Bioengineering

Создание Грибковые энтомопатогенов как Эндофиты: на пути к эндофитные биологического контроля

Published: April 11, 2013 doi: 10.3791/50360

Soroush Parsa¹, Viviana Ortiz¹, Fernando E. Vega²

¹Entomology, International Center for Tropical Agriculture (CIAT), Cali, Colombia, ²Sustainable Perennial Crops Laboratory, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture, Beltsville, Maryland, USA

Summary

Этот протокол демонстрирует две прививки методов ввести грибковых entomopathogen

Abstract

Beauveria Bassiana это грибковая entomopathogen с возможностью колонизации растений endophytically. Как эндофита, B. Bassiana могут играть определенную роль в защите растений от herbivory и болезней. Этот протокол демонстрирует две прививки методов установления B. Bassiana endophytically в фасоли (Phaseolus угри), в рамках подготовки к последующей оценки эндофитные биологического контроля. Растения, выращенные из поверхностных стерилизованные семена в течение двух недель до получения B. Bassiana лечение 10 ⁸ конидий / мл (или воды) применяется либо в виде спрея или листвы почвы мочить. Две недели спустя, растения собирают и их листья, стебли и корни проб для оценки эндофитные грибковой колонизации. Для этого образцы индивидуально поверхности стерилизованных, разрезать на несколько разделов, и инкубировали в картофеле СМИ агар декстрозы в течение 20 дней. СМИ проверять каждые 2-3 дня, чтобы наблюдать рост гриба, каксвязанное с завода разделов и записывать возникновения B. Bassiana оценить степень его эндофитные колонизации. Анализ прививки успехом сравнить возникновения B. Bassiana в данной части растения (например, листья, стебли или корни) через процедуры и управления. В дополнение к прививки метод, определенный результат эксперимента может зависеть от целевой урожая вида или разновидности, грибковые entomopathogen видов напрягаться или изолировать используется, и условий выращивания растений.

Introduction

Грибковые энтомопатогенов являются важными регуляторами популяций насекомых со значительным потенциалом как mycopesticides ^1. Только в последнее время, однако, грибковые энтомопатогенов было показано, что происходит в эндофитами, как естественно и в ответ на различные способы прививки ^2. Экологические функции эндофитные грибковых энтомопатогенов остается неизвестной, но некоторые исследования были замешаны их роста растений ^3,4, травоядное сопротивления ^5-8, и устойчивость к болезням ^9,10. Общая цель Методы, представленные здесь является введение грибковых entomopathogen как эндофита, в рамках подготовки к последующей оценки эндофитные биологического контроля.

Beauveria Bassiana (Бальзамо) Vullemin (Ascomycota: Hypocreales) является наиболее изученным эндофитные грибковых entomopathogen ^5-9,11-19, и он доступен в качестве коммерческого mycopesticide. Прививка методы испытания установить 14,17, семян покрытия ¹⁸ и погружения ^14, корешок повязки ^13,15, корень и корневище погружений ^11,16,18, стволовые инъекции ^{17, 14,17,20} листвы спреи и аэрозоли цветок ^19. Используя эти методы, исследователи ввели B. Bassiana в банановой ^11, фасоль ^{7, какао-13,} кофе ^17, кукурузы ^7, хлопок ^7, финиковая пальма ^12, джута ^{21, 20} опийного мака, тыквы ^7, сосны лучистой ^18, сорго ^14, томат ⁷ и пшеница ^7. Последние данные свидетельствуют о том, что эндофитные B. Bassiana имеет потенциал, чтобы защитить растения не только от членистоногих вредителей ^5-7,22-27, но и от некоторых патогенов растений ^9.

Фасоли (Phaseolus угри) входит в число наиболее уязвимых культур к вредителями болезней. Это может быть затронуто более 400 вредителей и 200 патогенных микроорганизмов, которые нападении считается самым ограничивающим фактором бобов производства по регионам ^28. Соответственно, фасоли может быть отличным урожая модель для изучения полного спектра эндофитные биологический контроль B. Bassiana. В качестве первого шага в этом направлении, в данной статье описывается листвы спреи и почвы Захлестывает водой, как прививка методы введения B.bassiana как эндофита в общей бобов.

Protocol

1. Растения

Поверхностно-стерилизации семян фасоли (сорт Calima) путем погружения их в течение двух минут в 0,5% раствор гипохлорита натрия и две минуты в 70% этаноле. Промойте семена три раза в стерильной дистиллированной воде.
Оценка успеха вашей стерилизации при посеве 100 мкл последнего полоскания водой на картофель dextroxe агар (PDA) средства массовой информации, и инкубирования пластин в течение 10 дней при температуре 25 ° C. Завершить и перезапустите эксперимент, если любой рост видно на тарелку.
Посадите семена в группах по три в горшки, содержащие стерильный смесь земли и песка в соотношении 2:1. Перенесите горшки с ростом камеры при 25 ° C, ок. Относительной влажности 50% и 12 часа фотопериода. Через неделю после прорастания, устранение двух наименее энергичной саженцев. Вода каждые 2-3 дня стерильной дистиллированной водой и оплодотворить 10 и 20 дней после посадки с 6 г / л водного раствора NPK 15-15-15 удобрений.

2. Гриб

Получить коммерческихсоциальной формулировка Beauveria Bassiana штамм ГСГ (Mycotrol SE, Laverlam, Кали, Колумбия).
Для создания одного спора складе культуры, приостановить ок. один полный цикл посева конидий в 1 мл 0,1% водного раствора Triton-X 100 и вихрь в течение 10 сек. Затем пластины по 100 мкл суспензии на 2,5% Благородный агар и инкубировать в течение 24 ч при температуре 25 ° C. Передача одной конидии прорастают в 100-мм пластины, содержащей КПК и расти, пока не охватывает всю пластину (около 3-4 недель).
В стерильных условиях, очистить роста грибов с поверхности среды и приостановить его в 10 мл стерильного 0,1% Triton-X 100. Vortex в течение одной минуты. Тогда, фильтрации суспензии через стерильную марлю, чтобы удалить гиф и получить акции подвески.
Используйте гемоцитометр оценить конидий концентрация фондовых подвески. Для облегчения конидий рассчитывает, подготовить 10000-кратные серийные разведения складе, каждый раз передача 100 мкл оF конидий подвески в 900 мкл 0,1% Triton X-100, и встряхиванием в течение 10 сек до следующего разведения.
Для создания посевного материала, настроить подвеску акции до конечной концентрации 10 ⁸ конидий / мл, используя формулу:
Для оценки жизнеспособности конидий, пластина 100 мкл 10000-кратном разведении на 2,5% Благородный агар и инкубировать в течение 24 ч при температуре 25 ° C. Затем осмотрите три случайных группах из 100 конидий оценить процент всхожести. Рассмотрим конидии прорастают при видимом трубки зародыша больше, чем половина диаметра конидии проекты от него. Используйте только подвеску, когда средний процент прорастания превышает 90%.

3. Прививка

Инокулировать растений, когда они достигают своих первых настоящих листьев этапе (ок. 14 дней после посадки). Водные растения в почве мощностью стерильной перегонятьред воде 24 часов, прежде чем прививки.
Для листьев методом распыления, использовать ручной распылитель, чтобы применить конидий подвески (лечения) или на 0,1% Triton-X 100 (контроля) в адаксиальной (верхняя) поверхность листьев, пока они не достигнут насыщения. Накройте верхнюю часть горшка с алюминиевой фольгой, чтобы избежать конидий стоков в почву. После распыления, накрыть растения с пластиковым пакетом в течение 24 часов, чтобы поддерживать высокий уровень влажности содействия грибковых вторжения.
Для метода почвы мочить, используйте мерный цилиндр применять 10 мл конидий подвески (лечения) или на 0,1% Triton X-100 (управление) на поверхность почвы у основания растения.
После прививки, вернуть растений к росту камер, расположив их в рандомизированных блоков. Не менее чем за четыре дополнительных экспериментальных блоков должны быть установлены, чтобы оценки роста растений, в дополнение к оценке эндофитные колонизации, в том же эксперименте.

4. Evaluations

Оцените эксперимента по одному блоку за раз, выбирая блоки в случайном порядке. Это особенно важно для больших экспериментов, которые не могут быть оценены на один день.
Перед обработкой растений, измерить и записать его высота от основания до апикальной меристемы. Тогда, искоренить внимательно и тщательно промыть в проточной воде.
С каждого растения, образцы две листовки, два куска корня и два кусочка стебля. Выберите листовки образцы случайным образом из первого настоящего листа растения. Тогда получим два ствола образцы, 3 см длиной каждый, с середины растения и от вблизи поверхности почвы. И, наконец, получить два образца стержневой корень, а также 3 см длиной каждый, с середины корня и от 1 см от кончика корня. Поместите образцы в трех отдельных бумажных пакетах и этикетки надлежащим образом.
После промывки и отбора проб все растения в блок, для начала обработки листьев, затем корни, и, наконец, стебли.
Поверхностные стерилизации твопросов в стерильной ламинаре, как в 1.1, выше. Промыть каждого образца в три раза путем погружения в стерильной дистиллированной воды и дайте ему высохнуть в стерильной бумажной салфеткой. Тогда, анализировать и отбросить его внешнего края, где эндофитами можно было бы устранить в результате контакта с дезинфицирующими средствами.
Вырезать обрезанные образца из шести разделов, в среднем 6х6 мм для листьев и 6 мм длиной для стеблей и корней. Плита шести разделах, посвященных 60 мм Петри пластины с PDA среде с добавлением антибиотиков тетрациклина, стрептомицина и пенициллина в дозе 2 мг / л каждая. Печать плиты с парафином и инкубируют в темноте при 25 ° C. Каждое растение дает шесть тарелок, два в части завода.
Изменение промывной воды после обработки каждого блока данному части растения. Прежде чем избавиться использовать промывные воды, плита 100 мкл образца на КПК СМИ и инкубировать в течение 10 дней при температуре 25 ° C для оценки стерилизации успех. Если рост гриба вытекает, не считают соответствующей пробы для анализа.
Проверьте пластины каждые 2-3 дня в течение 20 дней, чтобы наблюдать и записывать роста грибов. Разделах акцизов и передачи завода выставке наличии грибкового эндофитами на пластины, содержащие свежие КПК. Это позволит избежать загрязнения соседних участков завода в оригинальной пластины.
Запись B. Bassiana рост от завода разделов. Beauveria Bassiana можно определить по характерным белым плотным мицелий становится все сливки до бледно-желтого на краю. Если есть сомнения, установить образец в капле воды и осмотреть под микроскопом, ища шаровидные конидии и зигзагообразных конидиеносцев, характерные для данного вида.
Использование дополнительных экспериментальных блоков для оценки влияния лечения на растительной биомассы. Во-первых, измерить их высоту от основания до верхней части апикальной меристемы. Затем, тщательно вырывать с корнем растения и мыть в проточной воде и дайте им высохнуть при 45 ° С в течение трех дней, чтобы определить их сухого веса.

Representative Results

B. Bassiana смог endophytically колонизировать P. угри в ответ на прививку продемонстрировали лечения (рис. 1). Оба листвы спреи и почвы Захлестывает водой в результате эндофитные колонизации B. Bassiana более чем в 80% обработанных растений (рис. 2). Однако степень колонизации зависел от части растения оценены и прививки метода. Листья ответили лучше спрей прививок. Корни, с другой стороны, ответили только мочить прививки. Наконец, стебли ответил так же, как прививка методами. B. Bassiana не был обнаружен ни в одном из разделов управления завода.

Независимо от лечения, эндофитами кроме B. Bassiana выросла с 15% оценивали разделов растения, но они вырезали из пластин средств массовой информации, прежде чем они могли бы вторгнуться в соседние участки и влиять на результат.

Лечение и контрольные растения были заметно неотличимы две недели после прививки. Нет различия были обнаружены в их сухого веса и в их высоты.

Рисунок 1. Представитель результаты прививки лечение на эндофитные колонизации растений фасоли (Phaseolus угри резюме Calima.) По Beauveria Bassiana Вверху слева:. Контроль пластин с роста нет. Вверху справа: Грибковые эндофита из растений разделе загрязняющих всей пластинки. Внизу слева: B. Bassiana растет из двух частей растения. Внизу справа: эндофитные B. Bassiana конидий и конидиеносцев, как видно под микроскопом.

Рисунок 2. Влияние инокуляции лечения на эндофитные колонизации BEAп растения (Phaseolus угри резюме. Calima) по Beauveria Bassiana, через две недели после прививки от напряжения ГСГ. Процент колонизация представляет собой число колонизированных растений разделов делится на количество культурных разделов.

Discussion

Многие факторы могут влиять на конкретные результаты эксперимента по созданию грибковых entomopathogen как эндофита. Наши результаты показывают, прививки метод является одним из них. Биологические факторы экспериментировать с включать видов сельскохозяйственных культур или сорт выбрать и грибковых entomopathogen штамм вида или изолировать используется. Другие факторы, чтобы рассмотреть манипуляции включают концентрацию инокулята, возраста растения во время прививки, и условий выращивания растений.

Это было бы идеально для прививки метод приводит к системным колонизации растения грибковым entomopathogen ^14,17,18,21. Вместо этого, кажется, что прививка методы, как правило, отдают предпочтение определенному шаблону местной колонизации. В кофе, например, листвы спреи пользу лист колонизации в то время как почва Захлестывает водой пользу корень колонизации ^17. Мы обнаружили, что по той же схеме в общих компонент. В конечном счете, выбор метода прививки должны бытьруководствуясь предназначен расположение эндофита в растение, предположительно соответствующие ниши травоядных животных или растений целевой возбудителя.

Хотя обычно используются, эндофита обнаружения и количественного зависит от среды культурах может быть дорогостоящим, сложным и ошибок. Например, в общей сложности 10800 частей растения (высевают на чашки Петри, 1800) были оценены в эксперименте по оптимизации B. Bassiana прививки на банановых ^16. Из них 4496 срезы колонизировали предполагаемого B. Bassiana, определенных главным образом по морфологии колонии. Очевидно, что микроскопические проверка вида для каждой колонии была бы желательна, но недоступны шаг. С другой стороны, 1176 разделы были колонизированы другими грибами и были отброшены и рассматриваются как отсутствующие данные ^16. Существует вероятность, однако, что B. Bassiana был плохой конкурент или медленнее расти, и, возможно, в конечном итоге вышли из тех разделов, еслиllowed достаточно времени. Таким образом, эндофита методы обнаружения основан на культуру средств массовой информации могут быть ложных срабатываний и ложных негативов. Соответственно, разработка более надежного обнаружения и количественного методов, например, основанные на полимеразной цепной реакции (ПЦР) анализы ^20,21,24, вполне оправдано.

Конечной целью для прививки экспериментов должна стать разработка эффективного лечения, который обеспечивает прочное системное сопротивление herbivory и / или болезни. Правдоподобным, но пока непроверенной, гипотеза, что степень колонизации эндофитные должны положительно коррелируют со степенью эндофита-опосредованной сопротивление. Следующим естественным шагом после уточнения методов прививки, поэтому, может быть, чтобы изучить эту взаимосвязь. Несколько протоколов видео может помочь ученым разработать подходящую анализа сопротивления для целевого вредителя или патогена ^29-31. В конечном счете, именно этот анализ, что будет определять успех посевнойния метода и связанные с ними возможности эндофитные биологического контроля.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Производство и экспериментальные работы, представленные здесь, отражают преданных и восторженных помощью Рейнальдо Пареха. Финансируемая Административного департамента Колумбии науки, технологий и инноваций (COLCIENCIAS) и гранта от Фонда Билла и Мелинды Гейтс через Большой инициативу проблемы исследования.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number
Mycotrol SE	Laverlam	4167
Noble agar	Sigma	A5431-250G
Penicillin G sodium salt	Sigma	P3032-25MU
Petri dish (100 x 15 mm)	Fisher	08-757-12
Petri dish (60 x 15 mm)	Fisher	08-757-13A
Potato dextrose agar	Difco	213400
Regular bleach (NaOCl)	CLOROX	N/A
Streptomycin sulfate salt	Sigma	S6501-25G
Tetracycline	Sigma	T3258-25G
Triple quince (NPK)	ABOCOL	N/A
Triton X-100	Sigma	X-100
EQUIPMENT
Biological safety cabinet	NuAire	NU-425-600
Hemocytometer	Fisher	02-671-10
Leica DM LB microscope	Leica	N/A