Summary
Denne protokollen beskriver utviklingen, utvidelser og in vivo avbildning av NK-celler avledet fra hESCs og iPSCs.
Abstract
Vi presenterer en metode for å utlede natural killer (NK) celler fra udifferensiert hESCs og iPSCs ved hjelp av en mater-fri tilnærming. Denne fremgangsmåte gir opphav til høye nivåer av NK-celler etter 4 ukers kultur og kan gjennomgå ytterligere to-log utvidelse med kunstige antigenpresenterende celler. hESC-og iPSC-derived NK-celler utviklet i dette systemet har en moden fenotype og funksjon. Fremstillingen av et stort antall genetisk modifiserbare NK-celler er anvendelig for både enkle mekanistiske så vel som anti-tumor-studier. Ekspresjon av ildflue luciferase i hESC-avledede NK-celler tillater en ikke-invasiv metode for å følge NK-celle innpodingen, distribusjon og funksjon. Vi beskriver også en dual avbildning-ordning som gjør det mulig separat overvåking av to forskjellige cellepopulasjoner til mer utpreget karakterisere deres interaksjoner in vivo. Denne metoden for avledning, ekspansjon, og dual in vivo avbildning gir en pålitelig metode for å fremstille NK-celler og deres evaluasjon som er nødvendig for å forbedre dagens NK-celle adoptive terapi.
Introduction
Humane embryonale stamceller (hESCs) og induserte pluripotente stamceller (iPSCs) er udifferensierte, pluripotente celler i stand til ubegrenset selvfornyelse og multi-avstamning differensiering. hESCs har blitt differensiert i modne og funksjonelle undergrupper av hver bakterie lag, herunder celler av hematopoietisk system 1-3. Natural killer (NK) celler er lymfocytter i det medfødte immunsystemet som kan utledes fra hESCs ved dannelsen av embryoid organer (EBS) 4,5 eller co-kultur med stromal cellelinjer 1,2,6-8. NK-celler har anti-viral og anti-tumor egenskaper, og har potensial for å være effektive mot et bredt spekter av maligniteter, ettersom de ikke krever forutgående antigenstimulering å utføre sine effektorfunksjoner. Dermed hESC-avledet NK-celler er en attraktiv kilde til celler for immunterapi. I tillegg gir avledning av NK-celler fra hESCs en genetisk mottagelig for å studere normal utvikling <em> in vitro.
Fordi de gir en genetisk medgjørlig system, kan hESC-avledet NK-celler bli eksperimentelt modifisert for å uttrykke og fluorescerende bioluminescent reportere som gir en optimal modell for å studere NK-celle effektor funksjoner in vitro og in vivo. hESC avledede, NK-celler innehar aktivitet mot et spekter av mål inkludert 9 HIV, leukemi (K562) og andre typer kreft 7,8. Imidlertid er evnen til effektivt utlede nok NK-celler i stand til å behandle pasienter forblir en viktig hindring for klinisk oversettelse og er, i mindre grad, en begrensning for utstrakt prekliniske in vivo studier av NK-celle utviklingen og anti-kreft-funksjoner. Her bruker vi en spin EB tilnærming til utlede blodkreft stamceller fra hESCs 4,5,10. Etter 11 dager spin EBS overføres til NK cellekultur med eller uten feeders i 28 dager. Etter 4 uker i NK celle kulturmedium, NK-celler er transferred til ko-kulturen med K562-celler til å uttrykke modifiserte membran-bundet interleukin 21 (IL-21), som tjener som kunstige antigen-presenterende celler (aAPCs). Tilpasning en protokoll for utvidelse av perifert blod NK-celler ved hjelp av disse kunstige APC 11,12, er vi i stand til å utvide NK-celler 2-logger og samtidig beholde en moden fenotype og cytotoksiske evner.
Denne prosessen med utvikling og ekspansjon gir tilstrekkelige hESC-avledet NK-celler for omfattende in vivo karakterisering. For in vivo studier, er vi i stand til ikke-invasiv overvåke lang sikt engraftment og kinetikk av injisert ildflue luciferase uttrykke (Fluc +), hESC-avledet NK-celler ved hjelp Bioluminescens bildebehandling. Videre er vi i stand til å følge NK celle interaksjoner med kreftceller ved hjelp av en dobbel, selvlysende eller fluoriserende bildebehandling ordningen. En tidligere studie av vår gruppe brukte Bioluminescens bildebehandling i en anti-tumor modell å følge tumor progresjon og cleArance av svingninger + K562 celler in vivo 7. Nå, ved å konstruere våre hESCs å uttrykke ildflue luciferase 13,14 kan vi følge fordelingen og trafficking av NK-celler til K562 kreftceller som uttrykker den nylig preget fluorescerende protein, turboFP650 15. Vi har valgt denne dual reporter system for å følge samtidig de to cellepopulasjoner in vivo (figur 1). Mest dual bildebehandling modeller har vært dual-luciferase systemer, men disse systemene kan være teknisk utfordrende på grunn av levering krav coelenterazine, underlaget kreves for uttrykk for de fleste Renilla og Gaussia luciferase reportere 16-18. Fluorescerende reportere har tillatt enkel overvåking av mange cellelinjer og konstruerer in vitro, men har hatt begrenset suksess for in vivo avbildning på grunn av overlappingen mellom vev og pels autofluorescens og emisjonsspektra av mange commonly brukt fluorescerende reportere inkludert GFP, DsRed, og TdTomato 15,19. Denne bekymringen har oppmuntret utviklingen av langt-røde fluoriserende proteiner, som gir mulighet for bedre vev penetrans og høyere spesifikk signal i forhold til bakgrunnen 15,19. TurboFP650, den fluorescerende protein vist i dette systemet, er langt-rød forskjøvet og overvinner mange av de problemene som er involvert med bildebehandling fluorescerende proteiner i levende dyr.
Denne fremgangsmåte for å utvikle og bygge NK-celler avledet fra hESCs har tillatt oss å ytterligere karakterisere hESC-avledet NK-celler in vitro og in vivo, noe som er nødvendig for å få en bedre forståelse NK-celle-funksjon og klinisk viktig for å forbedre dagens NK-celle adoptive terapi. Det er også mottagelig for avledning og utvidelse av iPSC-avledede NK-celler. Den doble fluorescerende og bioluminescent avbildning ordningen er bredt anvendelig på andre systemer enn det anti-tumor-modellen har vi vist her.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Tilpasning hESCs eller iPSCs i TrypLE for Spin EB Cultures
- Den innledende dissosiasjon med TrypLE fungerer best hvis de ES / IPS kolonier fra collagenase-passaged kulturer er relativt liten. Den starter ES / IPS populasjoner bør være celler gått lenger enn 4-5 dager tidligere. 4-5 dager før initiering av TrypLE passasje, passere ES-celler ved en tetthet som vil tillate cellene å være ~ 70% sammenflytende i 4 dager tid. Bruk vanlige ES media for kultur TrypLE-passaged ES-celler. Her bruker vi hESCs stabilt modifisert med en luciferase reporter konstruksjon (Materialer Table). Protokollen fungerer også med iPSCs, ved hjelp av umodifiserte iPSCs for sammenligning av blodkreft stamceller og NK celle utvikling.
- Fire dager før oppstart av TrypLE passasje, passerer ES / iPS celler med collagenase IV, etter en normal passasje protokollen. Vi vanligvis passere 01:01 i første passasje med TrypLE. Utvid ES / iPS celler tilsvarende forhånd.
- Å plukke ned differensierte kolonier (de som mangler en omskrevet grensen eller har fibroblastisk / epitel egenskaper) før du går videre til TrypLE dissosiasjon. Differensierte cellene kan ta over kulturen relativt lett med TrypLE passasje, så det er viktig å sørge for at du starter befolkningen er veldig rent.
- Sug media fra brønnene og tilsett 1,0 ml forvarmet TrypLE Velg per brønn.
- Inkuber ES / iPS celler i TrypLE for 5 min i en 37 ° C inkubator. Etter 5 min, forsiktig pipette ES-celler av bunnen av brønnen.
- Samle TrypLE celle suspensjon fra brønner og overføre til en konisk tube. Pipette opp og ned gently 2-3 ganger for å oppmuntre de største klumpene å bryte fra hverandre. Fortynne TrypLE med minst en tilsvarende volum ES media og en tilsvarende volum DPBS. TrypLE ikke inaktiveres av dyrkningsmedier, så det er viktig å fortynne TrypLE med DPBS medier og etter fjerning av cellene fra platen. Vi bruker DPBS + media for vask for å spare ES media.
- Spinn ned cellene ved 1500 rpm i 5 min i nedkjølt sentrifuge (8 ° C).
- Sug av så mye av supernatanten som mulig for å fjerne TrypLE.
- Resuspender celler i 4 ml ES media pluss 4 ml DPBS og gjenta spin å bli kvitt rester av TrypLE.
- Sug av supernatanten og resuspender i passende volum ES medier for platekledning.
- Plate ES-celler 01:01 (eller 02:01 hvis nødvendig) på low-density MEFs i ES media.
- Etter 24 timer, mate celler med friske ES media. Det vil mest sannsynlig være mange enkeltceller som ikke fester. Mate ES-celler daglig med ES media.
- Passere med TrypLE på fersk MEFs (0,9 til 1 x 10
- For de første passasjene (opptil passasje 5-10), vil cellene krever passerer lik 1:1. Dette gjør ekspansjon av celler vanskelig. I vår erfaring, Plating effektiviteten av ES-celler faller dramatisk rundt passasjer 4-5 og deretter kommer opp igjen innen et par passasjer. Etter passasjer 5-7, kan du være i stand til å begynne passerer cellene på 01:02, og til slutt, 01:03. Utover passasje 20, må du kanskje starte passerer cellene ved 1:05 eller 1:06. Sørg for å plate på ES-celler på en høy tetthet av de første 5-10 passasjer. Når du kommer til et punkt hvor cellene plate ned effektivt nok til at de kan nå ~ 70% samløpet innen to dager etter passering, kan du prøve å starte passerer på 01:02, og til slutt skal kunne passere på 1:03 eller 01:04. iPSCs, spesielt hvis ikke passaged tett nok før fullt endapted, pleier å differensiere.
2. Forbered Stock Solutions for oppsett Spin EB kulturer
- 10% BSA-løsning i IMDM: Suspender 4 g av BSA i 35 ml IMDM (i en 50 ml konisk). Tillat løsningen å sitte ved romtemperatur i 1-2 timer for å tillate BSA for å oppløse fullstendig. Juster totalt volum til 40 ml med IMDM for å få slutt-konsentrasjon på 10%. Kommersielt tilgjengelig BSA kan være cytotoksisk til ES-celler. Deionizing løsningen kan redusere potensialet for cytotoksisitet. Å deionize, legg ~ 1,3 g harpiks perler til 40 ml BSA løsning og rist godt å blande.
- Sted BSA løsning (med harpiks perler) ved 4 ° C inntil perler skifter farge fra blå-grønt til gult (som viser at utvekslingskapasitet er oppbrukt).
- Riste løsningen hver 20-30 min å lette utvekslingen
- Hver utveksling kan ta opptil to timer. Når utvekslingen er fullstendig, sentrifugeres løsningen i 2 minutter ved 1000 rpm for å pelletere perler ved bunnen av røret.
- Pipette BSA-løsning inn i en frisk 50 ml konisk, slik at de lettvekts kom blir forkastet.
- Gjenta trinn 2.2 til 2.5 i det minste ytterligere to ganger for totalt tre eller flere utvekslinger. Under den siste utveksling, kan kapasiteten av perlene ikke fullt ut bli uttømt selv etter to timers inkubering med perlene.
- Steril filter BSA løsning og fjerne eventuelle gjenværende perler.
- BSA-oppløsningen må være stabilt ved 4 ° C i minst 2 måneder.
- 5% PVA-løsning: Mål 100 ml Millipore H 2 O til 125 ml glassflaske.
- Tilsett 5 g PVA til vannet. Det er viktig å legge PVA til vannet, slik at den blir fullt ut PVA "våt". Hvis du legger vannet til PVA, vil det ta svært lang tid for PVA å gå inn i løsningen.
- PVA vil ikke oppløses umiddelbart. Sted PVA / vann-oppløsning ved 4 ° C over natten.
- Neste morgen, sted PVA / vann-oppløsning i 37 ° C vannbad i 4-8 timer. PVA bør være stort sett i løsning ved slutten avinkubasjon.
- Plasser flasken tilbake i 4 ° C i ytterligere 24-48 timer, eller til den er helt oppløst. Løsningen kan være litt tyktflytende.
- PVA-løsninger bør være stabilt ved 4 ° C i minst 6 uker.
- Linolensyre og linolensyre syrer (10000 X-løsninger): Fortynn til 1 mg / ml i 200-proof etanol. Tilsett 10 ml ren olje til 10 ml etanol. Delmengde og oppbevar ved -20 ° C.
- α-MTG stamløsning: Fortynn 13 ul α-MTG i 1 ml IMDM.
- Askorbinsyre 2-Phosphate løsning (100X): Lag en 5 mg / ml. 250 mg askorbinsyre 2-fosfat i 50 ml sterilt, vev-kultur klasse H 2 O. Lettløselig.
3. Montering av BPEL Media (for ~ 200 ml Total Volume)
- Lag en PVA-lipider blanding (dette trinnet hindrer PVA fra forming uløselige dråper i det mediet som ville bli filtrert ut).
- Tilsett 20 ml IMDM og 20 ml F-12 næringsmedium blandingen til 50ml konisk tube.
- Tilsett 10 ml av 5% PVA lager, 0,4 ml synthechol, 20 ul linolensyre, og 20 ul linolsyre i 200 ml BPEL medier. Rist rør godt å blande. Sett til side mens andre medier komponenter er montert.
- Legg alle gjenværende medier komponenter til toppen av 250 ml Stericup filtrering enhet. Legg balansen av ønskede IMDM, og F-12 volumer (66 ml hver gang), BSA, en MTG-, 100X ITS, Glutamax I, Pen / Strep, proteinfritt hybridom blanding II, og askorbinsyre. Tilsett PVA-lipider blandingen fra trinn 1, til toppen av Stericup. Filtrere mediet. Medium må være stabilt ved 4 ° C i minst 2 uker. Bruk gamle medium for vask trinn.
4. Sette opp TrypLE-passaged ES-celler i Stage jeg Spin EBS
Bruk ES / iPS celler som har blitt tilpasset TrypLE passasje på lavere tetthet MEFs (dvs. ES / iPS celler som har blitt passaged med TrypLE minst 5-7 ganger). Hvis cellene kan bli vedtatt på ~ 1:03 og bli 70-80% konfluent i 3-4 dager, Bør cellene være bra å bruke.
- To dager før du setter opp Spin EB differensiering (dag -2): Pass TrypLE-tilpassede ES / iPS celler på fersk MEFs med en tetthet som tillater dem å være 70-80% konfluent på dagen for differensiering oppsett. Vi vanligvis passere 48 timer før Spin EB oppsett.
- Day of Spin EB Setup inn Stage I Differensiering (dag 0): For å forberede Spin EB platekledning, pipette 150 mL sterilt vann inn i de 36 ytterste brønner for hver 96-brønners plate for å minimere fordampning. Bruk round-bottom, lave vedlegg 96 brønners plater bare.
- Aspirer kultur media ut av ES / iPS-celler og legg 1,0 ml forvarmet TrypLE Velg til hver brønn.
- Plasser platene i inkubator (37 ° C) i 5 min. Forsiktig pipette celler ut av platen.
- Samle dissosiert celler i en konisk tube og pipette opp og ned for å bryte fra hverandre klumper. Fortynne TrypLE med en tilsvarende volum BPEL media og minst en tilsvarende volum DPBS.
- Fjern supernatanten og resuspenderceller i 5 ml BPEL media pluss 5 ml DPBS. Gjenta spinn.
- Fjern supernatanten og resuspender celler i 5-10 ml BPEL media, avhengig av forventet celle nummer. Passere gjennom cellene 70 mikrometer filter (BD Falcon # 352350) i en frisk 50 ml konisk for å fjerne klumper (som kan interferere med dannelsen EB).
- Telle filtrert celler. Alikvot celler som skal brukes for plating i et 50 ml konisk og spinn. For platekledning: 3000 ES celler / brønn, 60 brønner / plate = 1.8x10 5 ES celler / plate.
- Etter sentrifugering blir cellene må resuspendert til 4 3x10 celler / ml (100 pl volum / brønn, 3000 ES celler / brønn).
- Forbered et volum på BPEL media + cytokiner tilstrekkelig for resuspending cellene (dette vil være 6 ml / plate). For trinn I differensiering, bruker vi SCF (40 ng / ml), BMP4 (20 ng / ml), og VEGF (20 ng / ml) for avledning av hematopoetiske stamceller.
- Plate 100 ul celler / brønn (= 3000 celler / brønn) i hver av de indre 60 brønnene i prepared 96-brønners plater. Dette er enklest når du bruker en multikanalpipette og sterile trau. Pass på å blande celler ved pipettering før du setter i trau og jobbe raskt slik at cellene ikke har en sjanse til å synke ned.
- Spinn 96-brønners plater i nedkjølt sentrifuger i 4 min på ~ 1500 rpm, 8 ° C.
- Nøye overføre platene fra sentrifuge til 37 ° C inkubator. Unngå å forstyrre platene så mye som mulig. Kontroller platene for å sikre at cellene dannet ensartede pellets i bunnen av brønnene.
- Stage jeg spinne EBS bør ikke mates eller på annen måte forstyrret gjennom dagene 3-4 differensiering til EBS har dannet et mer holdbart ytre lag. Hvis EBS vil bli igjen i stadium I utover 10-12 dager, vi noen ganger mate EBS med 50 mL frisk BPEL media med cytokiner til hver brønn (først ta ut 50 mL av gamle medier fra hver brønn). Innen 24 timer, bør cellene begynner å danne en 3-D EB struktur, og ved dag 3-5 bør ha en distinkt ytre lag, og start utvikloping cystisk strukturer.
5. Dissociating Stage I EBS for FACS analyse
Samle around18-36 spin EB for FACS analyse. Hvis analysere cellene før dag seks, flere brønner for å oppnå tilstrekkelig celle tall.
- Forbered nødvendige volum av trypsin med 2% kylling serum. Plass i 37 ° C vannbad før bruk.
- Overfør spin EBS og media fra 96-brønners plater til 15 ml koniske rør.
- Tillate EBS å bosette til bunnen av koniske rør. Med en 5 ml pipette, pipetteres forsiktig ut av supernatanten og overføring til et separat rør (dere kan pool alt av supernatanten til en 15 ml eller 50 ml konisk rør). Som noen hematopoetiske celler allerede har blitt løst fra sentrifugering EB mellom dag 9 og 11, separering av supernatant som inneholder disse cellene hindrer overdreven trypsinering.
- Resuspender EBS i trypsin + 2% kylling serum: 3-4 ml til hver 15 ml konisk tube. Plasser EBS med trypsin i 37 ° C waterbath for 3-7 min. Rist eller forsiktig vortex hvert 1-2 min. På tidligere tidspunkter (før dag 8), vil EBS bryte fra hverandre lettere og kan ta så lite som 3 min. På senere tidspunkter (dag 8 +) på EBS kan ta lengre tid å distansere. Vi vanligvis ikke la dem trypsinize for mer enn 5 minutter ved 37 ° C. Merk, disse tider er kun en guide. For noen bestemt cellelinje eller EB differensiering, kan det ta mer eller mindre tid til å distansere EBS. Følge nøye med dissosiasjon. Det er viktig ikke å la cellene i trypsin for lenge. Det er bedre å stoppe trypsin dissosiasjon når bare et par små klumper være synlig fremfor å forsøke å eliminere alle klumper.
- Quench trypsin med minst ett like stort volum av FBS-holdige medier. Spinn ned cellene (1500 opm, 5 min, 8 ° C).
- Resuspender cellene i et passende volum av mediet for telling (vanligvis 3-5 ml).
- Filter cellene gjennom en 100 mikrometer celle sil. Ta en porsjon av cellene for telling. Fortsett med cellertil standard lab FACS protokoller.
6. Utvikling, utvidelse, og karakterisering av NK-celler fra hPSC-avledet stamceller
Fordi spin EBS inneholde en høy andel av hematopoetiske stamceller, kan de overføres direkte til NK-celle kultur på 11. dag. Spin EBS kan overføres til 24 brønners plater med eller uten feeders. Vi har ikke vist noen forskjell i fenotype eller funksjon mellom NK-celler avledet i hver tilstand. Derfor har vi generelt overføre til kulturer uten forer til å ha et fullstendig definert system for NK-celle utvikling. Hvis du bruker en hESC / iPSC tråd med suboptimal blodkreft differensiering bruk av mater lag anbefales 7,8.
- Ved hjelp av en multikanal pipette satt til 100 ul, 6 overføring spin EBS til hver brønn av en 24 brønns plate.
- Med Matere: transfer spin EBS til 24-brønners plater som inneholder 100 000 bestrålt (3000 CGY) EL08-1D2 (a murine embryonic leveren cellelinje) celler per brønn. Uten feeders: transfer EBS direkte til ubestrøket, 24 brønners plater.
- Legg 400 mL NK differensiering medier som inneholder cytokiner (IL-3, IL-15, IL-7, SCF, Flt3L, alt fra Peprotech) slik at det totale volum i hver brønn er ~ 1 ml.
- Plasser cellene i kuvøse og fôr hver 5-7 dager med NK differensiering media inneholder alle cytokiner i trinn 6.3, bortsett IL-3.
- NK-celler vil uttrykke en moden fenotype på dag 28 som følge av overgang til NK celledifferensiering kultur (figur 2).
- For å teste NK celle cytotoksisitet, kan en fire timers krom utgivelsen analysen utføres åtte.
- Hvis et stort antall celler er nødvendig for in vivo-studier, kan ko-kultur med kunstige antigen-presenterende celler (aAPCs) gir et 2-logg eller større utvidelse. For en detaljert protokoll, besøk http://www.jove.com/video/2540/expansion-purification-functional-assessment-human-peripheral-blood 11,12.
7. In vivo Fluorescent og Bioluminescent Imaging å overvåke hESC-avledet NK-celler og kreftceller i immunodeficient Mus
Vi bruker nonobese diabetiker / alvorlig kombinert immunsvikt med gamma-kjeden knockout (NOD / SCID / γC - / -) mus som er 6-8 uker gamle i alle våre eksperimenter. Vi bruker en dual bildebehandling modell å samtidig spore tumor progresjon (turboFP650 reporter) og hESC-NK-celler eliminasjonskinetikk (Fluc reporter uttrykt i overordnede ES-celler) in vivo. Denne avbildning ordningen er bredt anvendelig på andre systemer enn det anti-tumor-modellen er vist her. Den IVIS Spectrum (Caliper Life Sciences) er optimal for samtidig fluorescerende og selvlysende in vivo imaging.
- 24 timer før svulst celle injeksjon, strålebehandling mus (225-250 CGY).
- Gjensuspender ønsket antalltumorceller (1 x 10 6 K562 celler er vist) i 200 pl Iscoves modifiserte Dulbeccos medium (IMDM) supplert med 20% FBS. Tumorcelle dosen kan varieres avhengig av modellen som brukes. TurboFP650 kan også uttrykkes på ikke-tumortyper. Det er best avbildet med celler lokalisert til et enkelt anatomisk sted.
- Injiser tumorceller subkutant i øvre venstre toraks av musene med en 27 eller 28 gauge nål og tillate å innpode i 4 dager. Cellene skal danne en boble under huden på musen. Mus kan barbert i denne delen av kroppen til bedre å visualisere injeksjon. Den avslører også området for bedre in vivo fluorescerende imaging. Injeksjon rundt thorax av musene ble benyttet i denne modellen fordi IP-injisert NK-celler er best visualisert mens mus er liggende. Alternative metoder for subkutan levering, inkludert ryggen eller flanke, er mindre stressende for dyret, og bør vurderes.
- Resuspender ønsket antall hESC-deriVED NK-celler (10 x 10 6 NK-celler er vist) i 300 mL Iscove endret Dulbecco medium (IMDM) supplert med 20% FBS uten antibiotika.
- Injisere hESC-avledet NK-celler i hver mus intraperitonealt (IP) med en 27 eller 28 gauge nål. For alle forsøkene inkluderer mus som fikk ingen svulst eller NK-celle infusjon som en negativ kontroll.
- Å opprettholde NK celle populasjoner in vivo, gi musene en 250 mL IP injeksjon av IL-2 (1x10 4 U / mus) og IL-15 (10 ng / mus) i sterile DPBS hver dag de første 7 dager etterfulgt av IL- 2 bare hver 2 til 3 dager før tidspunktet for offer.
- Overvåke engraftment av hESC-avledet NK-celler ved bioluminescent imaging. Injiser hver mus IP med 120 pl D-luciferin (150 mg / kg). Bilde av mus 10 min etter D-luciferin injeksjon.
- Anesthetize mus ved hjelp av et kammer slik at isofluran inntreden i boksen på 0,8 l / min. Pass på at det er også oksygen inn i kammeret.
- Plasser bedøvetmus i IVIS Spectrum og sikre mus på ryggen ved hjelp av tape eller borrelås og la isofluran inntreden i boksen på 0,5 l / min for å opprettholde anestesi.
- Sett IVIS maskinen skal korrigere bildebehandling plattform (D for 4-5 mus, C for tre eller færre mus), satt binning til middels, f / stopp til en og få bilde i 1 min.
- Å utføre fluoriserende bildebehandling for turboFP650 + celler, bruker bildebehandling veiviseren for å sette opp et utslipp skanning måle sonden av interesse samt bakgrunn signal. Fra listen over sonder velger Input Em / Ex, og skriv i riktig eksitasjon og emisjon. For turboFP650, bruke 605 eksitasjon og 660-720 utslipp for å måle svulst signal og 570 eksitasjon og 640-720 utslipp for å måle bakgrunnen signal. Bruk auto eksponering innstillinger og velge ønsket bildebehandling plattformen. Hele bildebehandling sekvensen vil normalt ta 3-5 minutter å tilegne seg.
- Tillate mus til fullt igjen fra anestesi før transport fra imaging system. Analyser bilder ved hjelp av LiVing Bilde programvarepakke versjon 4.2 (Caliper Life Sciences).
- Kvantifisere bioluminescent signal ved hjelp av en region av interesse (ROI) satt til total fluks (fotoner / sek) eller gjennomsnittlig utstråling (fotoner / sek / cm 2 / sr) og sett alle bildene til samme skala (figur 3). Her er representative bildene brukes til å demonstrere både celle populasjoner i hver mus (figur 3). Andre studier fra vårt laboratorium har vist colocalization hjelp av denne teknikken 20. Colocalization timing må optimaliseres basert på den eksperimentelle modell som brukes.
- Å kvantifisere fluorescerende signal fra utslipp scan sekvens bruke "Spectral Unmixing"-funksjonen i levende bilde. Velge bildene som tas med i analysen og trekke en maske over det område av musen som inneholder signalet av interesse, i dette tilfelle kan den øvre thorax. Velg vev autofluorescense og ukjente sonde som skal ublandet. Dersom musene får mat som inneholder alfalfa, kan mat signal også være unmixed fra sonden av interesse og vev autofluorescence.
- Hvis de resulterende bildene ikke viser en jevn fordeling av vev autofluorescens (inkludert det området der signalet er plassert) begrensninger kan innstilles for å få jevn fordeling og bedre separasjon av komponentene som blir ublandet. Dette er typisk, og ofte nødvendig for sonder som ikke er i programvaren og når spesifikke signal er lavt, eller nær til bakgrunnssignalet. Still et høypassfilter, som finnes under oppdateringen fane, for 640 nm, som tilsvarer den nedre ende av kurven for utslipp turboFP650. En low-pass filter begrensning kan også settes, men det var unødvendig for bildebehandling analyse vist her.
- Kvantifisere fluorescerende signal fra ublandet bildet ved hjelp av en region av interesse (ROI) satt til strålende effektivitet (fotoner / sek / cm 2 / sr) / μW) og sett alle bildene til samme skala (figur 3).
- På et ønsket tidspunkt, kan mus ofres og analysert for engraftment av hESC-deriverte celler ved flowcytometri. For intraperitonealt injisert NK-celler vanligvis vi analysere perifert blod (ansikts vein blø), milt, og bukhinne. Peritoneal vaskinger kan utføres ved å utsette bare bukhinnen og gjør en medial innsnitt akkurat bred nok til å tillate en glass Pasteur-pipette for å åpne bukhulen. Ved hjelp av sterile PBS, utføre flere vasker av bukhulen og sørg for å blande løsningen grundig ved å rotere musen. Samle nok væske før du har en synlig pellet følgende sentrifugering (vanligvis 5-10 ml vask).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Generering av blodkreft stamceller ved hjelp av spin EB tilnærming gir mulighet for optimal NK celle utvikling fra hESCs og iPSCs. Som vist i figur 2, dag 11 spin EBS inneholde høye prosenter av stamceller uttrykker CD34, CD45, CD43 og CD31. Høye nivåer av CD34 og CD45 tillater direkte overføring til NK forhold uten behov for sortering eller støtte stromaceller. Hvis det er suboptimal spin EB differensiering, er det anbefalt at stromale celler slik som EL08-1D2 er brukt i de sekundære NK forhold. Etter fire uker med kultur spin EBS gi opphav til et stort antall NK-celler (ca 1-2 x 10 6 celler per brønn av en 24-brønn plate). Kulturer kan også phenotyped på tidligere tidspunkter for å se den gradvis progresjon av NK-celle utvikling i dette system 7. NK-celler opprettholde ekspresjon av reporter genene som ble modifisert til den overordnede ES / IPS linje og derfor kan deretter følges
Figur 1. Dual bildebehandling ordningen og utviklingsmessige tidslinje. A) Skjematisk fremstilling av in vivo-modell. Mus er injisert IP med luciferin, og følge riktig inkubasjonstid, er firefly luciferase + celler avbildes for selvlysende signal. Etter oppkjøpet av bioluminescent bildet, fluorescerende signal fra TurboFP650 + celler kan avbildes. B) Tidslinje for utvikling og testing av hESC-derived NK-celler.
Figur 2. Phenotype av spin EBS og NK-celler avledet fra hESCs og iPSCs. A) Etter 11 dager i spinn EB kultur, kan cellene bli analysert ved flowcytometri. Dagen 11 tidspunkt gir høye prosenter av CD34, CD43, CD45 og CD31 uttrykker cellene optimale for NK celledifferensiering. B) NK-celler kan oppdages ved hjelp av flowcytometri etter fire uker med NK cellekultur. Celler i lymfocytter gate (FSC / SSC tomt) er analysert for uttrykket av CD56. CD56 +-celler kan bli ytterligere analysert for co-uttrykk for markører som CD117, CD94, NKp46 eller andre. Klikk her for å se større figur .
Figur 3. Fluoriserende og selvlysende bildebehandling in vivo bruker IVIS Spectrum. In vivo overvåking er det primære målet for denne protokollen. Derfor er mus ikke fulgt ut for tumor klaring. Vår forrige rapport (med 200.000 K562 celler) viser at tumor clearance skjer på tre uker 7. A) Bioluminescent avbildning av Fluc + hESC-avledet NK-celler på dag 0, 7 og 14 etter NK celle injeksjon er vist i den øverste raden. Fluorescerende avbildning av TurboFP650 + K562 celler på 0 dagen, 7 og 14 etter NK celle injeksjon er vist i den nederste raden. Fluorescerende bildene ble kjøpt umiddelbart etter selvlysende image oppkjøpet. B) Sequence viser vev autofluorescence og fluorescerende signal fra turboFP650 + celler, generert ved hjelp av den spektrale unmixing funksjonen i levende bilde-programvare. Musen helt til venstre i hvert bilde er en ikke-injeksjon kontroll og bare viser bakgrunnen signal. Klikk her for å se større figur .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
hESCs er en ideell plattform for å studere ulike celletyper og holder bemerkelsesverdig potensial for klinisk oversettelse. Vi bruker en definert, spin EB tilnærming å skille hESC / iPSCs til blodkreft stamceller. Spin EB Innsatsen har gitt konsistent avledning av blodkreft stamceller og differensiering til NK-celler, men likevel, variasjon fortsatt eksisterer i differensiering effektivitet på tvers av cellelinjer og kan trenge å bli endret for generering av andre blodkreft celle linjene. Mens sammenlignbare resultater kan fås fra utledningen i annen EB eller stromale kultur metoder, er dette systemet serumfritt og representerer en mer definert metode for fremstilling av hematopoetiske stamceller sammenlignet med andre metoder. Vi har også standardisert en effektiv metode for å utlede NK-celler fra disse blodkreft stamceller i en tilsvarende mater-fri måte, som overvinner en stor bekymring for klinisk oversettelse. Det gir også et definert system for å studere NK celle development in vitro. Omfattende pre-kliniske, in vivo karakterisering av blodkreft celler, slik som NK-celler, er også nødvendig å spesifikt definere disse eksperimentelt utledet celletyper og deres implementering i kliniske studier.
Fremskritt innen bildebehandling og mikroskopi teknikker har aktivert langsiktig og ikke-invasive in vivo overvåking av celler som uttrykker selvlysende og fluoriserende journalister 15-17,19,21. Mest kjent er bruk av ildflue luciferase konstrukt, som har blitt brukt til å visualisere forskjellige celletyper siden den innledende karakterisering. Dette er en ideell reporter for in vivo avbildning, men er begrenset til bare å overvåke en cellepopulasjon. Den største fordelen med en dobbelt-reporter-systemet er evnen til å følge de interaksjoner mellom to forskjellige cellepopulasjoner. Imidlertid har få journalister blitt utviklet som er både lett å image in vivo og har tilstrekkelig og kvantifiserbare signal ovenforbakgrunn.
TurboFP650, den fluorescerende protein som brukes i vår dual-imaging-ordningen, er langt-rød forskjøvet, som gir signal forskjellig fra bakgrunnen autofluorescence. Imidlertid var utnyttelse av spektrale unmixing metoder i levende bilde-programvare (Caliper Life Sciences) er nødvendig for å maksimere signal til bakgrunn ratio i vårt system. Det er mange funksjoner i Levende Bilde programvare i stand til å hjelpe til med den iboende utfordringene i fluorescerende protein bildebehandling. Likevel gjenstår signal penetrans en utfordring. Systemet trenger ytterligere optimalisering for avbildning av små cellepopulasjoner eller avbildning av dispergerte celler, som ville være tilfelle hvis de tumorceller ble injisert IP. Men gjør konsistens og enkel fluoriserende bildebehandling bruken en ideell plattform for å bruke i en dobbel bildebehandling modell. Dyrene er under anestesi for kortere tid, og det er ikke nødvendig for å levere et andre substrat som med de fleste to-luciferase-systemer.
Denne metodenav derivasjon, gir utvidelse, og dual-imaging in vivo en konsekvent tilnærming for å produsere hESC-avledet eller iPSC-derived NK-celler og deres evaluering som er nødvendig for å forbedre dagens NK celle adoptivforeldre terapi. Den doble lysstoffrør og selvlysende bildebehandling modellen er bredt gjeldende for langsiktig studie av to ulike celle populasjoner andre enn anti-tumor modellen vi har vist.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dette arbeidet ble støttet av NIH / NHLBI R01-HL77923 (DSK) og ved NIH MSTP stipend T32 GM008244 (DAK), Stem Cell Biology Training Grant T32 (DAK) (T32HD060536), Undergraduate Forskning Opportunities Program (UROP) Grant, University of Minnesota (AMB), leukemi forskningsfond ved University of Minnesota Cancer Center, og William L og Blanche Hughes Foundation.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Melinda Hexum for initiering av spinn EB-protokollen innen vårt laboratorium. Vi ønsker å takke andre medlemmer av lab, inkludert Laura E. Bendzick, Michael Lepley, og Zhenya Ni for deres hjelp i forbindelse med dette arbeidet. Forfatterne vil også gjerne takke Brad Taylor på Caliper Life Sciences for hans ekspert teknisk rådgivning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Media | |||
| BPEL media for Spin EB generation | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Fisher Scientific | SH3022801 | |
| F-12 Nutrient Mixture w/ Glutamax I | Invitrogen | 31765035 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3311 | Commercially available BSA can be cytotoxic to ES cells. Deionizing the solution can reduce the potential for cytotoxicity. |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Linoleic Acid | Sigma-Aldrich | L1012 | |
| Linolenic Acid | Sigma-Aldrich | L2376 | |
| Synthechol 500X solution | Sigma-Aldrich | S5442 | |
| a-monothioglycerol (a-MTG) | Sigma-Aldrich | S5442 | |
| Protein-free hybridoma mix II | Invitrogen | 12040077 | |
| Ascorbic Acid 2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Glutamax I | Invitrogen | 35050061 | |
| Insulin, Transferrin, Selenium 100X solution (ITS) | Invitrogen | 41400-045 | |
| Pen-Strep | Invitrogen | 15140122 | |
| NK Differentiation Media | |||
| Dubecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11965-118 | |
| F-12 Media | Invitrogen | CX30315 | |
| 15% Human AB serum | Valley Biomed | HP1022HI | |
| 5 ng/ml Sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | |
| 50 uM ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | |
| 20 ng/ml ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| 25 uM 2-mercapt–thanol (BME) | Gibco | 21985 | |
| 2 mM L-glutamine | Gibco | CX30310 | |
| 1% Pen-Strep | Invitrogen | 15140122 | |
| Cytokines | |||
| (all cytokines used fresh from frozen aliquots) | |||
| SCF | PeproTech, Inc. | 300-07 | 40 ng/ml in BPEL media; 20 ng/ml in NK medium). As noted by the Elefanty protocol, and as we discovered with a bad lot of BMP4, there can be lot differences with cytokines in regards to hematopoietic differentiation.Especially if buying cytokines in bulk, obtain a sample of the lot to test prior to purchase. Compare head-to-head with old lot. |
| rhBMP-4 | R & D Systems | 314-BP | 20 ng/ml in BPEL media |
| rhVEGF | R&D Systems | 293-VE | 20 ng/ml in BPEL media |
| IL-2 | PeproTech, Inc. | 200-02 | 1 x 105 U/ml given to mice after NK cell injection; 50 U/ml used in NK cell expansion protocol |
| IL-15 | PeproTech, Inc. | 200-15 | 10 ng/ml given to mice after NK cell injection (first 7 days only) |
| IL-3 | PeproTech, Inc. | 200-03 | 5 ng/ml in NK media |
| IL-7 | PeproTech, Inc. | 200-07 | 20 ng/ml in NK media |
| Flt-3-Ligand | PeproTech, Inc. | 300-19 | 10 ng/ml in NK media |
| In vivo Imaging | |||
| D-Luciferin Sodium Salt | Gold BioTechnology | Lucna-500 | |
| TurboFP650 plasmid | Evrogen, Moscow, Russia | FP731 | Subcloned into a Sleeping Beauty transposon based plasmid driven by the mCAGs promoter. Cells were then sorted on their expression of turboFP650 by FACS. Cells and plasmids can be obtained from our lab. |
| Equipment | |||
| IVIS Spectrum Imaging System | Caliper Life Sciences | ||
| Cells | |||
| Membrane bound IL-21 expressing artificial antigen presenting cells |  MD Anderson, Houston, TX |
contact: Dean A. Lee. http://www.jove.com/video/2540/expansion-purification-functional-assessment-human-peripheral-blood | |
| Firefly luciferase expressing hESCs | University of Minnesota, Minneapolis, MN | contact: Dan S. Kaufman . H9 cells modified with a Sleeping Beauty transposon based method (references 13 and 14). Expression of firefly luciferase is driven by the mCAGGS promoter. Following the firefly luciferase gene is an IRES element at the 5' end of a GFP:zeocin fusion construct. | |
| TurboFP650 expressing K562 cells | University of Minnesota, Minneapolis, MN | contact: Dan S. Kaufman. Description under plasmid comments section | |
Materials Table. |
|||
References
- Keller, G. M. In vitro differentiation of embryonic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 7, 862-869 (1995).
- Kaufman, D. S. Hematopoietic colony-forming cells derived from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98, 10716-10721 (2001).
- Kaufman, D. S. Toward clinical therapies using hematopoietic cells derived from human pluripotent stem cells. Blood. 114, 3513-3523 (2009).
- Ng, E. S., Davis, R., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. A protocol describing the use of a recombinant protein-based, animal product-free medium (APEL) for human embryonic stem cell differentiation as spin embryoid bodies. Nature Protocols. 3, 768-776 (2008).
- Ng, E. S., Davis, R. P., Azzola, L., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. Forced aggregation of defined numbers of human embryonic stem cells into embryoid bodies fosters robust, reproducible hematopoietic differentiation. Blood. 106, 1601-1603 (2005).
- Vodyanik, M. A., Bork, J. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. Human embryonic stem cell-derived CD34+ cells: efficient production in the coculture with OP9 stromal cells and analysis of lymphohematopoietic potential. Blood. 105, 617-626 (2005).
- Woll, P. S., et al. Human embryonic stem cells differentiate into a homogeneous population of natural killer cells with potent in vivo antitumor activity. Blood. 113, 6094-6101 (2009).
- Woll, P. S., Martin, C. H., Miller, J. S., Kaufman, D. S. Human embryonic stem cell-derived NK cells acquire functional receptors and cytolytic activity. Journal of Immunology. 175, 5095-5103 (2005).
- Ni, Z., et al. Human Pluripotent Stem Cells Produce Natural Killer Cells That Mediate Anti-HIV-1 Activity by Utilizing Diverse Cellular Mechanisms. Journal of Virology. 85, 43-50 (2011).
- Ng, E. S., Davis, R. P., Hatzistavrou, T., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. Directed differentiation of human embryonic stem cells as spin embryoid bodies and a description of the hematopoietic blast colony forming assay. Current Protocols in Stem Cell Biology. Chapter 1, Unit 1D.3 (2008).
- Denman, C. J., et al. Membrane-Bound IL-21 Promotes Sustained Ex Vivo Proliferation of Human Natural Killer Cells. PLoS ONE. 7, e30264 (2012).
- Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells. J. Vis. Exp. (48), e2540 (2011).
- Tian, X., et al. Bioluminescent imaging demonstrates that transplanted human embryonic stem cell-derived CD34+ cells preferentially develop into endothelial cells. Stem Cells. 27, 2675-2685 (2009).
- Wilber, A., et al. Efficient and stable transgene expression in human embryonic stem cells using transposon-mediated gene transfer. Stem Cells. 25, 2919-2927 (2007).
- Shcherbo, D., et al.
- Nguyen, V. T., Morange, M., Bensaude, O. Firefly luciferase luminescence assays using scintillation counters for quantitation in transfected mammalian cells. Analytical Biochemistry. 171, 404-408 (1988).
- Sadikot, R. T., Blackwell, T. S.
- Santos, E. B., et al. Sensitive in vivo imaging of T cells using a membrane-bound Gaussia princeps luciferase. Nature Medicine. 15, 338-344 (2009).
- Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Fluorescent Proteins and Their Applications in Imaging Living Cells and Tissues. Physiological Reviews. 90, 1103-1163 (2010).
- Knorr, D. A., Bock, A., Brentjens, R. J., Kaufman, D. S. Engineered Human Embryonic Stem Cell-Derived Lymphocytes to Study In Vivo Trafficking and Immunotherapy. Stem Cells Dev. 28, 28 (2013).
- Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. A Decade of Imaging Cellular Motility and Interaction Dynamics in the Immune System. Science. 336, 1676-1681 (2012).
