिक एसिड, और 200 मिलीलीटर BPEL मीडिया के लिए 20 μl लिनोलेनिक एसिड. मिश्रण को अच्छी तरह से ट्यूब हिला. अन्य मीडिया घटकों इकट्ठा कर रहे हैं, जबकि अलग निर्धारित करें.
  4. 250 मिलीलीटर Stericup निस्पंदन इकाई के शीर्ष पर शेष सभी मीडिया घटकों जोड़ें. आवश्यक IMDM और एफ 12 संस्करणों का संतुलन (66 मिलीलीटर प्रत्येक), बीएसए, एक MTG, 100X इसके, Glutamax मैं, पेन / Strep, प्रोटीन से मुक्त हाइब्रिडोमा मिश्रण द्वितीय, और एस्कॉर्बिक एसिड जोड़ें. चरण 1 से Stericup के शीर्ष करने PVA-लिपिड मिश्रण जोड़ें. मध्यम फ़िल्टर. मध्यम कम से कम 2 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर होना चाहिए. धोने कदम के लिए पुराने मध्यम का प्रयोग करें.

4. स्टेज में TrypLE-passaged ते प्रकोष्ठों की स्थापना मैं ईबीएस स्पिन

कम घनत्व MEFs (कम से कम 5-7 बार में TrypLE साथ passaged किया गया है यानी ते / आईपीएस कोशिकाओं) पर पारित होने TrypLE के लिए अनुकूलित किया गया है कि ते / आईपीएस कोशिकाओं का उपयोग करें. कोशिकाओं ~ 01:03 पर पारित किया है और 3-4 दिनों में 70-80% मिला हुआ बन जा सकता है, कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए अच्छा होना चाहिए.

  1. दो दिन स्पिन ईबी भेदभाव (दिन -2) स्थापित करने से पहले: उन्हें भेदभाव की स्थापना के दिन पर मिला हुआ 70-80% होने की अनुमति एक घनत्व पर ताजा MEFs पर TrypLE अनुकूलित ते / आईपीएस कोशिकाओं गुजरती हैं. हम आम तौर पर ईबी सेटअप स्पिन से पहले 48 घंटे से गुजरती हैं.
  2. स्पिन ईबी चढ़ाना के लिए तैयार करने के लिए, पिपेट 150 μl बाँझ पानी प्रत्येक 96 अच्छी तरह से थाली में से 36 बाहरी कुओं में वाष्पीकरण कम करने के लिए: स्टेज में स्पिन ईबी सेटअप मैं भेदभाव (0 दिन) के दिन. केवल दौर नीचे, कम लगाव 96 अच्छी तरह से प्लेटों का प्रयोग करें.
  3. ते / आईपीएस कोशिकाओं की संस्कृति मीडिया बंद महाप्राण और 1.0 मिलीलीटर पूर्व गर्म TrypLE प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए चयन करें जोड़ें.
  4. 5 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में जगह प्लेट (37 डिग्री सेल्सियस). धीरे थाली की कोशिकाओं को बंद विंदुक.
  5. एक शंक्वाकार ट्यूब में अलग कोशिकाओं लीजिए और गुच्छों को तोड़ने के अलावा और नीचे विंदुक ऊपर. 1 बराबर मात्रा BPEL मीडिया और कम से कम 1 बराबर मात्रा DPBS के साथ TrypLE पतला.
  6. निकालें सतह पर तैरनेवाला और resuspend5 मिलीलीटर BPEL मीडिया प्लस 5 मिलीलीटर DPBS में कोशिकाओं. स्पिन दोहराएँ.
  7. प्रत्याशित सेल संख्या पर निर्भर करता है, 5-10 मिलीग्राम BPEL मीडिया में सतह पर तैरनेवाला और resuspend कोशिकाओं निकालें. 70 माइक्रोन फिल्टर (बी फाल्कन # 352350) के माध्यम से गुच्छों (जो ईबी गठन के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं) को हटाने के क्रम में शंक्वाकार एक ताजा 50 मिलीलीटर में कोशिकाओं गुजरती हैं.
  8. फ़िल्टर की कोशिकाओं की गणना. एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार और स्पिन में चढ़ाना के लिए इस्तेमाल किया जा विभाज्य कोशिकाओं. चढ़ाना के लिए: 3000 ES कोशिकाओं / अच्छी तरह से, 60 कुओं / प्लेट = 1.8x10 5 ES कोशिकाओं / प्लेट.
  9. Centrifugation के बाद, कोशिकाओं 3x10 4 कोशिकाओं / एमएल (100 μl मात्रा / अच्छी तरह से, 3000 ES कोशिकाओं / अच्छी तरह से) को resuspended करने की आवश्यकता होगी.
  10. BPEL मीडिया की एक मात्रा + कोशिकाओं (इस 6 मिलीग्राम / प्लेट होगा) resuspending के लिए पर्याप्त साइटोकिन्स तैयार. चरण मैं भेदभाव के लिए, हम hematopoietic पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं की व्युत्पत्ति के लिए एससीएफ (40 एनजी / एमएल), BMP4 (20 एनजी / एमएल), और VEGF (20 एनजी / एमएल) का उपयोग करें.
  11. प्लेट 100 μl कोशिकाओं / अच्छी तरह से (= 3000 कोशिकाओं / अच्छी तरह से) prepar के भीतर 60 कुओं में से प्रत्येक मेंएड 96 अच्छी तरह प्लेटें. एक multichannel pipettor और बाँझ गर्त का उपयोग करते समय यह सबसे आसान है. कोशिकाओं के बाहर समझौता करने के लिए एक मौका नहीं है कि इतनी जल्दी गर्त में डालने से पहले pipetting द्वारा कोशिकाओं के मिश्रण और काम करने के लिए सुनिश्चित करें.
  12. ~ कम 4 मिनट 1500 rpm, 8 डिग्री सेल्सियस के लिए प्रशीतित अपकेंद्रित्र में 96 अच्छी तरह प्लेटें स्पिन
  13. अपकेंद्रित्र से 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर प्लेटें ध्यान हस्तांतरण. जितना संभव प्लेटों में खलल न डालें बचें. कोशिकाओं कुएं के तल में वर्दी छर्रों का गठन सुनिश्चित करना है कि प्लेटों की जाँच करें.
  14. ईबीएस एक अधिक टिकाऊ बाहरी परत का गठन किया है जब तक मैं ईबीएस दिन 3-4 भेदभाव के माध्यम से खिलाया या अन्यथा परेशान नहीं होना चाहिए स्पिन स्टेज. ईबीएस 10-12 दिनों के बाद मैं मंच में छोड़ दिया जाएगा, तो हम कभी कभी एक अच्छी तरह से साइटोकिन्स के साथ 50 μl ताजा BPEL मीडिया (पहले हर अच्छी तरह से पुराने मीडिया के 50 μl बाहर ले) के साथ ईबीएस खिलाओ. 24 घंटे के भीतर, कोशिकाओं एक 3 डी ईबी संरचना के रूप में शुरू करना चाहिए, और दिन से 3-5 एक अलग बाहरी परत है, जाना चाहिए और विकास के उद्देश्यों शुरूसिस्टिक संरचनाओं loping.

5. FACS विश्लेषण के लिए अलग कर स्टेज मैं ईबीएस

FACS विश्लेषण के लिए around18 -36 स्पिन ईबी लीजिए. 6 दिन पहले कोशिकाओं का विश्लेषण करते हैं, तो अधिक कुओं पर्याप्त सेल नंबर प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं.

  1. 2% चिकन सीरम के साथ trypsin की आवश्यक मात्रा को तैयार है. 37 में जगह उपयोग करें जब तक डिग्री सेल्सियस waterbath.
  2. 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों के लिए 96 अच्छी तरह प्लेटें से स्पिन ईबीएस और मीडिया स्थानांतरण.
  3. ईबीएस शंक्वाकार ट्यूबों के नीचे के लिए व्यवस्थित करने की अनुमति दें. एक 5 मिलीलीटर विंदुक के साथ, ध्यान से सतह पर तैरनेवाला और एक अलग ट्यूब (यदि आप एक 15 मिलीग्राम या 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में पूल तैरनेवाला के सभी कर सकते हैं) को हस्तांतरण बाहर विंदुक. कुछ hematopoietic कोशिकाओं पहले से ही अलग दिन 9 से 11 के बीच स्पिन ईबी से जारी किया गया है जैसा कि इन कोशिकाओं से युक्त सतह पर तैरनेवाला अत्यधिक trypsinization से बचाता है.
  4. Trypsin में Resuspend ईबीएस + सीरम 2% चिकन: प्रत्येक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब को 3-4 मिलीलीटर. 37 में trypsin के साथ ईबीएस प्लेस डिग्री सेल्सियस wate3-7 मिनट के लिए rbath. हर 1-2 मिनट शेक या धीरे भंवर. पहले timepoints पर (8 दिन पहले), ईबीएस अधिक आसानी से टूट जाएगा और के रूप में छोटे रूप में 3 मिनट लग सकते हैं. बाद में timepoints पर (दिन 8) ईबीएस अलग कर देना करने के लिए समय लग सकता है. हम आम तौर पर 37 में उन्हें अधिक से अधिक 5 मिनट के लिए trypsinize न दें डिग्री सेल्सियस ध्यान दें, इन बार केवल एक गाइड है. किसी विशेष सेल लाइन या ईबी भेदभाव के लिए, यह ईबीएस अलग कर देना करने के लिए कम या ज्यादा समय लग सकता है. बारीकी से हदबंदी की निगरानी. यह बहुत लंबे समय के लिए trypsin में कोशिकाओं को छोड़ने के लिए महत्वपूर्ण नहीं है. यह trypsin केवल कुछ छोटे clumps दिखाई रहना जब हदबंदी के बजाय सभी clumps को खत्म करने की कोशिश को रोकने के लिए बेहतर है.
  5. FBS युक्त मीडिया का कम से कम 1 बराबर मात्रा के साथ trypsin बुझाने. कोशिकाओं (1500 rpm, 5 मिनट, 8 डिग्री सेल्सियस) स्पिन.
  6. (आमतौर पर 3-5 मिलीलीटर) की गणना के लिए मीडिया के एक उचित मात्रा में कोशिकाओं Resuspend.
  7. एक 100 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से फ़िल्टर कोशिकाओं. गिनती के लिए कोशिकाओं का एक विभाज्य निकालें. कोशिकाओं के साथ आगे बढ़ेंमानक प्रयोगशाला FACS के प्रोटोकॉल के लिए.

6. HPSC व्युत्पन्न पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं से एन.के. कोशिकाओं के विकास, विस्तार, और विशेषता

स्पिन ईबीएस hematopoietic पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के एक उच्च प्रतिशत होते हैं, क्योंकि वे सीधे दिन 11 एन.के. सेल संस्कृति को हस्तांतरित किया जा सकता है. स्पिन ईबीएस भक्षण के साथ या बिना 24 अच्छी तरह प्लेटें में स्थानांतरित किया जा सकता है. हम हर हालत में प्राप्त एन.के. कोशिकाओं के बीच फेनोटाइप या समारोह में कोई अंतर नहीं दिखाई है. इसलिए, हम आम तौर पर एन.के. सेल के विकास के लिए एक पूरी तरह से परिभाषित प्रणाली है भक्षण के बिना संस्कृतियों को हस्तांतरण. उपअनुकूलित hematopoietic भेदभाव के साथ एक hESC / iPSC लाइन का उपयोग अगर फीडर परतों का उपयोग 7,8 की सिफारिश की है.

  1. 100 μl, एक 24 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए स्थानांतरण 6 स्पिन ईबीएस के लिए सेट एक multichannel विंदुक का प्रयोग.
  2. स्थानांतरण स्पिन ईबीएस विकिरणित 100,000 (3000 cGy) EL08-1D2 (एक murine embryoni युक्त 24 अच्छी तरह प्लेटें: भक्षण के साथग जिगर सेल लाइन) कोशिकाओं प्रति अच्छी तरह से. फीडरों के बिना: स्थानांतरण ईबीएस सीधे, 24 अच्छी तरह प्लेटें uncoated लिए.
  3. साइटोकिन्स युक्त 400 μl एन.के. भेदभाव मीडिया (आईएल -3, आईएल 15, आईएल -7, एससीएफ, Flt3L, Peprotech से सभी) मे प्रत्येक कुएं में कुल मात्रा ~ 1 मिलीग्राम है.
  4. जगह इनक्यूबेटर में कोशिकाओं और आईएल -3 छोड़कर कदम 6.3 में सभी साइटोकिन्स युक्त एन.के. भेदभाव मीडिया के साथ हर 5-7 दिनों फ़ीड.
  5. एन.के. कोशिकाओं एन.के. सेल भेदभाव संस्कृति के लिए 28 दिन के निम्न हस्तांतरण (चित्रा 2) पर एक परिपक्व फेनोटाइप व्यक्त करेंगे.
  6. एन.के. सेल cytotoxicity परीक्षण करने के लिए, एक 4 घंटा क्रोमियम रिहाई परख 8 प्रदर्शन किया जा सकता है.
  7. कोशिकाओं की संख्या में vivo अध्ययन में के लिए आवश्यक हैं, तो कृत्रिम प्रतिजन कोशिकाओं (aAPCs) के साथ सह संस्कृति एक 2 लॉग या अधिक से अधिक विस्तार उपज कर सकते हैं. एक विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए, यात्रा http://www.jove.com/video/2540/expansion-purification-functional-assessment-human-peripheral-blood 11,12.

7. Immunodeficient चूहों में hESC व्युत्पन्न एन.के. कोशिकाओं और ट्यूमर कोशिकाओं पर नजर रखने के लिए इन विवो फ्लोरोसेंट और bioluminescent इमेजिंग में

हमारे प्रयोगों के सभी में 6 से 8 सप्ताह पुराने हैं कि चूहों. हम nonobese मधुमेह / गंभीर गामा श्रृंखला पीटा (- / - इशारा / SCID / γC) के साथ इम्यूनो संयुक्त उपयोग हम एक साथ ट्यूमर प्रगति (turboFP650 संवाददाता) और vivo में hESC-एन.के. कोशिकाओं कैनेटीक्स (Fluc संवाददाता जनक ES कोशिकाओं में व्यक्त) को ट्रैक करने के लिए एक दोहरी इमेजिंग मॉडल का उपयोग करें. इस इमेजिंग योजना यहाँ दिखाया विरोधी ट्यूमर मॉडल की तुलना में अन्य प्रणालियों के लिए मोटे तौर पर लागू है. IVIS स्पेक्ट्रम (कैलिपर लाइफ साइंसेज) एक साथ vivo में फ्लोरोसेंट और bioluminescent इमेजिंग के लिए इष्टतम है.

  1. ट्यूमर कोशिकाओं के इंजेक्शन के लिए पहले 24 घंटा, चमकाना चूहों (225-250 cGy).
  2. के resuspend वांछित संख्या200 μl Iscove में ट्यूमर कोशिकाओं (1 एक्स 10 6 K562 कोशिकाओं दिखाया जाता है) 20% FBS के साथ पूरक Dulbecco मध्यम (IMDM) संशोधित. ट्यूमर सेल खुराक इस्तेमाल मॉडल के आधार पर अलग किया जा सकता है. TurboFP650 भी गैर प्रकार के ट्यूमर में व्यक्त किया जा सकता है. यह सबसे अच्छा एक भी शारीरिक स्थान के लिए स्थानीय कोशिकाओं के साथ imaged है.
  3. एक 27 या 28 गेज सुई का उपयोग चूहों के ऊपरी बाएँ छाती में subcutaneously ट्यूमर कोशिकाओं इंजेक्षन और 4 दिनों के लिए टीका लगाना करने के लिए अनुमति देते हैं. कोशिकाओं माउस की त्वचा के नीचे एक बुलबुला फार्म चाहिए. चूहे बेहतर इंजेक्शन कल्पना करने के लिए शरीर के इस हिस्से में काटे जा सकते हैं. यह भी विवो फ्लोरोसेंट इमेजिंग में बेहतर करने के लिए क्षेत्र को उजागर करता है. माउस लापरवाह है, जबकि आईपी इंजेक्शन एन.के. कोशिकाओं सर्वश्रेष्ठ कल्पना कर रहे हैं क्योंकि चूहों की छाती के आसपास इंजेक्शन इस मॉडल में इस्तेमाल किया गया था. पीठ या कमर में तेज सहित चमड़े के नीचे प्रसव के वैकल्पिक तरीकों,, पशु के लिए कम तनावपूर्ण रहे हैं और माना जाना चाहिए.
  4. HESC-DERI की वांछित संख्या Resuspend300 μl Iscove में वेद एन.के. कोशिकाओं (10 एक्स 10 6 एन.के. कोशिकाओं दिखाया जाता है) एंटीबायोटिक दवाओं के बिना 20% FBS के साथ पूरक Dulbecco मध्यम (IMDM) संशोधित.
  5. एक 27 या 28 गेज सुई का उपयोग कर प्रत्येक माउस intraperitoneally (आईपी) में hESC व्युत्पन्न एन.के. कोशिकाओं इंजेक्षन. सभी प्रयोगों के लिए, एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कोई ट्यूमर या एन.के. सेल प्रेरणा प्राप्त चूहों में शामिल हैं.
  6. द्वारा पीछा पहले 7 दिनों के लिए हर दिन विवो में एन.के. सेल आबादी को बनाए रखने के लिए, चूहों आईएल -2 की 250 μl आईपी इंजेक्शन (1x10 4 यू / माउस) देने और बाँझ DPBS में आईएल -15 (10 एनजी / माउस) आईएल बलिदान के समय जब तक केवल 2 हर 2 से 3 दिनों के लिए.
  7. Bioluminescent इमेजिंग द्वारा hESC व्युत्पन्न एन.के. कोशिकाओं के engraftment मॉनिटर. 120 μl डी luciferin (150 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ एक माउस आईपी इंजेक्षन. डी luciferin इंजेक्शन के बाद चूहों 10 मिनट छवि.
  8. 0.8 एल / मिनट में बॉक्स में isoflurane के प्रवेश की अनुमति के एक कक्ष का उपयोग चूहों anesthetize. चेंबर में ऑक्सीजन का प्रवाह भी सुनिश्चित करें कि वहाँ.
  9. संवेदनाहृत रखेंउनकी पीठ पर IVIS स्पेक्ट्रम और सुरक्षित चूहों में चूहों टेप या वेल्क्रो का उपयोग करते हुए और 0.5 एल / संज्ञाहरण बनाए रखने के लिए मिनट में बॉक्स में isoflurane के प्रवेश की अनुमति है.
  10. मध्यम, च / 1 को रोकने के लिए और 1 मिनट के लिए छवि प्राप्त करने binning सेट, (4-5 चूहों के लिए डी, 3 या उससे कम चूहों के लिए सी) इमेजिंग मंच सही करने के लिए IVIS मशीन सेट.
  11. TurboFP650 + कोशिकाओं के लिए फ्लोरोसेंट इमेजिंग प्रदर्शन, ब्याज और साथ ही पृष्ठभूमि संकेत की जांच को मापने के एक उत्सर्जन स्कैन स्थापित करने के लिए इमेजिंग विज़ार्ड का उपयोग करें. जांच की सूची से इनपुट एम / पूर्व चुनते हैं, और सही उत्तेजना और उत्सर्जन में दर्ज करें. TurboFP650 लिए, ट्यूमर के संकेत और 570 उत्तेजना और पृष्ठभूमि संकेत को मापने के लिए 640-720 उत्सर्जन को मापने के लिए 605 उत्तेजना और 660-720 उत्सर्जन का उपयोग करें. ऑटो प्रदर्शन सेटिंग्स का उपयोग करें और वांछित इमेजिंग मंच का चयन करें. पूरे इमेजिंग अनुक्रम आम तौर पर प्राप्त करने के लिए 3-5 मिनट का समय लगेगा.
  12. चूहों पूरी तरह इमेजिंग प्रणाली से ले जाने से पहले संज्ञाहरण से उबरने के लिए अनुमति देते हैं. ली का उपयोग कर छवियों का विश्लेषणछवि सॉफ्टवेयर पैकेज संस्करण 4.2 (कैलिपर लाइफ साइंसेज) ving.
  13. कुल प्रवाह (फोटॉनों / सेक) या औसत चमक (फोटॉनों / सेक / 2 सेमी / आर) और एक ही पैमाने (चित्रा 3) के लिए सभी छवियों को स्थापित करने के लिए निर्धारित ब्याज की एक क्षेत्र (आरओआई) का उपयोग bioluminescent संकेत यों. इधर, प्रतिनिधि छवियों प्रत्येक माउस में दोनों सेल आबादी (चित्रा 3) प्रदर्शित करने के लिए उपयोग किया जाता है. हमारी प्रयोगशाला से अन्य अध्ययनों से इस तकनीक को 20 का उपयोग कर colocalization प्रदर्शन किया है. Colocalization समय इस्तेमाल किया प्रयोगात्मक मॉडल के आधार पर अनुकूलित करने की आवश्यकता होगी.
  14. उत्सर्जन स्कैन क्रम से फ्लोरोसेंट संकेत यों "वर्णक्रमीय unmixing" सुविधा के रहने छवि में उपयोग करें. विश्लेषण में शामिल हैं और इस मामले में, ऊपरी छाती में, ब्याज का संकेत युक्त माउस के क्षेत्र पर एक मुखौटा आकर्षित करने के लिए छवियों का चयन करें. अमिश्रित होने के लिए ऊतक autofluorescense और अज्ञात जांच का चयन करें. चूहों अल्फला युक्त भोजन दिया जाता है, खाद्य संकेत भी यू जा सकता हैब्याज और ऊतक autofluorescence की जांच से nmixed.
  15. जिसके परिणामस्वरूप छवियों ऊतक autofluorescence (संकेत स्थित है जहां क्षेत्र सहित) की एक भी वितरण नहीं दिखाते, तो बाधाओं लगातार वितरण और अमिश्रित जा रहा घटकों के बेहतर जुदाई पाने के लिए निर्धारित किया जा सकता है. यह विशिष्ट और विशिष्ट संकेत कम, या करीब पृष्ठभूमि संकेत है जब सॉफ्टवेयर में नहीं कर रहे हैं और कहा कि जांच के लिए अक्सर आवश्यक है. TurboFP650 के लिए उत्सर्जन की अवस्था के निचले सिरे से मेल खाती है जो 640 एनएम के लिए अद्यतन टैब के तहत मिली एक उच्च मार्ग फिल्टर,,, निर्धारित करें. एक कम पास फिल्टर बाधा भी निर्धारित करते हैं, लेकिन यह यहाँ दिखाया इमेजिंग विश्लेषण के लिए अनावश्यक था किया जा सकता है.
  16. दीप्तिमान दक्षता (फोटॉनों / सेक / 2 सेमी / आर) / μW को निर्धारित ब्याज की एक क्षेत्र (आरओआई) का उपयोग unmixed छवि से फ्लोरोसेंट संकेत यों) और एक ही पैमाने (चित्रा 3) के लिए सभी छवियों सेट.
  17. एक वांछित समय बिंदु पर, चूहों एन के लिए बलिदान और विश्लेषण किया जा सकता हैप्रवाह cytometry द्वारा hESC व्युत्पन्न कोशिकाओं की graftment. Intraperitoneally इंजेक्शन एन.के. कोशिकाओं के लिए हम आम तौर पर परिधीय रक्त (चेहरे की नस खून), तिल्ली, और पेरिटोनियम का विश्लेषण. पेरिटोनियल धोने बस पेरिटोनियल झिल्ली को प्रकाश में लाने और एक गिलास पाश्चर पिपेट peritoneal गुहा का उपयोग करने की अनुमति देने के लिए पर्याप्त एक औसत दर्जे का चीरा सिर्फ व्यापक बनाने के द्वारा किया जा सकता है. बाँझ पीबीएस का उपयोग करना, माउस घूर्णन द्वारा पूरी तरह समाधान मिश्रण सुनिश्चित करने peritoneal गुहा के कई washes प्रदर्शन करते हैं. आप एक दृश्य गोली निम्नलिखित centrifugation (धोने का आम तौर पर 5-10 मिलीग्राम) जब तक पर्याप्त तरल पदार्थ ले लीजिए.

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Representative Results

स्पिन ईबी दृष्टिकोण का उपयोग hematopoietic पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं की पीढ़ी hESCs और iPSCs से इष्टतम एन.के. सेल के विकास के लिए अनुमति देता है. जैसा कि चित्र 2 में प्रदर्शन, दिन 11 स्पिन ईबीएस उच्च CD34 व्यक्त पूर्वज कोशिकाओं के प्रतिशत, CD45, CD43, और CD31 के होते हैं. CD34 और CD45 के उच्च स्तर stromal कोशिकाओं छँटाई या समर्थन करने के लिए आवश्यकता के बिना एन.के. शर्तों को सीधा हस्तांतरण की अनुमति देता है. उपअनुकूलित स्पिन ईबी भेदभाव नहीं है, तो यह इस तरह EL08-1D2 रूप stromal कोशिकाओं माध्यमिक एन.के. परिस्थितियों में उपयोग किया जाता है की सिफारिश की है. संस्कृति के 4 हफ्तों के बाद स्पिन ईबीएस एन.के. कोशिकाओं (24 अच्छी तरह से थाली के प्रति अच्छी तरह से लगभग 1-2 x 10 6 कोशिकाओं) की बड़ी संख्या को जन्म दे. संस्कृति भी इस प्रणाली में 7 एन.के. सेल विकास के क्रमिक प्रगति को देखने के लिए पहले समय बिंदुओं पर phenotyped किया जा सकता है. एन.के. कोशिकाओं इसलिए माता - पिता ते / आईपीएस लाइन में संशोधित किया गया और उस रिपोर्टर जीन की अभिव्यक्ति तो पीछा किया जा सकता है बनाए रखने के (चित्रा 3) में एन.के. कोशिकाओं और ट्यूमर कोशिकाओं दोनों के एक साथ इमेजिंग प्रदर्शित करने के लिए IVIS स्पेक्ट्रम का इस्तेमाल किया है. वर्णक्रमीय unmixing सुविधा लिविंग छवि सॉफ्टवेयर में प्रयोग, ऊतक autofluorescence fluorescently लेबल कोशिकाओं से संकेत अनुकूलन करने के लिए घटाया जा सकता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. दोहरी इमेजिंग योजना और विकास के समय. Vivo मॉडल में से एक) योजनाबद्ध. चूहे luciferin साथ आईपी इंजेक्शन, और उचित ऊष्मायन समय अनुसरण कर रहे हैं, जुगनू luciferase + कोशिकाओं bioluminescent संकेत के लिए imaged हैं. HESC-deriv का विकास और परीक्षण के लिए bioluminescent छवि, TurboFP650 + कोशिकाओं से फ्लोरोसेंट संकेत के अधिग्रहण के बाद imaged किया जा सकता है. बी) टाइमलाइनएड एन.के. कोशिकाओं.

चित्रा 2
चित्रा 2. HESCs और iPSCs से व्युत्पन्न स्पिन ईबीएस और एन.के. कोशिकाओं के phenotype. स्पिन ईबी संस्कृति में एक) के बाद 11 दिन, कोशिकाओं प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है. 11 दिन के समय बिंदु CD34 के उच्च प्रतिशत, CD43, CD45, और एन.के. सेल भेदभाव के लिए इष्टतम CD31 व्यक्त कोशिकाओं देता है. बी) एन.के. कोशिकाओं एन.के. सेल संस्कृति के 4 हफ्तों निम्नलिखित प्रवाह का उपयोग कर पाया जा सकता है. लिम्फोसाइट गेट (एफएससी / एसएससी साजिश) के भीतर कोशिकाओं CD56 की अभिव्यक्ति के लिए विश्लेषण कर रहे हैं. CD56 + कोशिकाओं आगे ऐसी CD117 के रूप में मार्कर, CD94, NKp46, या दूसरों के सह अभिव्यक्ति के लिए विश्लेषण किया जा सकता है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .


चित्रा 3. IVIS स्पेक्ट्रम का उपयोग vivo में फ्लोरोसेंट और bioluminescent इमेजिंग. विवो निगरानी में इस प्रोटोकॉल का प्राथमिक उद्देश्य है. इसलिए, चूहों ट्यूमर निकासी के लिए बाहर का पालन नहीं कर रहे हैं. हमारी पिछली रिपोर्ट (200,000 K562 कोशिकाओं का उपयोग करके) कि ट्यूमर निकासी तीन सप्ताह में 7 होता है दर्शाता है. के ए) Bioluminescent इमेजिंग Fluc + hESC व्युत्पन्न एन.के. सेल इंजेक्शन शीर्ष पंक्ति में दिखाया गया है के बाद दिन 0, 7, और 14 एन.के. कोशिकाओं. TurboFP650 के फ्लोरोसेंट इमेजिंग + 0 दिन, 7, और एन.के. सेल इंजेक्शन के बाद 14 K562 कोशिकाओं नीचे पंक्ति में दिखाया गया है. फ्लोरोसेंट छवियों bioluminescent छवि अधिग्रहण के बाद तुरंत हासिल किया गया. बी) के अनुक्रम दिखा ऊतक autofluorescence और turboFP6 से फ्लोरोसेंट संकेत50 + कोशिकाओं, लिविंग छवि सॉफ्टवेयर में वर्णक्रमीय unmixing सुविधा का उपयोग कर उत्पन्न किया. अब तक प्रत्येक छवि में छोड़ दिया पर माउस एक गैर इंजेक्शन नियंत्रण है और केवल पृष्ठभूमि संकेत से पता चलता है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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Discussion

hESCs के विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं का अध्ययन और नैदानिक ​​अनुवाद के लिए उल्लेखनीय संभावित पकड़ के लिए एक आदर्श मंच है. हम hematopoietic पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं को hESC / iPSCs अंतर करने के लिए एक परिभाषित, स्पिन ईबी दृष्टिकोण का उपयोग करें. स्पिन ईबी दृष्टिकोण एन.के. कोशिकाओं को hematopoietic पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं और भेदभाव के अनुरूप व्युत्पत्ति प्राप्त हुए है, फिर भी, भिन्नता अभी भी सेल लाइनों में भेदभाव दक्षता में मौजूद है और अन्य hematopoietic सेल प्रजातियों के उत्पादन के लिए संशोधित करने की आवश्यकता हो सकती है. तुलनीय परिणाम अन्य ईबी या स्ट्रोमल संस्कृति तरीकों में व्युत्पत्ति से प्राप्त किया जा सकता है, इस प्रणाली सीरम मुक्त है और अन्य तरीकों की तुलना में hematopoietic progenitors के उत्पादन के लिए एक अधिक परिभाषित दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है. हम भी नैदानिक ​​अनुवाद के लिए एक प्रमुख चिंता का विषय काबू जो एक इसी तरह फीडर से मुक्त ढंग से इन hematopoietic progenitors से एन.के. कोशिकाओं पाने के मानकीकृत एक कारगर तरीका है. यह भी एन.के. सेल शहरी अध्ययन करने के लिए एक परिभाषित प्रणाली प्रदान करता हैइन विट्रो में टी. पूर्व नैदानिक ​​व्यापक, ऐसे एन.के. कोशिकाओं के रूप में hematopoietic कोशिकाओं, के vivo लक्षण वर्णन में, विशेष रूप से चिकित्सीय परीक्षण के लिए इन प्रयोगात्मक व्युत्पन्न प्रकार की कोशिकाओं और उनके कार्यान्वयन को परिभाषित करने के लिए भी आवश्यक है.

इमेजिंग और माइक्रोस्कोपी तकनीक के क्षेत्र में अग्रिम bioluminescent और फ्लोरोसेंट संवाददाताओं 15-17,19,21 व्यक्त कोशिकाओं के vivo निगरानी में लंबे समय तक और गैर इनवेसिव सक्षम है. सबसे उल्लेखनीय इसके प्रारंभिक लक्षण वर्णन के बाद से विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया गया है जो जुगनू luciferase निर्माण, का इस्तेमाल होता है. इस vivo इमेजिंग में के लिए एक आदर्श पत्रकार है, लेकिन केवल एक ही सेल की आबादी की निगरानी करने के लिए सीमित है. एक दोहरे संवाददाता प्रणाली का सबसे बड़ा लाभ यह है कि दो अलग सेल आबादी के बीच बातचीत का पालन करने की क्षमता है. हालांकि, कुछ पत्रकारों को दोनों vivo में छवि के लिए आसान कर रहे हैं और ऊपर पर्याप्त और quantifiable संकेत है कि विकसित किया गया हैपृष्ठभूमि.

TurboFP650, हमारे दोहरे इमेजिंग योजना में इस्तेमाल किया फ्लोरोसेंट प्रोटीन, पृष्ठभूमि autofluorescence से अलग संकेत देता है, जो दूर तक लाल स्थानांतरित कर दिया है. हालांकि, लिविंग छवि सॉफ्टवेयर (कैलिपर लाइफ साइंसेज) में वर्णक्रमीय unmixing तरीकों का उपयोग हमारी प्रणाली में पृष्ठभूमि अनुपात करने के लिए संकेत को अधिकतम करने के लिए आवश्यक था. फ्लोरोसेंट प्रोटीन इमेजिंग के आंतरिक चुनौतियों के साथ मदद करने में सक्षम रहते हैं छवि सॉफ्टवेयर में कई विशेषताएं हैं. फिर भी, संकेत अंतर्वेधन एक चुनौती बनी हुई है. ट्यूमर कोशिकाओं आईपी इंजेक्शन थे तो मामला होगा के रूप में प्रणाली, छोटे सेल आबादी या छितरी हुई कोशिकाओं की इमेजिंग की इमेजिंग के लिए आगे अनुकूलन की जरूरत है. हालांकि, फ्लोरोसेंट इमेजिंग की स्थिरता और आसानी इसके उपयोग एक दोहरी इमेजिंग मॉडल में उपयोग करने के लिए एक आदर्श मंच बना देता है. जानवरों कम समय के लिए संज्ञाहरण के तहत कर रहे हैं और सबसे दोहरे luciferase सिस्टम के साथ के रूप में एक दूसरे सब्सट्रेट देने की कोई जरूरत नहीं है.

इस विधिव्युत्पत्ति के vivo में विस्तार, और दोहरे इमेजिंग hESC व्युत्पन्न या iPSC व्युत्पन्न एन.के. कोशिकाओं और वर्तमान एन.के. सेल दत्तक उपचार में सुधार के लिए आवश्यक है जो उनके मूल्यांकन के उत्पादन के लिए एक सुसंगत दृष्टिकोण प्रदान करता है. दोहरी फ्लोरोसेंट और bioluminescent इमेजिंग मॉडल हम पता चला है विरोधी ट्यूमर मॉडल की तुलना में अन्य दो अलग सेल आबादी की लंबी अवधि के अध्ययन के लिए मोटे तौर पर लागू है.

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Disclosures

इस काम एनआईएच / NHLBI R01-HL77923 (dsk) द्वारा और एनआईएच MSTP अनुदान T32 GM008244 (डाक), स्टेम सेल बायोलॉजी प्रशिक्षण अनुदान T32 (डाक) (T32HD060536), अंडर ग्रेजुएट रिसर्च अवसर कार्यक्रम (UROP) मिनेसोटा अनुदान, विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया (AMB), मिनेसोटा कैंसर सेंटर के विश्वविद्यालय, और विलियम एल और ब्लांश ह्यूजेस फाउंडेशन की ल्यूकेमिया रिसर्च फंड.

Acknowledgments

लेखकों हमारी प्रयोगशाला के भीतर स्पिन ईबी प्रोटोकॉल की दीक्षा के लिए मेलिंडा Hexum धन्यवाद देना चाहूंगा. हम लौरा ई. Bendzick, माइकल Lepley, और इस काम के साथ उनकी तकनीकी सहायता के लिए Zhenya नी सहित प्रयोगशाला के अन्य सदस्यों को धन्यवाद देना चाहूंगा. लेखकों को भी अपने विशेषज्ञ तकनीकी सलाह के लिए कैलिपर लाइफ साइंसेज में ब्रैड टेलर को धन्यवाद देना चाहूंगा.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
Media
BPEL media for Spin EB generation
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) Fisher Scientific SH3022801
F-12 Nutrient Mixture w/ Glutamax I Invitrogen 31765035
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A3311 Commercially available BSA can be cytotoxic to ES cells. Deionizing the solution can reduce the potential for cytotoxicity.
Poly(vinyl alcohol) Sigma-Aldrich P8136
Linoleic Acid Sigma-Aldrich L1012
Linolenic Acid Sigma-Aldrich L2376
Synthechol 500X solution Sigma-Aldrich S5442
a-monothioglycerol (a-MTG) Sigma-Aldrich S5442
Protein-free hybridoma mix II Invitrogen 12040077
Ascorbic Acid 2-phosphate Sigma-Aldrich A8960
Glutamax I Invitrogen 35050061
Insulin, Transferrin, Selenium 100X solution (ITS) Invitrogen 41400-045
Pen-Strep Invitrogen 15140122
NK Differentiation Media
Dubecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Invitrogen 11965-118
F-12 Media Invitrogen CX30315
15% Human AB serum Valley Biomed HP1022HI
5 ng/ml Sodium Selenite Sigma-Aldrich S5261
50 uM ethanolamine Sigma-Aldrich E9508
20 ng/ml ascorbic acid Sigma-Aldrich A8960
25 uM 2-mercapt–thanol (BME) Gibco 21985
2 mM L-glutamine Gibco CX30310
1% Pen-Strep Invitrogen 15140122
Cytokines
(all cytokines used fresh from frozen aliquots)
SCF PeproTech, Inc. 300-07 40 ng/ml in BPEL media; 20 ng/ml in NK medium). As noted by the Elefanty protocol, and as we discovered with a bad lot of BMP4, there can be lot differences with cytokines in regards to hematopoietic differentiation.Especially if buying cytokines in bulk, obtain a sample of the lot to test prior to purchase. Compare head-to-head with old lot.
rhBMP-4 R & D Systems 314-BP 20 ng/ml in BPEL media
rhVEGF R&D Systems 293-VE 20 ng/ml in BPEL media
IL-2 PeproTech, Inc. 200-02 1 x 105 U/ml given to mice after NK cell injection; 50 U/ml used in NK cell expansion protocol
IL-15 PeproTech, Inc. 200-15 10 ng/ml given to mice after NK cell injection (first 7 days only)
IL-3 PeproTech, Inc. 200-03 5 ng/ml in NK media
IL-7 PeproTech, Inc. 200-07 20 ng/ml in NK media
Flt-3-Ligand PeproTech, Inc. 300-19 10 ng/ml in NK media
In vivo Imaging
D-Luciferin Sodium Salt Gold BioTechnology Lucna-500
TurboFP650 plasmid Evrogen, Moscow, Russia FP731 Subcloned into a Sleeping Beauty transposon based plasmid driven by the mCAGs promoter. Cells were then sorted on their expression of turboFP650 by FACS. Cells and plasmids can be obtained from our lab.
Equipment
IVIS Spectrum Imaging System Caliper Life Sciences
Cells
Membrane bound IL-21 expressing artificial antigen presenting cells MD Anderson, Houston, TX contact: Dean A. Lee. http://www.jove.com/video/2540/expansion-purification-functional-assessment-human-peripheral-blood
Firefly luciferase expressing hESCs University of Minnesota, Minneapolis, MN contact: Dan S. Kaufman . H9 cells modified with a Sleeping Beauty transposon based method (references 13 and 14). Expression of firefly luciferase is driven by the mCAGGS promoter. Following the firefly luciferase gene is an IRES element at the 5' end of a GFP:zeocin fusion construct.
TurboFP650 expressing K562 cells University of Minnesota, Minneapolis, MN contact: Dan S. Kaufman. Description under plasmid comments section

Materials Table.

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References

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विकास, विस्तार, और<em&gt; विवो में</em&gt; मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESCs) से मानव एन.के. कोशिकाओं की निगरानी और और प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSCs)
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Bock, A. M., Knorr, D., Kaufman, D.… More

Bock, A. M., Knorr, D., Kaufman, D. S. Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs). J. Vis. Exp. (74), e50337, doi:10.3791/50337 (2013).

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