Kvantitativ Multispectral Analys Efter Lysrör Tissue Trans för visualisering av Cell Origins, typer, och interaktioner

Summary

Komplexa vävnadsmassor, från organ till tumörer, består av olika cellulära element. Vi klar bidrag cellulära fenotyper inom en vävnad som använder multi-märkta fluorescerande transgena möss i kombination med multi immunofluorescens färgning följt av spektral unmixing att dechiffrera cell ursprung samt cellernas egenskaper baserade på proteinuttryck.

Abstract

Med en önskan att förstå bidragen från flera cellulära element för utvecklingen av en komplex vävnad, till exempel de många celltyper som deltar i regenerera vävnad, tumörbildning, eller vaskulogenes, vi utarbetat en flerfärgad celltransplantationsmodell för tumörutveckling i vilken cellpopulationer kommer från olika fluorescerande färgade reporter gen möss och transplanteras, engrafted eller injiceras i och kring en utveckling av tumör. Dessa färgade celler sedan rekryteras och införlivas i tumören stroma. För att kvantitativt bedöma benmärg härledda tumör stromaceller, transplanterade vi GFP uttrycka transgena hel benmärg in i dödligt bestrålade RFP uttrycka möss som godkänts av IACUC. 0ovarian tumörer som ortotopiskt injiceras i de transplanterade mössen exciderades 6-8 veckor efter inympning och analyserades för benmärgs markör av ursprung (GFP) samt markörer antikropp för att detektera tumörassocieratstroma med hjälp av multispektrala avbildningstekniker. Vi anpassade då en metod som vi kallar MIMicc-Multispectral Förhör av Multiplexad cellulära kompositioner, med hjälp av multispektrala unmixing av fluoroprobes att kvantitativt bedöma vilka märkta cellen kom från vilken start populationer (baserat på ursprungliga reporter gen etiketter), och som vår förmåga att unmix 4, 5 , 6 eller fler spektra per slide ökar, har vi lagt till ytterligare immunhistokemi i samband med cellhärstamningar eller differentiering för att öka precisionen. Använda programvara för att upptäcka co-lokaliserade multiplexade-fluorescerande signaler, tumör stromal populationer kan spåras, räknas och karaktäriseras utifrån markör färgning. ¹

Introduction

Förstå vävnadsutveckling och reparation är viktigt att belysa deltar cellkomponenter i sårläkning, ^2,3 regenerativ medicin, utvecklingsbiologi och tumörbiologi. Under omständigheterna reparation, många celltyper infiltrera omgivande mikromiljö till stöd i vaskularisering, ECM nedfall, spridning och omstrukturering vävnad. Cellulära faktorer och fenotyper kan identifieras utifrån multi, multiplexade markörer som kan identifiera lokaliseringen, differentieringsstatus och interaktion mellan cellkomponenter inom det undersökta mikromiljö. Häri beskriver vi tumörutveckling som en prototypiska exempel för denna multicolor-flercellig transplantationsmodell följt av multispektrala avbildning och spektral unmixing metodik.

Tumörprogression är en flerstegsprocess som präglas av flera förvärvade förmågor som inkluderar förbättrad spridning, enntiapoptotic, invasiva och angiogena egenskaper. ^fyra Tumör utveckling främjas av icke-neoplastiska celler som rekryteras till den omgivande miljön för att ge tillväxtfaktorer, strukturella matriser, vaskulära nätverk och immunmodulering. ^1,5,6 Denna microhabitat består av celler som härrör från lokal, angränsande vävnader såsom fett, och blodkärl och avlägsna källor såsom benmärg härledda celler ^1. Omfattningen av icke-neoplastisk cell inkorporering beror på efterfrågan från tumören, vilket ofta motsvarar scenen / grad av tumören. För att förstå betydelsen av tumören stödjande mikromiljö, måste man förstå ursprunget och differentieringspotentialen av de icke-neoplastiska cellpopulationer.

Detta protokoll har utformats för att hjälpa till vid tolkning av tumörprogression genom visualisering av både benmärg härledda cellkomponenter, och den lokala vävnads derived celler. Med hjälp av fluorescerande reporter gen-uttryckande transgena möss, transplanterade vi GFP (grönt fluorescerande protein) benmärg i ett dödligt bestrålat RFP (röd-fluorescerande protein) mus. Efter lyckad benmärgs engraftment, är en syngent tumörcellinjen injiceras orthotopically och får ympas i 4-8 veckor. Den resulterande tumören skärs ut från musen och bearbetades för immunofluorescens (IF)-färgning för att visualisera de stromala komponenter. Multiplexing IF markörer är en vanligt förekommande teknik som innebär betydande optimering ^7-9, men med hjälp av en multispektrala avbildning / unmixing plattform förbättrar potentialen för fluorescerande markörkombinationer som besitter spektral överlappning. Häri presenterar vi en teknik som vi kallar MIMicc-multispektrala förhör av Multiplexade cellulära kompositioner för att färga och analysera upp till åtta markörer inom en tumör avsnitt om en enda bild för att analysera de cellulära ursprung, celldifferentiering stparater och cell-cell interaktioner av komponenter inom tumormicroenvironmenten. Denna förenklade exempel har potential att byggas ut på för att analysera fem, sex eller fler markörer som använder antikroppar eller intracellulär promotor-driven fluorescerande uttryck. Tabell 1 listar potentiella fluorescerande antikroppsfärgnings kombinationer med lämpliga arter beaktas.

Protocol

Syngent Murina benmärgstransplantation (BMT) som har godkänts av institutionella IACUC protokoll (Obs: Framgång för detta protokoll kräver användning av det märkta celltyp (ar) som mål för multispektrala analys, och för att underlätta den efterföljande analysen, man kan utnyttja någon genetisk eller stabil cellmärkning. Vi föreslår att alla celler, vävnader eller organ-till-vara kan tillämpas på ett transplantationsmodell och att transplantationen kan innehålla så många unika märkta populationer som forskningen anser vara användbara. Dessutom har flera märkta cellulära system , såsom de som finns i transgena möss innehållande MLK restricted-fluorescerande populationerna-kan utformas för att eliminera transplantationskomplikationer för studiet av vissa patologiska tillstånd.

1. Dödligt bestråla BMT mottagande möss med en enda dos av 9,5 Gy fyra timmar före beredning med donator benmärg. (BMT GFP mottagare bör vara 6-10 veckors ålder).
2. Blöt musen päls med 70% etanol innan klippning och peeling tillbaka att exponera bakbenen med sterila kirurgiska sax. Ta bort hela benet med höftbenskammen på sakroiliakaleden. Kassera foten genom att skära strax ovanför vristen och sedan grundligt avlägsna all muskler, ligament och överskott av vävnad från ben. Spola märgen från tibia fibia och höftbenskammen med en 23 G-nål med användning av 2% steril FBS i PBS (PBS-2). (BMT RFP givare bör offras enligt lokala standarder.)
3. Skiva och försiktigt krossa återstående ben i fragment med hjälp av en skalpell och pincett och placera i 50 ml koniska rör med 3 | ig / ml kollagenas I under 1 h vid 37 ° C vid 300 rpm.
4. Toppa röret med PBS-2 och samla in supernatanten i ett nytt rör och kombinera med spolade celler. Centrifugera ner vid 250 rpm under 5 min vid 4 ° C.
5. Resuspendera cellerna i PBS-2 och filtrera genom 40 nm cellfiltret. Vid denna tidpunkt kan cellerna märkas för fluorescent aktiverad cellsortering (FACS) om man vill manipulera specifika befolkningar för BMT.
6. Resuspendera 2 x 10 ⁶ celler per 100 l PBS, per mus. Använd 29 G nål för att systemiskt injicera i bestrålade GFP recipientmöss med svans eller retroorbital ven-avfasning-side-up. Injicera en mus med 100 l PBS endast som engraftment kontroll. Använd en värmelampa för att dilatera kärlen före injektion och använda en injektion i svansvenen återhållsamhet vid injektion. Ha steril gasbinda finns att applicera lätt tryck på svansen efter injektion.
7. Tre veckor efter BMT, samla blod retroorbitalt och analysera genom flödescytometri för att bekräfta närvaron av GFP cirkulerande celler och frånvaro av RFP cirkulerande celler. Styr mus kommer att ha dött vid denna punkt.

2. Tumör Engraftment Enligt Institutionella IACUC riktlinjer

1. Väx ID8 äggstock murina tumörcellerna in vitro före in vivo-injektion (1 x 10 ⁶ calnar per mus). Dag för injektion, trypsinize celler, tvätta med PBS och återsuspendera i PBS vid 1 x 10 ⁶ celler per 100 pl.
2. Injicera tumörceller i intaperitoneal håligheten hos mus, bör nålen vara koniska sida upp. Sterilisera injektion syn med 70% etanol. Injicera i nedre vänstra eller nedre högra kvadranten av buken (kranial och något mediala till sämre uppsättning av buken bröstvårtor av kvinnlig mus), undvika att slå organen. Hindra musen genom att ta tag i nackskinnet och hålla svansen med lill eller ringfingret. Möss kan bedövades med isofluran för denna procedur.
3. Offra mössen när tecken på tumör engraftment, såsom svag uppblåsthet, är uppenbara. Detta kommer att ske under 4-12 veckor.
4. Punkt tumörer från IP hålighet. Tumörer i hålrummet kommer att se ut som vita knutor på och över hela ytan av organen. Med en skalpell, ta bort tumörer och placera i ett rör / burk på 10% formalin i 24 timmar fixering. Histologisk pgottgörelse kan vara utlagd på patologi / histologi kärna om reagens och material är inte lätt tillgänglig för paraffininbäddning och preparatet. Avsnitt vävnad i 5-8 ìm skivor på objektglas för efterföljande färgningsförfaranden.

3. Multi-parameter immunofluorescerande färgning

1. Förbered Enstaka färgkontrollglas för varje fluorescerande sond som används i försöket. I detta scenario är fyra färger används. Därför fyra bilder för varje enskild färg samt en bild för bakgrundsbuller och slutligen en bild för hela kombinationen färgning. (Totalt diabilder = 6) Alla diabilder kommer att behandlas sida vid sida på ett identiskt sätt för att minimera experimentell variation.
2. Grädda paraffinsnitt vid 56 ° C under 1 timme.
3. Tvätta diabilder 3x 10 minuter i xylen.
4. Tvätta 2x 5 min 100% etanol.
5. Tvätta 1x 3 min 95% etanol
6. Tvätta 1x 2 min90% etanol.
7. Tvätta 1x 2 min70% etanol.
8. Under den sista tvättn serien, före koka natriumcitratbuffert i 2 min (mikrovågsugn på hög). (Kan ersätta med Tris-EDTA-buffert beroende på antikropparna i bruk)
9. Koka glasen under 20 min i natriumcitratbuffert (mikrovågsugn på 10% effekt eller i en tryckkokare). Om bufferten kokar, stäng av mikrovågsugn och låt sitta.
10. Ta bort från värmekällan och låt glasen vila i 30 min i natriumcitratbuffert svalna.
11. Skölj objektglasen i vatten under 5 min.
12. Mark runt tumörsektioner med Pap-Pen och sätta 2% BSA / 1% FBS maleinsyra blockeringsbuffert under 1 timme. Förbereda bilderna för sig för att inte låta dem torka ut under detta steg.
13. Förbered primära antikroppar vid optimal utspädning i blockeringsbuffert. (Om antikropparna som används är alla av olika arter (eller IgG-kedja variation-ex: IgG1 vs IgG2a av samma art) kan de användas i kombination under såingle inkubationstid. Om arter antikroppslappar, då inkubationer måste ske stegvis för att minimera antikroppar korsreaktion.)
14. Vid denna punkt, lämnar två objektglas med bara blockeringsbuffert. Dessa två bilder kommer att fungera som ofärgade kontroll och nukleära fläck kontroll. De övriga enfärgade kontroller kommer att inkuberas med olika primära antikroppar. Endast den analys sliden kommer att ha en kombination av primära antikroppar.
15. Inkubera objektglasen med primär antikropp i en fuktkammare rutan på långsamt roterande shaker vid 4 ° över natten (~ 16-20 tim) (Obs: när du arbetar med 4 + fluoroforer, sekventiell färgning eller direkt konjugering kan vara nödvändigt för att minimera antikroppar korsreaktion . Under dessa omständigheter upprepa steg 1,16-1,21 tills alla antikroppar anbringas på objektglasen.)
16. Tvätta objektglasen under 10 min i PBST (2x) försiktigt på skakapparaten
17. Medan tvätten går, förbereda Alexafluor 488, 594 och 647 sekundära antikroppar för en slutlig spädav 1:1000 i blockerande buffert. (Se till att dessa antikroppar och späd förvaras vid 4 ° C och i mörker hela tiden för att bevara fluorescens mellan partier och över tid.)
18. På de enskilda färgkontrollglas, placera enstaka Alexafluor späd matchar de arter av den primära antikroppen används. Alla sekundära antikroppar kommer att placeras på en analys slide. De ofärgade och den nukleära färgade kontrollglas kommer att förbli med blockerande buffert under det här steget.
19. Inkubera i en fuktkammarboxen (täckt med aluminiumfolie för att förhindra exponering för ljus) på långsam roterande skakanordning vid rumstemperatur under 2 timmar.
20. Tvätta objektglasen i 5 min i PBST (2x) försiktigt på skak. Täck med aluminiumfolie för att skydda mot ljus.
21. Lägg DAPI (1:10,000) under 1 min till DAPI skyddad bild och analysobjektglaset. Täck med aluminiumfolie för att skydda mot ljus. De andra bilder kan lämnas upp i tvättbehållare.
22. Tvätta två DAPI ruvadebilder i en separat behållare för de första 5 min tvätt så att inte förorena de andra glider med DAPI fläcken. För det andra 5 min tvätt, kan bilderna kombineras i PBST (alla tvättar bör ske på en shaker). Täck med aluminiumfolie för att skydda mot ljus.
23. Kortfattat dip glasen i vatten innan locket-halka (1,5 tjocklek med vattenmonteringsmedia för att bevara fluorescens)
24. Låt torka 3 timmar i mörker vid rumstemperatur.
25. Täta kanterna på täckglas med nagelhärdare. (Använd inte nagellack som aceton kan släcka den fluorescerande signalen).
26. Analysera glasen omedelbart eller förvaras vid 4 ° C för framtida analys.

4. Multispekt

1. Collect multispektrala bilder som utnyttjar en Nuance EX kamera (som innehåller en flytande kristall avstämbart filter) på ett Olympus X-63 upprätt mikroskop med Nuance mjukvara för datainsamling.
2. Samla bilder med hjälp av en olje mål att öka upplösningen.
3. Initial set-up innehåller inställning spektralområdet för varje fluoroforen i bruk.
   1. För 4 färg:
      1. DAPI: 420-480nm
      2. AF488: 490-580 nm
      3. AF594: 590-640nm
      4. AF647: 650-720nm
4. Ta en första bild av den analys sliden för att erhålla de lämpliga exponeringstider för var och en av de spektrala områden.
5. Skapa "spektral bibliotek" att mjukvaran kommer att använda för att identifiera och separera förhållandet signal-till-brus av fluoroforema från varandra och bakgrundssignalen. (OBS: Varje fluorokrom måste ha sin egen enda färg reglaget för att sätta ihop en spektral bibliotek med lämpliga våglängdskurvor för att säkerställa korrekt analys av datamängden Exempel: 3 fluoroforer = 4 kontrollglas, 5 fluoroforer = 6 kontrollglas.).
   1. Bild den ofärgade glida först. Denna bild kommer att utses inom den spektrala library som bakgrund.>
   2. Bild DAPI-bara glida sekund. Denna bild kommer att användas för att beteckna de DAPI-färgade kärnor med "dra" verktyg och sparas i den spektrala bibliotek som DAPI.>
   3. Bild för AF488-bara glida tredjedel. Denna bild kommer att användas för att beteckna de AF488-färgade områden med "rita" verktyg och sparas i den spektrala bibliotek som AF488.>
   4. Bild för AF594-bara glida fjärde. Denna bild kommer att användas för att beteckna de AF594-färgade områden med "rita" verktyg och sparas i den spektrala bibliotek som AF594.>
   5. Bild för AF647-bara glida femte. Denna bild kommer att användas för att beteckna de AF647-färgade områden med "rita" verktyg och sparas i den spektrala bibliotek som AF647.>
   6. Efter insamling av varje enskild spektral komponent,spara den spektrala bibliotek och protokollet.>
6. När den spektrala biblioteket är klar, hitta områden av intresse på analysen glida på mikroskopet och hämta / spara bilder.>

5. Kvantitativ analys av Multispectral bilder

1. Importera ett representativt urval av förvärvade Nuance bilder med hjälp InForm programvara.
2. Öppna den sparade spektral bibliotek enligt anvisningar från programmet
3. Identifiera vävnads områden av intresse som skall analyseras. (T.ex. tumörvävnad kontra fettvävnad).
4. Identifiera individuella celler baserat på DAPI-fläck. Cytoplasma kommer att definieras automatiskt baserat på formen av kärnan.
5. Plocka fluorescensintensiteten avläsning av val för varje fluorescerande parameter (t.ex. medelvärde, standardavvikelse)
6. Batch det förvärvade bilder och låta programmet processen med hjälp av den föreslagna algoritmen.
7. När bildbehandlingen är slutförd, slås sammanresultatfiler.
8. Öppna resultat i Excel (eller någon annan analytisk mjukvara) och rita två fluorescensintensiteter mot varandra på XY-axeln. Varje fluorescensintensiteten ges per cell. De dubbla positiva celler visas i den övre högra kvadranten. Användaren måste definiera baslinjen fluorescensintensiteter.

Representative Results

Med hjälp av en multispektrala bildteknik för att analysera tumörer engrafted i vår transgena BMT musmodell, kan vi urskilja stromal tumör komponenter som är av benmärgs ursprung. Den initiala BMT bekräftades tre veckor efter transplantation genom flödescytometri (figur 1). Orthotopically injicerade omärkta äggstockstumörer efter BMT transplantations bekräftelser skars ut och formalin fast 6 veckor efter initial tumörinjektion. Paraffin inbäddad tumörsektioner snittades i <8 ìm skivor och färgas. Lämpliga enstaka färgkontrollglas gjordes för varje fluoroforen inklusive en för bakgrunden autofluorescens. Tabell 1 omfattar potentiella specie och fluorokroma kombinationer för 2-7 parametrar. Efter färgningsproceduren ades bilder förvärvats med hjälp av en Nuance kamerafäste och Nuance programvara. När du har skapat en spektral bibliotek med enstaka färgkontrollglas (Figur 2A), vi were kunna "unmix" bilderna av flera märkta äggstockstumörsektioner som är tagna som visar uttryck av GFP (Antibody # 1) tillsammans med kärn-DAPI och två andra markörer (antikroppar # 2 och # 3). (Figur 2B) Tillägg av flera markörer är möjligt och figurerna 2C-D visar bilden av en tumör sektion med sex markörer plus en nukleär fläck. Slutligen har samtliga förvärvade importeras bilderna till InForm (CaliperLS, Hopkinton, MA) mjukvara för analys. Nuance (CaliperLS, Hopkinton, MA) mjukvara är kompatibel med andra paket som metamorfa (Molecular Devices) eller IPLab (Scanalytics, BD Biosciences). Dessutom kan bilder och spektrala dataset även sparas som TIFF-filer och visas i alla program som läser detta filformat. Använda InForm Programvara, kunde vi klassificera de vävnadsområden av intresse inom tumörsektioner (figurerna 3A och E) och ställa in algoritmer för de fluorescerande intensiteter av varje fluorokrom per cell-based på DAPI nukleära fläcken (figur 3B-C). Slutligen kunde vi rita varje enskild cell baserat på de fluorescerande intensiteter av två markörer, AF488 och AF647 (Figur 3D). Vi etablerade en dubbel positiv cellpopulation baserat på en bestämd fluorescerande intensitetströskel (Figur 4). Eftersom datamängden blir mer komplicerad med flera parametrar, det finns potential för de uppgifter som ska analyseras med SPADE programvara ¹⁰ (sträcker-trädet progression analys av densitet normaliserade händelser), även om detta ännu inte utförts. Denna programvara gör det möjligt för visualisering av sam-uttryck trender över stora datamängder och kan innebära föreningens / relationer mellan kluster av co-uttryckta markörer inom analyserade vävnadssnitt.

Tabell 1. Immunofluorescerande färgning kontroll förberedelse för 2-7 färg multiplex färgning. (A) Innehåller upp till fyra färgalternativ. (B) (C) innehåller sju färgalternativ inom det synliga ljuset.

Figur 1. Benmärgstransplantation bekräftelse med flödescytometri. (A)-plotten av den cirkulerande hematopoetiska celler befolkningen inom GFP transgena mottagare mus som är positiv (B) för RFP + hematopoietiska celler jämfört med kontroll RFP + och styra GFP + möss och negativa (C) för GFP + celler.

Figur 2. Spektralt oblandad image process. (A) (B) Multispektrala bild en mus äggstockstumör avsnitt visar fluorescerande celler, # 1: AF488 (ex 495 nm / em 510 nm), # 2 : AF594 (ex590/em617 nm), # 3: AF647 (ex 650/em 668 nm) och kärn: DAPI (ex 350/em 470 nm). Enkla färger visas i vitt (C) Skärmdump på 7 färgspektrala bibliotek skapas för analysen av äggstockstumörsektioner (D) Multispektrala bild en mus äggstockstumör avsnitt visar fluorescerande celler, kärn:.. DAPI (ex350/em470 nm ), AF488 (ex 495/em 519 nm), AF514 (ex518/em540 nm), AF568 (fd 578/em 603 nm), AF594 (fd 590/em 617 nm), AF633 (fd 632/em 647 nm); AF660 (fd 663/em 690 nm) och. Enkla färger visas i vitt samt matchande sammansatta färg. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 3. MIMicc Avbildningar av kvantitativ Informera analys. (A) Första bilden föreställer klassificeringen av vävnadssegment följt av (B) segmentering av cellerna som bygger på kärn färgas DAPI. (C) Kvantifiering av fluorescerande etikett kan mätas i kärnan och cytoplasman och exporteras till (D) Excel för ytterligare analys. (E) Vävnaden segmente algoritm är i stånd att ytterligare identifiera vävnads subtyper baserat på vävnadsarkitektur och inte enbart på fluorokrom identifiering som ger en mer robust analytiskt verktyg för att klassificera färgning i distinkta vävnadsområden. I denna bild, har datorn fått utbildning i att identifiera fem delregioner utifrån Architectural mönster i vävnaden: bakgrund definieras av tomt utrymme, är hemolytisk tumör definieras av överflöd av röda blodkroppar i vävnaden, är tumör definieras av tätbefolkade celler, är fett definieras av stora, symmetriska, tomma cellulära fack, och muskler är definieras av ett räfflat mönster. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 4. Tomt på enskilda celler från 20 förvärvade bilder visar de dubbla positiva celler baserat på fluorescensintensiteter av GFP märkta med AF488 och αSMA märkta med AF647.

Kompletterande dokument. Tips och tricks för Multiplexing 5 eller fler sonder.

Discussion

Häri beskriver vi tillämpningen av multispektrala avbildning vi beskriver som MIMicc-multispektral förhör av Multiplexad cellulära kompositioner, för att analysera de benmärg härledda stromaceller komponenterna tumormicroenvironmenten emellertid denna metod och koncept kan appliceras på dechiffrera andra cellulära element som utgör en komplex vävnader, såsom de som ses under sårläkning reaktioner eller under en regenerativ vävnad. I dessa experiment använder vi transgena möss för att fluorescens särskilja benmärgs härledda celler från värden härledda celler inom ett engrafted tumormicroenvironmenten emellertid denna teknik lämpar sig för användning av någon reportergen märkta celler, och är särskilt kan ändras till celler som uttrycker genprodukter etiketter som kan lätt urskiljas med immunhistokemi, såsom LacZ, glukuronidas, His (6X) -, HA, FLAG-tag-märkta celler, etc. ^11.

I vår modell efteroffer av transplanterade möss, var tumörsektioner behandlas och färgas med antikroppar för att identifiera ursprunget av cellen, RFP + benmärgsdonator kommer eller GFP + värdvävnad. I figur 2 visar vi två markörer samuttrycker med värd härledd GFP + celler inom tumormicroenvironmenten. Emellertid visar vi potentialen för sju färg färgning med användning av samma system i figur 2D.

Dessa data är en representation av det som är i stånd att utnyttja vår transplantation och multispektrala avbildningsmodell. Systemet är mycket flexibelt och kan rymma ytterligare parametrar, bland annat: 1-förändrade BMT populationer / transgena musmodeller, 2-alternativa modeller tumör / sjukdom, eller 3-alternativa markörer (t.ex. yta, intracellulär, fosfonotio-proteiner). Vanligtvis, med allt fler immunhistokemiska fläckar på samma glas, blir dataanalys mödosam, men med hjälp av en multispekt plattformar och intressebolagförbundna unmixing programvara möjliggör effektiva, tillförlitliga och reproducerbara resultat. Vi tillhandahåller potentiella species antikropp och fluorescerande märkningskombinationer som anges i tabell 1. Dessutom möjliggör denna teknik för mångsidighet i urvalet sond / antikropp på grund av risken för att använda både frysta och paraffininbäddade vävnadssnitt som gör denna teknik gäller för kliniska vävnadsprover förutom grundläggande forskningsmodeller.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
.2 μm filter	Fisher	09-740-35A
10 ml lure lock	BD	309604
25 G needle	Cardinal	BF305122
40nm filter	BD	352340
50 ml conical tube	Fisher	1495949A
Alexafluor 488-ms1	invitrogen	A21121
Alexafluor 594-Rb	invitrogen	A21207
Alexafluor 647-ch	Invitrogen	A21449
BSA	Sigma	A7906-500G
Cover slips	Corning	2940-243
CRI-Nuance	Caliper Life Sciences
Dapi	Invitrogen	D1306
DMEM	CellGro	10-017-CV
Ethanol	Dharmacon	4004-DV
FBS	invitrogen	16000-044
GFP-ms1	Abcam	ab38689
Insulin needle	BD	329424
Maleic acid	Acros	100-16-7
Moisture chamber box	Evergreen	240-9020-Z10
Mounting media	dako	S3023
Nail hardener	Sally Hansen	2103
Pap pen	Abcam	Ab2601
Pen/Strep L Glut	invitrogen	10378016
Steril PBS	invitrogen	14040-182
Trypsin	invitrogen	252000-56
Blocking Buffer maleic acid 14.51 g NaCl 10.95 g NaOH pellets (to 7.5pH) 9+g Distilled water 250 ml *add 0.2% Tween-20 to 1x solution for blocking buffer with 2%BSA/2%FBS. Stir and filter. Antigen retrieval buffers: Tris-EDTA Buffer (10 mM Tris Base, 1 mM EDTA Solution, 0.05% Tween 20, pH 9.0) Tris Base 1.21 g EDTA 0.37 g Distilled water 1000 ml (100 ml to make 10x, 50 ml to make 20x) Tween 20 0.5 ml *Store at RT for 3 months or at 4 ° C for longer Sodium Citrate Buffer (10 mM Sodium Citrate, 0.05% Tween 20, pH 6.0) Tri-sodium citrate (dihydrate) 2.94 g Distilled water 1000 ml HCl (adjust pH to 6.0) 1N Tween 20 0.5 ml