Bioengineering

Endophytes로 곰팡이 Entomopathogens 구축 : Endophytic 생물학적 방제 향해

Published: April 11, 2013 doi: 10.3791/50360

Soroush Parsa¹, Viviana Ortiz¹, Fernando E. Vega²

¹Entomology, International Center for Tropical Agriculture (CIAT), Cali, Colombia, ²Sustainable Perennial Crops Laboratory, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture, Beltsville, Maryland, USA

Summary

이 프로토콜은 곰팡이 entomopathogen을 소개하는 두 접종 방법을 보여줍니다

Abstract

Beauveria bassiana는 endophytically 식물을 이식 할 수있는 능력을 곰팡이 entomopathogen입니다. endophyte, B.로 bassiana는 herbivory과 질병으로부터 식물을 보호하는 역할을 재생할 수 있습니다. 이 프로토콜은 B.를 설정하는 두 가지 접종 방법을 보여줍니다 endophytic 생물학적 방제의 후속 평가에 대비 일반 콩 (Phaseolus vulgaris)에 endophytically bassiana. 식물은 B.를 받고 2 주 후면에 표면 소독 종자에서 재배 10 ⁸ conidia / ML (또는 물)의 bassiana 치료는 잎 스프레이 또는 토양 물약으로도 적용했습니다. 2 주 후에 식물 수확을하고 있으며 잎, 줄기 및 뿌리는 endophytic 곰팡이 식민지을 평가하는 샘플입니다. 이 경우, 샘플은 개별적으로 여러 부분으로 절단, 소독 표면되며, 20 일 동안 감자 덱스 트로 오스 한천 미디어에서 incubated. 미디어로 곰팡이 성장을 관찰 할 때마다 2-3일 검사를식물 섹션과 sociated와 B의 발생을 기록 bassiana는 endophytic 식민지의 범위를 측정합니다. 접종의 성공 분석은 B.의 발생을 비교 트리트먼트와 컨트롤에서 특정 식물의 부분에서 bassiana (예 : 잎, 줄기 또는 뿌리). 접종 방법뿐만 아니라, 실험의 구체적인 결과가 대상 작물 종이나 다양한에 따라 달라질 수 있습니다, 곰팡이 entomopathogen 종 변형 또는 사용 분리 및 식물의 성장 조건.

Introduction

곰팡이 entomopathogens는 mycopesticides ^1로 상당한 잠재력을 지닌 곤충 집단의 중요한 조절기입니다. 최근에, 그러나, 곰팡이 entomopathogens이 endophytes 모두 자연스럽게 다양한 접종 방법 ² 반응으로 발생하는 표시되었습니다. endophytic 곰팡이 entomopathogens의 생태 기능은 대부분 알 수없는 남아 있지만, 일부 연구는 식물의 성장 ^3,4, herbivore 저항 ^5-8, 질병 저항 ^9,10에서 그들을 연루 있습니다. 여기에 제시된 방법의 전반적인 목적은 endophytic 생물학적 방제의 후속 평가에 대한 준비, endophyte로 곰팡이 entomopathogen을 소개하는 것입니다.

Beauveria bassiana (Balsamo) Vullemin (Ascomycota : Hypocreales)는 최고의 연구 endophytic 곰팡이 entomopathogen ^{5-9,11-19이며,} 상업 mycopesticide로 사용할 수 있습니다. 접종 방법은 확립 테스트 14,17, 종자 코팅 ¹⁸ immersions ¹⁴ 잔뿌리 드레싱 ^13,15, 루트와 rhizome immersions ^11,16,18, 줄기 주사 ^17, 잎 스프레이 ^14,17,20와 꽃 스프레이 ¹⁹ 등이 있습니다. 이러한 방법을 사용하여, 연구자들은 B.를 도입 한 bassiana 바나나 ^11, 콩 ^7, 카카오 ^13, 커피 ^17, 옥수수 ^{7면 7,} 날짜 야자 ^12, 주트 사람 ²¹ 아편 양귀비 ^20, 호박 ⁷ radiata 소나무 ¹⁸ 수수 ^14, 토마토 ⁷ 밀 ^7에. 최근 증거 endophytic B.를 제안 bassiana는뿐만 아니라 arthropod 해충 ^{5-7,22-27에서} 식물을 보호 할 수있는 잠재력을 가지고 있지만, 일부 식물 병원균 ^9.

일반 콩 (Phaseolus vulgaris의)는 해충에 가장 취약한 작물 사이에 위및 질병. 그것은 그의 공격 지역 ^28에서 가장 제한 콩 생산 요소로 생각됩니다 400 개 이상의 해충 200 병원균에 의해 영향을받을 수 있습니다. 따라서, 일반적으로 콩은 B.에 의해 endophytic 생물학적 방제의 전체 스펙트럼을 조사하는 훌륭한 모델 작물 될 수 있습니다 bassiana. 이 방향으로 첫 번째 단계로,이 글은 일반적인 콩의 endophyte로 B.bassiana을 소개 접종 방법으로 잎 스프레이와 토양 drenches에 대해 설명합니다.

Protocol

1. 식물

표면 살균 0.5 % 차아 염소산 나트륨의 2 분 70 % 에탄올에 2 분을 immersing하여 콩 종자 (cv. Calima를). 멸균 증류수의 씨앗을 세 번 씻어.
감자 dextroxe 한천 (PDA) 미디어에 마지막 린스 물을 100 μl를 도금, 25에서 10 일 동안 판을 잠복기하여 살균의 성공 ° C.를 평가 모든 성장은 판에 표시되는 경우 실험을 종료하고 다시 시작합니다.
2시 1분 비율로 토양과 모래의 무균 혼합을 포함 냄비에 세 그룹의 종자를 심습니다. 25 성장 챔버 ° C, CA에 냄비를 전송합니다. 50% RH, 12 시간 photoperiod. 일주일 발아 후, 두 최소 힘차게 모종을 제거합니다. 멸균 증류수 및 NPK 15-15-15 비료 6g / L 물 솔루션으로 재배 한 후 10 이십일 비옥 물에 모든 2-3일.

2. 진균류

commer을 확보Beauveria bassiana 변형 가나 (Mycotrol SE, Laverlam, 칼리, 콜롬비아)의 cial 제형.
단일 포자 주식 문화를 생성하려면 CA를 일시 중지합니다. 하나는 10 초에 0.1 % 물 튼-X 100의 솔루션과 소용돌이의 1 ML에 conidia의 전체 루프를 inoculating. 25 24 시간에 2.5 % 귀족 한천과 배양에 정지 후, 판 100 μl ° C. 100mm 플레이트가 포함 된 PDA에 하나의 germinating conidium를 전송하고 전체 플레이트 (ca. 3-4주)를 포함 할 때까지 성장합니다.
무균 조건에서 매체의 표면에서 곰팡이 성장을 다쳤고, 10 ML 멸균 0.1 % 트리톤 - X 100에 일시 중지됩니다. 1 분 와동. 그런 다음 균사를 제거하고 주식 정지를 얻기 위해 멸균 일종의 투박한 무명을 통해 정지 필터링합니다.
주식 정지 conidial 농도를 추정하기 위해 hemocytometer를 사용합니다. conidial 카운트를 촉진하기 때마다 100 μl O를 전송, 주식의 10,000 배 희석 시리얼을 준비F conidial 0.1 % 트리톤 - X 100 900 μl에 정지하고, 다음 희석하기 전에 10 초에 vortexing.
inoculum를 생성하려면 다음 수식을 사용하여 10 ⁸ conidia / ML의 최종 농도에 주식 정지를 조정 :
25에서 24 시간에 2.5 % 귀족 한천과 배양에 10,000 배 희석의 conidial 생존, 판 100 μl을 평가하기 위해 ° C. 그런 다음 %의 발아을 예측할 수 100 conidia 세 무작위로 그룹을 검사한다. germinated conidium을 고려 할 때의 conidium 프로젝트의 절반 직경보다 눈에 띄는 세균 관 이상. 평균 %의 발아이 90 %를 초과하는 경우에만 정지를 사용합니다.

3. 접종

그들의 최초의 잎 단계 (ca. 십사일 재배 후)에 도달 할 때 식물의 예방. 멸균과 토양 용량 물 식물 증류예방 접종하기 전에 에드 물을 24 시간.
잎 스프레이 방식의 경우 conidial 정지 (치료) 또는 0.1 % 트리톤 - X 100 (제어) 잎의 adaxial (위쪽) 표면에 사람들이 포화에 도달 할 때까지를 적용 할 수동 분무기를 사용합니다. 토양에 conidial 결선을 피하기 위해 알루미늄 호일로 냄비의 상단을 커버. 분사 후, 곰팡이 침략을 촉진 습도의 높은 수준을 유지하기 위해 24 시간을위한 비닐 봉지에 식물을 다룹니다.
토양 물약 방법에 대해 conidial 정지 (치료)의 10 ML 또는 0.1 % 트리톤 - X 100 (제어) 공장의 바닥에있는 흙의 표면합니다.을 적용하기 위해 눈금 실린더를 사용하여
예방 접종 후, 무작위로 전체 블록 디자인을 주선 성장 방으로 식물을 반환합니다. 이하 사보다 추가 실험 블록이 같은 실험에서, endophytic 식민지의 평가뿐만 아니라, 식물 성장의 평가를 허용하도록 설치해야합니다.

4. 건강 검진 보고서uations

무작위 순서로 블록을 선택 한 번에 실험 한 블록을 평가합니다. 이 하루에 평가 될 수없는 대규모 실험에 특히 중요합니다.
식물을 처리하기 전에 측정하고 기지에서 꼭대기의 분열 조직과의 높이를 기록합니다. 그런 다음, 신중하게 근절하고 수돗물을 실행에 철저하게 씻는다.
각 공장, 샘플에서 두 전단지, 루트 두 가지와 줄기의 두 조각. 식물의 최초의 잎에서 무작위로 전단지 샘플을 선택합니다. 그런 다음, 식물의 중간에서와 토양 표면 근처에서 두 줄기 샘플, 3cm 길이의 각을 구하십시오. 마지막으로, 루트의 중간에서와 루트 끝 뒤에 1cm에서, 또한 3cm 길이 각각 두 개의 직근 샘플을 얻습니다. 적절하게 세 가지 종이 봉투 및 레이블에 샘플을 배치합니다.
블록에있는 모든 식물을 세탁 및 샘플링 후, 다음, 잎을 처리하여 뿌리를 시작하고 마지막으로 줄기.
t를 검사 표면위의 1.1에서와 같이 무균 층류 후드에 문제를 해결합니다. 멸균 증류수에 침수하여 각 샘플을 세 번 씻어 살균 수건 종이에 말 리도록 해. 그런 다음 해부 및 endophytes은 소독제와의 접촉으로 인해 제거되었을 수있는 곳, 그 바깥 쪽 가장자리를 폐기하십시오.
줄기와 뿌리에 잎과 6mm 길이에 대한 6x6 mm의 평균 여섯 부분으로 다듬어 샘플을 잘라 버릴거야. 판 2 밀리그램 / L 각에서 항생제의 테트라 사이클린, 스트렙토 마이신과 페니실린을 보충 PDA 미디어 60mm 페트리 접시에 여섯 섹션을 제공합니다. parafilm으로 판을 봉쇄하고 25 어둠 속에서 길러 ° C.를 각 공장은 여섯 접시, 두 당 공장의 일부를 얻을.
특정 식물 부분의 각 블록을 처리 한 후 물을 씻어 변경합니다. 폐기하기 전에 사용 린스 물, 음식 ° C는 살균 성공을 25 10 일간 PDA 미디어 및 배양에 100 μl 샘플을 평가합니다. 곰팡이 성장이 ensues 경우, 분석에 해당하는 샘플을 고려하지 않습니다.
곰팡이 성장을 관찰하고 기록하기 위해서는 20 일 동안 판 매 2-3 일 검사합니다. 소비세와 송금 공장 섹션 신선한 PDA를 포함하는 접시에 곰팡이 endophytes의 존재를 전시. 이것은 원래 판에 인접한 공장 섹션의 오염을 방지 할 수 있습니다.
기록 B. 식물 섹션에서 bassiana 성장. Beauveria bassiana는 특성 흰색 조밀 mycelia는 가장자리에 연한 노란색으로 크림이 될 때 추가로 식별 할 수 있습니다. 의심, 물 한 방울에 표본을 마운트 종의 특성 구형의 conidia과 지그재그 모양의 conidiophores, 찾고, 현미경으로 검사합니다.
식물 바이오 매스에 대한 치료의 영향을 평가하기 위해 추가 실험 블록을 사용합니다. 첫째, 기지에서 꼭대기의 분열 조직의 상단에 자신의 높이를 측정합니다. 그런 다음, 신중하게 근절하고 수돗물에 식물을 씻어하고 건조 중량을 결정하기 위해 사흘 동안 45 ° C에서 그들을 건조 보자.

Representative Results

B. bassiana는 P.을 endophytically - 이식 할 수있었습니다 증명 접종 트리트먼트 (그림 1)에 대응 vulgaris. 잎 스프레이와 토양 drenches 모두 B.에 의해 endophytic 식민지 결과 처리 식물의 80 %에 bassiana (그림 2). 그러나, 식민지의 정도는 평가 공장 부분 및 사용 접종 방법에 의존한다. 잎은 스프레이 예방 접종에 가장 응답했습니다. 뿌리는 반면에, 만 물약 예방 접종에 응답했습니다. 마지막으로, 줄기 모두 접종 방법에 유사하게 대응했다. B.는 bassiana는 제어 공장 섹션 중 하나에 발견되지 않았습니다.

B. 이외의 치료, endophytes의 독립 bassiana는 평가 플랜트 섹션의 15 %에서 증가하지만, 그 주변 부분을 침공하고 결과에 영향을 줄 수 전에이 미디어 판에서 로그 해부했다.

치료 및 제어 식물 두 주 예방 접종 후 가시적 구분할 수 있었다. 어떤 차이는 자신의 건조 무게와 높이 감지되지 않았습니다.

그림 1
1 그림. Beauveria bassiana의 콩 식물의 endophytic 식민지 (. Phaseolus vulgaris CV Calima)에 접종 트리트먼트 대표 결과 왼쪽 상단 :. 제어없이 성장과 접시. 오른쪽 상단 : 전체 판을 오염 공장 섹션에서 곰팡이 endophyte. 왼쪽 하단 : B. bassiana 두 개의 공장 섹션에서 성장. 오른쪽 하단 : Endophytic B. bassiana conidia와 conidiophores은 현미경으로 본 적 있어요.

그림 2. BEA의 endophytic 식민지에 접종 트리트먼트 효과변형 가나와 예방 접종 후 Beauveria bassiana 두 주에 의해 N 식물 (Phaseolus vulgaris 이력서. Calima가). 비율 식민지는 교양 섹션의 수로 나눈 식민지 식물 섹션의 수를 나타냅니다.

Discussion

많은 요소가 endophyte으로 곰팡이 entomopathogen를 구축 할 수있는 실험의 구체적인 결과에 영향을 미칠 수있다. 결과는 접종 방법이 그 중 하나입니다 보여줍니다. 과 실험 생물 요소는 작물 종이나 개량 품종 선택하고 곰팡이 entomopathogen 종 변형을 포함하거나 사용 격리. 조작 고려해야 할 다른 요소는 inoculum의 농도, 예방 접종 동안 식물의 연령, 식물의 성장 조건이 포함되어 있습니다.

이 곰팡이 entomopathogen ^{14,17,18,21하여} 체계적 식물의 식민지가 발생하는 접종 방법에 적합 할 것입니다. 대신, 접종 방법은 현지 식민지의 특정 패턴을 선호하는 경향이있는 것 같습니다. 토양 drenches 루트 식민지 ¹⁷ 선호하는 반면 커피에서 예를 들어, 잎 스프레이는 잎 식민지를 선호. 우리는 일반적으로 빈에서 동일한 패턴을 발견했다. 결국, 접종 방법의 선택은해야합니다아마 대상 herbivore 또는 식물 병원체의 틈새 시장을 일치 공장 내에서 endophyte의 의도 위치별로 안내.

미디어 문화에 따라 비록 일반적으로 사용되는, endophyte 감지 및 정량화는 비용이 많이 드는 어려운 및 오류 발생하기 쉬운 수 있습니다. 예를 들어, 10800 식물의 부분 (1,800 배양 접시에 도금)의 총 B.를 최적화하는 실험에서 평가 된 바나나 ¹⁶ bassiana 예방 접종. 이 중에 4,496 섹션은 putative B.에 의해 식민지되었습니다 bassiana는 등 주로 식민지의 형태에 의해 식별. 분명, 각 식민지의 종의 미세 인증은 바람직하지만 unaffordable 단계이었습니다. 한편, 1176 섹션은 다른 곰팡이에 의해 식민지되었으며 폐기 및 데이터 ⁽¹⁶⁾ 누락으로 처리되었다. 확률은 B. 그러나, 존재 bassiana는 가난한 경쟁이나 성장 속도가 느린이었고, 결국 그 섹션에서 부상 할 수있는 경우llowed 충분한 시간. 따라서, 미디어 문화에 따라 endophyte 감지 방법은 잘못된 반응과 거짓 네거티브 필름이 적용됩니다. 따라서, 예를 들어, 더 신뢰할 수있는 탐지 및 정량화 방법의 개발은 중합 효소 연쇄 반응 (PCR) assays ^20,21,24에 따라 사람들은 잘 정당화된다.

접종 실험의 궁극적 인 목표는 herbivory 및 / 또는 질병에 대한 내구성이 전신 저항을 제공하는 효율적인 치료를 개발해야합니다. 그럴듯하지만 아직까지는 untested, 가설은 endophytic 식민지의 범위는 endophyte로 인한 저항의 범위와 긍정적 인 상관 관계를해야한다는 것입니다. 접종 방법을 수정 한 후 자연 다음 단계는 않으므로,이 상관 관계를 조사 할 수 있습니다. 여러 비디오 프로토콜은 연구자 대상 해충이나 병원균 ^29-31에 적합한 저항 분석을 설계 할 수 있습니다. 궁극적으로, 그것은 inocula의 성공을 결정합니다 어떤이 검정입니다기 방법, 그리고 endophytic 생물학적 방제를위한 관련 가능성.

Disclosures

제작자들은 더 경쟁 금융 이익이 없다는 점 선언합니다.

Acknowledgments

생산 및 실험 작업은 여기 Reynaldo Pareja의 헌신적이고 열정적 인 도움을 반영 발표했다. 콜롬비아의 행정 과학학과, 기술과 혁신 (Colciencias)와 빌 & 그랜드 도전의 탐험 사업을 통해 멜린다 게이츠 재단의 교부금으로 운용.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number
Mycotrol SE	Laverlam	4167
Noble agar	Sigma	A5431-250G
Penicillin G sodium salt	Sigma	P3032-25MU
Petri dish (100 x 15 mm)	Fisher	08-757-12
Petri dish (60 x 15 mm)	Fisher	08-757-13A
Potato dextrose agar	Difco	213400
Regular bleach (NaOCl)	CLOROX	N/A
Streptomycin sulfate salt	Sigma	S6501-25G
Tetracycline	Sigma	T3258-25G
Triple quince (NPK)	ABOCOL	N/A
Triton X-100	Sigma	X-100
EQUIPMENT
Biological safety cabinet	NuAire	NU-425-600
Hemocytometer	Fisher	02-671-10
Leica DM LB microscope	Leica	N/A