Kvantitative Multispektral Analyse Efter Fluorescent Tissue Transplant til visualisering af Cell Origins, typer, og interaktioner

Summary

Komplekse væv masserne, fra organer til tumorer, er sammensat af forskellige cellulære elementer. Vi belyst bidrag cellefænotyper indenfor et væv udnytte multi-mærkede fluorescerende transgene mus i kombination med multiparameter immunfluorescensfarvning efterfulgt af spektral unmixing at dechifrere celle oprindelse samt celle egenskaber baseret på protein udtryk.

Abstract

Med ønsket om at forstå bidragene af multiple cellulære elementer for udviklingen af ​​et komplekst væv, såsom de talrige celletyper, der deltager i regenererende væv tumordannelse eller vaskulogenese vi udtænkt en flerfarvet cellulær transplantation model af tumorudvikling i som cellepopulationer stammer fra forskellige fluorescens farvede reportergenassays mus og er transplanteret, indpodet eller injiceres i og omkring et udviklingsland tumor. Disse farvede celler bliver derefter rekrutteret og indarbejdet i tumorstroma. For at kvantitativ vurdering knoglemarv afledte stromale tumorceller, vi transplanterede GFP udtrykke transgene hel knoglemarv ind i dødeligt bestrålede RFP udtrykker mus som er godkendt af IACUC. 0ovarian tumorer, der blev orthotopisk injiceret i transplanterede mus blev udskåret 6-8 uger efter transplantation og analyseret for knoglemarv markør for oprindelse (GFP) samt antistofmarkørerne at detektere tumorassocieretstroma hjælp multispektrale billeddannelse teknikker. Vi derefter tilpasset en metode vi kalder MIMicc-Multispektral Interrogation af Multipleksede cellulære kompositioner, ved hjælp af multispektrale unmixing af fluoroprobes til kvantitativt vurdere, hvilke mærket celle kom fra, hvilke start befolkninger (baseret på originale reportergenassays etiketter), og som vores evne til at unmix 4, 5 , 6 eller flere spektre per dias stiger, har vi tilføjet ekstra immunhistokemi forbundet med celleafstamninger eller differentiering for at øge præcision. Udnytte software til at registrere co-lokaliserede multiplexede-fluorescerende signaler, tumor stromale befolkninger kan spores, opregnede og karakteriseret baseret på markør farvning. ^1.

Introduction

Forståelse væv udvikling og reparation er væsentligt at belyse deltagende cellulære komponenter i sårheling, ^2,3 regenerativ medicin, udviklingsmæssige biologi og tumor biologi. Under omstændighederne i reparation, mange celletyper infiltrere det omgivende mikromiljø til støtte i vaskularisering, ECM deposition, spredning og omstrukturering væv. Cellulære faktorer og fænotyper kan identificeres på grundlag af multiparameter, multiplex markører, der kan identificere lokaliseringen, differentiering status og samspil mellem cellulære komponenter i undersøgte mikromiljø. Heri beskriver vi tumor udvikling som et prototypisk eksempel på denne flerfarvet-flercellede transplantation model efterfulgt af Multispektralbilledteknik og spektral unmixing metodologi.

Tumorprogression er en flertrins proces, der er præget af flere erhvervede funktioner, der omfatter forbedret spredning, enntiapoptotic invasive og angiogene egenskaber. ^4. Tumor udvikling fremmes af ikke-neoplastiske celler, der rekrutteres til det omgivende miljø for at tilvejebringe vækstfaktorer, strukturelle matricer, vaskulære netværk og immunmodulation. ^1,5,6 Denne microhabitat består af celler, der stammer fra lokale, tilstødende væv, såsom fedt og blodkar og fjerne kilder såsom knoglemarv afledte celler ^1. Omfanget af ikke-neoplastisk celle inkorporering afhænger af efterspørgslen fra tumor, der ofte svarer til trin / karakteren af ​​tumor. For at forstå den rolle, tumor støttende mikromiljø, må man forstå oprindelsen og differentiering potentiale af de ikke-neoplastiske cellepopulationer.

Denne protokol er blevet designet til at støtte i fortolkningen af ​​tumor progression gennem visualisering af både knoglemarv afledte cellulære komponenter, og den lokale væv derived celler. Utilizing fluorescerende reportergenassays-udtrykkende transgene mus vi transplanterede GFP (grønt fluorescerende protein) knoglemarv i en letalt bestrålet RFP (rødt fluorescerende protein) mus. Efter en vellykket knoglemarv transplantation, er en syngen tumorcellelinje injiceres orthotopisk og lov til at indpode i 4-8 uger. Den resulterende tumor udskæres fra musen og forarbejdet til immunfluorescens (IF) farvning at visualisere stromale komponenter. Multiplexing IF markører er en almindeligt anvendt teknik, der involverer væsentlig optimering ^7-9, men ved hjælp af en Multispektralbilledteknik / unmixing platform forbedrer mulighederne for fluorescerende markør kombinationer, der besidder spektral overlapning. Heri præsenterer vi en teknik, vi kalder MIMicc-multispektral forhør af Multipleksede cellulære kompositioner at plette og analysere op til otte markører i en tumor sektion på et enkelt dias for at analysere de cellulære oprindelse, cellulær differentiering strater og celle-celle interaktioner af komponenter i tumor mikromiljø. Denne forenklede eksempel har potentialet til at blive udbygget med henblik på at analysere fem, seks eller flere markører udnytte antistoffer eller intracellulære promotordrevet fluorescerende udtryk. Tabel 1 viser potentielle fluorescerende antistoffarvning kombinationer med passende arter tages i betragtning.

Protocol

Syngene murine knoglemarvstransplantation (BMT), som er godkendt af institutionelle IACUC protokoller (Bemærk: Succes for denne protokol kræver udnyttelse af enhver mærket celletype (r) som mål for multispektrale analyse, og for at lette den efterfølgende analyse, kan man udnytte enhver genetisk eller stabil cellulær mærkning. Vi foreslår, at enhver celle, væv eller organ-til-være kan anvendes til en transplantation model og at transplantationen kan indeholde så mange unikke mærkede populationer forskning finder nyttige. Derudover multi-mærkede cellulære systemer , som dem der findes i transgene mus, der indeholder flere slægt med begrænset fluorescensmærket populationer-kan designes til at eliminere transplantation komplikationer til undersøgelse af visse patologiske tilstande.

1. Dødeligt bestråle BMT recipientmus med en enkelt dosis på 9,5 Gy fire timer, inden rekonstitution med donor knoglemarv. (BMT GFP modtagere bør være 6-10 ugers alderen).
2. Fugt mus pels med 70% ethanol før klipning og peeling det tilbage for at blotlægge bagbenene med sterile kirurgiske saks. Fjern hele benet inklusive hoftebenskammen på bækkenet. Kassér foden ved at skære lige over anklen og derefter grundigt fjerne alle muskler, ledbånd og overskydende væv fra knogle. Skyl marv fra skinnebenet fibia og hoftebensranden med en 23 G nål under anvendelse af 2% sterile FBS i PBS (PBS-2). (BMT RFP donorer skal ofres i henhold til de institutionelle normer.)
3. Slice og forsigtigt knuse de resterende knogle i fragmenter ved hjælp af en skalpel og pincetter, og derefter anbringes i 50 ml koniske rør med 3 ug / ml collagenase I i 1 time ved 37 ° C ved 300 rpm.
4. Top fra rør med PBS-2 og samle bundfald i en frisk rør og kombinere med blussende celler. Spin ned ved 250rpm i 5 minutter ved 4 ° C.
5. Resuspendér celler i PBS-2 og filtreres gennem 40 nm celle filter. På dette punkt kan cellerne være mærket fluorescent cellesortering (FACS), hvis man ønsker at manipulere specifikke befolkningsgrupper for BMT.
6. Resuspender 2 x 10 ⁶ celler pr 100 ul PBS, per mus. Brug 29 G kanyle til systemisk tilføre bestrålede GFP recipientmus med hale eller retro-orbital vene-fas-side-up. Injicer en mus med 100 ul PBS kun engraftment kontrol. Brug en varmelampe til at udvide fartøjer før injektion og bruge en haleveneinjektion tilbageholdenhed ved injektion. Har steril gaze til rådighed for et let tryk til halen efter injektion.
7. Tre uger efter BMT indsamle blod retro-orbitalt og analysere ved flowcytometri for at bekræfte tilstedeværelsen af ​​GFP cirkulerende celler og fraværet af RFP cirkulerende celler. Styringen mus vil være døde på dette punkt.

2. Tumor Anslag af transplantatet Ifølge Institutionelle IACUC Retningslinjer

1. Grow ID8 æggestokkene murine tumorceller in vitro før in vivo injektion (1 x 10 ⁶ calen per mus). Day of injektion, Trypsinisér celler, vask med PBS og resuspender i PBS ved 1 x 10 ⁶ celler pr 100 gl.
2. Injicere tumorceller i intaperitoneal hulrum på musen, skal nålen være bevel side opad. Sterilisere injektion syn med 70% ethanol. Injicere i nederste venstre eller nederste højre kvadrant af maven (kranie og lidt medialt for den ringere sæt af abdominale brystvorter af hunmus), undgå at ramme organerne. Begrænse musen ved at snuppe ved harmoniske og holde halen med Pinky eller ringfinger. Mus kan bedøves med isofluran til denne procedure.
3. Sacrifice musene når tegn på tumor transplantation, såsom svag abdominal oppustethed, er tydelige. Dette vil ske mere end 4-12 uger.
4. Forbrugsafgifter tumorer fra IP hulrum. Tumorer i kammeret vil ligne hvide knuder på og omkring overfladen af ​​organer. Med en skalpel fjerne svulster og placere i et rør / krukke med 10% formalin i 24 timer fiksering. Histologisk pReparationen kan udliciteres til patologi / histologi kerne hvis reagenser og materialer er ikke let tilgængelige for paraffinfiksering og slide forberedelse. Afsnit væv i 5-8 um skiver på objektglas for efterfølgende farvningsprocedurer.

3. Multi-parameter immunfluorescensfarvning

1. Forbered Single farve kontrol dias til hver fluorescerende probe udnyttes i eksperimentet. I dette scenario, er fire farver anvendes. Derfor fire dias for hver enkelt farve samt en slide for baggrundsstøj kontrol og endelig en slide for den fulde kombination farvning. (Total dias = 6) Alle slides vil blive behandlet side om side i en identisk måde at minimere eksperimentel variation.
2. Bag paraffinsnit ved 56 ° C i 1 time.
3. Vask slides 3x 10 min i xylen.
4. Vask 2x 5 min 100% ethanol.
5. Vask 1x 3 min 95% ethanol
6. Vask 1x 2 min90% ethanol.
7. Vask 1x 2 min70% ethanol.
8. Under den sidste vask serien, præ-kog natriumcitrat-puffer i 2 min (mikrobølgeovn på høj). (Kan erstatte med tris-EDTA-buffer, afhængigt af antistofferne i brug)
9. Kog dias i 20 min i natriumcitratbuffer (mikrobølgeovn på 10% effekt eller i en trykkoger). Hvis buffer koger, slukkes mikroovn og lad det sidde.
10. Fjern fra varmekilden og lad objektglassene hvile i 30 min i natriumcitratbuffer at køle ned.
11. Skyl objektglassene i vand i 5 min.
12. Mark omkring tumor sektioner med Pap Pen og sætte 2% BSA / 1% FBS maleinsyre blokerende buffer i 1 time. Forbered dias enkeltvis for ikke at lade dem tørre ud i løbet af dette trin.
13. Forbered primære antistoffer ved optimal fortynding i blokerende buffer. (Hvis antistofferne i brug er alle af forskellige arter (eller IgG kæde variation-ex: IgG1 vs IgG2a af samme art), kan de anvendes i kombination i løbet af såingle inkubationsperioden. Hvis antistofarter overlapper hinanden, så inkubationer skal udføres sekventielt til antistof krydsreaktion minimere.)
14. På dette tidspunkt forlader to dias med kun blokeringsbuffer. De to dias skal fungere som uplettet kontrol og kontrol med nukleare pletten. De andre ensfarvede kontroller vil blive inkuberes med individuelle primære antistoffer. Kun analysen slide vil have en kombination af primære antistoffer.
15. Inkuber slides med primær antistof i en fugt kammer boks på langsomt roterende rysteapparat ved 4 ° natten over (~ 16-20 timer) (Bemærk: når du arbejder med 4 + fluorophores, sekventiel farvning eller direkte konjugering kan være nødvendigt at antistof krydsreaktion minimere . Under disse omstændigheder gentage trin 1,16-1,21 indtil alle antistoffer anvendes på dias.)
16. Vask slides i 10 min i PBST (2x) forsigtigt på shaker
17. Mens vask går, forberede AlexaFluor 488, 594 og 647 sekundære antistoffer til en endelig fortyndingaf 1:1000 i blokerende buffer. (Sørg for, at disse antistoffer og fortyndinger holdes på 4 ° C og i mørke på alle tidspunkter for at bevare fluorescens tværs partier og over tid.)
18. På de enkelte farve kontrolglas placere single AlexaFluor fortyndinger matcher arter af det primære antistof anvendes. Alle sekundære antistoffer vil blive placeret på analysen dias. De ufarvede og nukleare farvede kontrol slides vil forblive med blokerende buffer i hele dette trin.
19. Inkuber i en fugt kammer kasse (dækket med aluminiumsfolie for at undgå udsættelse for lys) på langsom roterende rysteapparat ved stuetemperatur i 2 timer.
20. Vask slides i 5 min i PBST (2x) forsigtigt på shaker. Dæk med aluminiumfolie for at beskytte mod lys.
21. Tilføj DAPI (1:10.000) i 1 min til DAPI kun slide og analysen dias. Dæk med aluminiumfolie for at beskytte mod lys. De andre dias kan efterlades dækket i vaske containere.
22. Vask to DAPI-inkuberedeglider i en separat beholder for de første 5 min vask til ikke forurene andre dias med DAPI-farvet. For den anden 5 min vask dias kan kombineres i PBST (bør gennemføres alle vaske på et rysteapparat). Dæk med aluminiumfolie for at beskytte mod lys.
23. Kortvarigt dipslides i vand før cover-udskridning (1,5 tykkelse med vandige monteringsmuligheder medier for at bevare fluorescens)
24. Lad tørre 3 timer i mørke ved stuetemperatur.
25. Forsegle kanterne af dækglasset med neglehærder. (Brug ikke neglelak, da acetone kan slukke det fluorescerende signal).
26. Analyser slides straks eller opbevares ved 4 ° C for fremtidig analyse.

4.. Multispektralbilledteknik

1. Saml multispektrale billeder udnytte en Nuance EX-kamera (indeholdende en flydende krystal tunable filter) på et Olympus X-63 opretstående mikroskop med Nuance software til dataindsamling.
2. Saml billeder ved hjælp af en objektiv olie til at øge opløsningen.
3. Inil opsætning inkluderer indstilling spektralområde for hver fluorofor i brug.
   1. For 4 farve:
      1. DAPI: 420-480nm
      2. AF488: 490-580 nm
      3. AF594: 590-640nm
      4. AF647: 650-720 nm
4. Tag en indledende billede af analysen slide for at opnå den korrekte eksponering gange for hver af de spektrale områder.
5. Opret "spektral bibliotek" at softwaren vil bruge til at identificere og adskille signal-til-støj-forhold på fluoroforerne fra hinanden og baggrund signal. (Bemærk: Hver fluorchrom skal have sin egen enkelt dias farve kontrol for at samle en spektral bibliotek med passende bølgelængde kurver for at sikre en ordentlig analyse af datasættet Eksempel: 3 fluoroforer = 4 kontrolglas, 5 fluoroforer = 6 kontrol dias.).
   1. Billede den ufarvede slide først. Denne slide vil blive udpeget inden for den spektrale library som baggrund.>
   2. Billede DAPI kun glide sekund. Denne slide vil blive brugt til at udpege de DAPI-farvede kerner med "tegne" værktøj og vil blive gemt i den spektrale biblioteket som DAPI.>
   3. Billede af AF488-kun glide tredjedel. Denne slide vil blive brugt til at udpege de AF488-farvede områder med "trække" værktøj og vil blive gemt i den spektrale biblioteket som AF488.>
   4. Billede af AF594-kun glide fjerde. Denne slide vil blive brugt til at udpege de AF594-farvede områder med "trække" værktøj og vil blive gemt i den spektrale biblioteket som AF594.>
   5. Billede af AF647-kun glide femtedel. Denne slide vil blive brugt til at udpege de AF647-farvede områder med "trække" værktøj og vil blive gemt i den spektrale biblioteket som AF647.>
   6. Efter samling af de enkelte spektrale komponentgemme den spektrale bibliotek og protokollen.>
6. Når den spektrale bibliotek er færdig, finde regioner af interesse på analysen slide på mikroskopet og indsamle / gemme billeder.>

5.. Kvantitativ analyse af Multispektrale billeder

1. Importer et repræsentativt udvalg af erhvervede Nuance billeder ved hjælp InForm Software.
2. Åbn den gemte spektral bibliotek som anvist af programmet
3. Identificer væv områder af interesse, der skal analyseres. (F.eks tumorvæv versus fedtvæv).
4. Identificere individuelle celler baseret på DAPI-pletten. Cytoplasma vil blive defineret automatisk baseret på formen af ​​kernen.
5. Pick den fluorescerende intensitet udlæsning af valg for hver fluorescerende parameter (fx middelværdi, standardafvigelse)
6. Batch den erhvervede billeder, og lade softwaren proces ved hjælp af den foreslåede algoritme.
7. Når billedet behandlingen er færdig, fusionereresultatet filer.
8. Åbn resultater i Excel (eller enhver anden analytisk software-pakke) og plot to fluorescerende intensiteter mod hinanden på XY akse. Hver fluorescensintensitet gives per celle. De dobbelte positive celler vises i øverste højre kvadrant. Brugeren skal definere baseline fluorescerende intensiteter.

Representative Results

Ved hjælp af en Multispektralbilledteknik teknik til at analysere tumorer transplanteret i vores transgene BMT musemodel, vi er i stand til at skelne stromal tumor komponenter, der er knoglemarv oprindelse. Den oprindelige BMT blev bekræftet tre uger efter transplantationen ved flowcytometri (figur 1). Orthotopisk injicerede umærkede æggestokkræft efter BMT engraftment bekræftelser blev udskåret og fikseret i formalin 6 uger efter første tumor injektion. Paraffinindlejret tumorsnit blev snittet i <8 um skiver og farves. Passende enkelt farve kontrolglas blev foretaget for hver fluorofor herunder en for baggrunden autofluorescens. Tabel 1 indeholder potentiel specie og fluorokrom kombinationer for 2-7 parametre. Efter farvning procedure, blev billederne erhvervet ved hjælp af en Nuance kamera udlæg og Nuance Software. Efter oprettelse af en spektral bibliotek med enkelt farve kontrolglas (figur 2A), vi wførend stand til at "unmix" billeder af multi-mærkede ovarietumor sektioner, der blev taget som viser ekspression af GFP (Antibody # 1) sammen med nukleart DAPI og to andre markører (antistoffer # 2 og # 3). (Figur 2B) Tilsætning af flere markører er muligt og figur 2C-D viser et billede af en tumor sektion med seks markører plus en nuklear farvning. Endelig blev alle erhvervede billeder, der importeres til InForm (CaliperLS, Hopkinton, MA) software til analyse. Nuance (CaliperLS, Hopkinton, MA) software er kompatibel med andre pakker gerne MetaMorph (Molecular Devices) eller IPLab (Scanalytics, BD Biosciences). Desuden kan billeder og spektrale datasæt også blive gemt som TIFF-filer og ses i ethvert program, der læser dette filformat. Brug af InForm Software, var vi i stand til at klassificere vævsregioner af interesse inden for tumorsnit (figur 3A og E) og indstille algoritmer til de fluorescerende intensiteter af hver fluorokrom per celle based på DAPI nuklear farvning (figur 3B-C). Endelig var vi i stand til at plotte den enkelte celle er baseret på fluorescerende intensiteter af to markører, AF488 og AF647 (figur 3D). Vi har etableret en dobbelt positiv cellepopulation baseret på en bestemt fluorescensintensitet tærskel (figur 4). Da datasættet bliver mere kompliceret med flere parametre, er der potentiale for data, der skal analyseres ved hjælp SPADE software ¹⁰ (spanning-tree progression analyse af densitet normaliserede hændelser), selv om dette endnu ikke er udført. Denne software gør det muligt at visualisering af co-ekspression tendenser over store datasæt og kan indebære forening / relationer mellem klynger af co-udtrykte markører i analyserede vævssnit.

Tabel 1. Forberedelse immunfluorescensfarvning styring til 2-7 farve multiplex farvning. (A) omfatter op til en fire-farve option. (B) (C) omfatter en syv farveindstilling inden for det synlige lysspektrum.

Figur 1. Knoglemarvstransplantation bekræftelse ved flowcytometri. (A) Dot plot af cirkulerende hæmatopoietiske celler befolkning inden for GFP transgene modtager mus, som er positiv (B) for RFP + hæmatopoietiske celler i forhold til at styre RFP + og kontrollere GFP + mus og negative (C) for GFP + celler.

Figur 2. Spektralt ublandet billede proces. (A) (B) Multispektral billede en murin ovarietumor afsnit, der viser fluorescens-mærkede celler # 1: AF488 (tidl. 495 nm / em 510 nm) # 2 : AF594 (ex590/em617 nm) # 3: AF647 (tidl. 650/em 668 nm) og nuklear: DAPI (tidl. 350/em 470 nm). Enkelte farver er vist i hvid (C) Screenshot af 7 farver spektrale bibliotek skabt til analyse af æggestokkene tumorsnit (D) Multispektral billede en murin ovarietumor, som viser fluorescens-mærkede celler; nuklear:.. DAPI (ex350/em470 nm ) AF488 (tidl. 495/em 519 nm) AF514 (ex518/em540 nm) AF568 (tidl. 578/em 603 nm) AF594 (tidl. 590/em 617 nm) AF633 (tidl. 632/em 647 nm); AF660 (tidl. 663/em 690 nm) og. Enkelte farver er vist i hvid samt matchende sammensatte farve. Klik her for at se større figur .

Figur 3. MIMicc Afbildning af kvantitativ Inform analyse. (A) Første billede repræsenterer klassificering af vævssegmenter efterfulgt af (B) segmenteringen af celler baseret på nuklear farves DAPI. (C) kan måles kvantificering af fluorescerende mærke i kernen og cytoplasmaet og eksporteres til (D) Excel for yderligere analyse. (E) Vævet segmentering algoritme er i stand til yderligere at identificere væv undertyper baseret på vævsarkitektur og ikke udelukkende på fluorochrom identifikation, som giver en mere robust analytisk værktøj til at klassificere farvning i forskellige vævsområder. I dette billede, er computeren blevet uddannet til at identificere 5 underområder baseret på architectural mønstre i vævet: baggrunden er defineret af blank plads, er hæmolytisk tumor defineret ved overflod af røde blodlegemer i væv, tumor defineret ved tætbefolkede celler er fedt defineret af store, symmetriske, tomme cellulære rum, og musklerne er defineret af et stribet mønster. Klik her for at se større figur .

Figur 4.. Plot af individuelle celler fra 20 erhvervede billeder viser dobbelt positive celler baseret på fluorescerende intensiteter af GFP mærket med AF488 og αSMA mærket med AF647.

Supplerende dokument. Tips og tricks til Multiplexing 5 eller flere sonder.

Discussion

Heri beskriver vi anvendelsen af ​​Multispektralbilledteknik vi betegner som MIMicc-multispektral interrogering af Multiplexed cellulære sammensætninger til at analysere knoglemarv afledte stromale komponenter i tumormikromiljøet, men denne metode og koncept kan anvendes til at dechifrere andre cellulære elementer, der udgør en kompleks væv, såsom dem, der ses under sårhelingskomplikationer reaktioner eller under en regenerativ væv. I disse forsøg udnytter vi transgene mus fluorescens skelne knoglemarv-afledte celler fra værten afledte celler inden for en indpodet tumormikromiljøet, men denne teknik egner sig til brug af noget reportergen mærkede celler, og er især amendable til celler, der udtrykker genet etiketter, kan let ses med immunhistokemi, såsom LacZ, glucuronidase, Hans (6X) -, HA, FLAG-tag mærkede celler mv ^11.

I vores model efterofring af transplanterede mus blev tumorsnit behandlet og farvet med antistoffer til at identificere oprindelsen af ​​cellen, RFP + knoglemarvsdonor afledte eller GFP + vært væv afledt. I figur 2 viser vi to markører coekspression med værten afledt GFP +-celler inden for tumormikromiljøet. Imidlertid viser vi potentialet for syv farvning ved hjælp af det samme system i figur 2D.

Disse data er en repræsentation af, hvad der er i stand til at udnytte vores transplantation og Multispektralbilledteknik model. Dette system er yderst fleksibel og kan rumme yderligere parametre herunder: 1-ændrede BMT populationer / transgene musemodeller, 2-alternative tumor / sygdomsmodeller, eller 3-alternative markører (f.eks overflade, intracellulære, fosfor proteiner). Normalt med et stigende antal immunhistokemiske pletter på det samme dias, bliver dataanalyse besværlig, men ved hjælp af en multispektrale billedsensorer platforme og foreningerknyttede unmixing software muliggør effektive, pålidelige og reproducerbare resultater. Vi giver potentielle antistof arter og fluorescensmærke kombinationer i tabel 1. Desuden er denne teknik giver mulighed for alsidighed i sonde / antistof-udvalg på grund af muligheden for at bruge både frosne og paraffin vævssnit gør denne teknik anvendes på kliniske vævsprøver i tillæg til grundforskning modeller.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
.2 μm filter	Fisher	09-740-35A
10 ml lure lock	BD	309604
25 G needle	Cardinal	BF305122
40nm filter	BD	352340
50 ml conical tube	Fisher	1495949A
Alexafluor 488-ms1	invitrogen	A21121
Alexafluor 594-Rb	invitrogen	A21207
Alexafluor 647-ch	Invitrogen	A21449
BSA	Sigma	A7906-500G
Cover slips	Corning	2940-243
CRI-Nuance	Caliper Life Sciences
Dapi	Invitrogen	D1306
DMEM	CellGro	10-017-CV
Ethanol	Dharmacon	4004-DV
FBS	invitrogen	16000-044
GFP-ms1	Abcam	ab38689
Insulin needle	BD	329424
Maleic acid	Acros	100-16-7
Moisture chamber box	Evergreen	240-9020-Z10
Mounting media	dako	S3023
Nail hardener	Sally Hansen	2103
Pap pen	Abcam	Ab2601
Pen/Strep L Glut	invitrogen	10378016
Steril PBS	invitrogen	14040-182
Trypsin	invitrogen	252000-56
Blocking Buffer maleic acid 14.51 g NaCl 10.95 g NaOH pellets (to 7.5pH) 9+g Distilled water 250 ml *add 0.2% Tween-20 to 1x solution for blocking buffer with 2%BSA/2%FBS. Stir and filter. Antigen retrieval buffers: Tris-EDTA Buffer (10 mM Tris Base, 1 mM EDTA Solution, 0.05% Tween 20, pH 9.0) Tris Base 1.21 g EDTA 0.37 g Distilled water 1000 ml (100 ml to make 10x, 50 ml to make 20x) Tween 20 0.5 ml *Store at RT for 3 months or at 4 ° C for longer Sodium Citrate Buffer (10 mM Sodium Citrate, 0.05% Tween 20, pH 6.0) Tri-sodium citrate (dihydrate) 2.94 g Distilled water 1000 ml HCl (adjust pH to 6.0) 1N Tween 20 0.5 ml