Summary
परिसर ऊतक जनता, अंगों से ट्यूमर के लिए, विभिन्न सेलुलर तत्वों से बना रहे हैं. हम सेल उत्पत्ति के साथ ही प्रोटीन अभिव्यक्ति के आधार पर सेल विशेषताओं को समझने के लिए वर्णक्रमीय unmixing द्वारा पीछा Multiparameter Immunofluorescent धुंधला के साथ संयोजन में मल्टी लेबल फ्लोरोसेंट ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग एक ऊतक के भीतर सेलुलर phenotypes का योगदान elucidated.
Abstract
एक जटिल ऊतक के विकास के लिए कई सेलुलर तत्वों के योगदान को समझने की इच्छा के साथ, जैसे ऊतक, ट्यूमर गठन, या vasculogenesis regenerating में भाग लेने कि कई प्रकार की कोशिकाओं के रूप में, हम में ट्यूमर के विकास की एक बहुरंगी सेलुलर प्रत्यारोपण मॉडल तैयार सेल आबादी अलग fluorescently रंग रिपोर्टर जीन चूहों से ही शुरू और, प्रत्यारोपित engrafted या एक विकासशील ट्यूमर में और चारों ओर इंजेक्ट कर रहे हैं जो. ये रंग कोशिकाओं को फिर भर्ती और ट्यूमर स्ट्रोमा में शामिल कर रहे हैं. मात्रात्मक अस्थि मज्जा व्युत्पन्न ट्यूमर stromal कोशिकाओं का आकलन करने के लिए, हम IACUC द्वारा अनुमोदित के रूप में चूहों व्यक्त घातक विकिरणित आरएफपी में ट्रांसजेनिक पूरे अस्थि मज्जा व्यक्त GFP प्रतिरोपित. Orthotopically प्रत्यारोपित चूहों में इंजेक्शन थे कि 0ovarian ट्यूमर 6-8 सप्ताह के बाद engraftment excised और जुड़े ट्यूमर का पता लगाने के लिए मूल के अस्थि मज्जा मार्कर (GFP) के रूप में भी एंटीबॉडी मार्कर के लिए विश्लेषण किया गयाmultispectral इमेजिंग तकनीक का उपयोग कर स्ट्रोमा. हम तो मात्रात्मक सेल, जिसमें से (मूल रिपोर्टर जीन लेबल पर आधारित) शुरू करने आबादी, और 4, 5 unmix करने की हमारी क्षमता के रूप में आया लेबल जो आकलन करने के लिए fluoroprobes के multispectral unmixing का उपयोग कर, हम मल्टिप्लेक्स सेलुलर रचनाओं की MIMicc-Multispectral पूछताछ कॉल एक पद्धति को अनुकूलित , स्लाइड बढ़ जाती 6 प्रतिशत या अधिक स्पेक्ट्रा, हम सेल प्रजातियों या परिशुद्धता बढ़ाने के लिए भेदभाव के साथ जुड़े अतिरिक्त immunohistochemistry जोड़ दिया है. सह स्थानीयकृत मल्टिप्लेक्स फ्लोरोसेंट संकेतों, ट्यूमर stromal आबादी, पता लगाया प्रगणित और मार्कर धुंधला पर आधारित होती जा सकता है पता लगाने के लिए सॉफ्टवेयर का उपयोग. 1
Introduction
ऊतकों के विकास और मरम्मत समझना घाव भरने, 2,3 पुनर्योजी चिकित्सा, विकास जीव विज्ञान और ट्यूमर जीव विज्ञान में भाग लेने सेलुलर घटकों elucidating के लिए महत्वपूर्ण है. मरम्मत की परिस्थितियों में, कई प्रकार की कोशिकाओं vascularization, ईसीएम बयान, प्रसार और ऊतक पुनर्गठन में सहायता करने के लिए आसपास के microenvironment घुसपैठ. सेलुलर कारकों और phenotypes Multiparameter, स्थानीयकरण की पहचान कर सकते हैं कि मल्टिप्लेक्स मार्कर, भेदभाव की स्थिति और जांच की microenvironment भीतर सेलुलर घटकों के बीच बातचीत के आधार पर पहचाना जा सकता है. इस के साथ साथ, हम multispectral इमेजिंग और वर्णक्रमीय unmixing पद्धति द्वारा पीछा इस बहुरंगा-बहुकोशिकीय प्रत्यारोपण मॉडल के लिए एक प्रोटोटाइप उदाहरण के रूप में ट्यूमर के विकास का वर्णन.
ट्यूमर प्रगति बढ़ाया प्रसार, एक भी शामिल है कि कई का अधिग्रहण क्षमताओं द्वारा चिह्नित है कि एक multistep प्रक्रिया है, ntiapoptotic आक्रामक और वाहिकाजनक गुण. 4 ट्यूमर के विकास वृद्धि कारकों, संरचनात्मक matrices, संवहनी नेटवर्क और प्रतिरक्षा मॉडुलन प्रदान करने के लिए आसपास के वातावरण में भर्ती कर रहे हैं कि गैर neoplastic कोशिकाओं से मदद की है. 1,5,6 इस microhabitat से ली गई कोशिकाओं के होते हैं स्थानीय, पड़ोसी ऐसी वसा के रूप में ऊतकों, और रक्त वाहिकाओं और ऐसे अस्थि मज्जा व्युत्पन्न कोशिकाओं 1 के रूप में दूर के स्रोतों. गैर neoplastic सेल समावेश की हद तक अक्सर ट्यूमर के चरण / ग्रेड के साथ मेल खाती है जो ट्यूमर, से मांग पर निर्भर करता है. ट्यूमर सहायक microenvironment की भूमिका को समझने के लिए, एक गैर neoplastic सेल आबादी की उत्पत्ति और भेदभाव की क्षमता को समझना चाहिए.
इस प्रोटोकॉल स्थानीय ऊतक deriv दोनों अस्थि मज्जा व्युत्पन्न सेलुलर घटकों के दृश्य के माध्यम से ट्यूमर प्रगति की व्याख्या करने में सहायता करने के लिए डिजाइन किया गया है,कोशिकाओं एड. फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन व्यक्त ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग, हम एक घातक विकिरणित आरएफपी (लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन) माउस में GFP (हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन) अस्थि मज्जा प्रतिरोपित. सफल अस्थि मज्जा engraftment के बाद, एक syngeneic ट्यूमर कोशिका लाइन orthotopically इंजेक्शन और 4-8 सप्ताह के लिए टीका लगाना करने की अनुमति दी है. जिसके परिणामस्वरूप ट्यूमर माउस से excised और stromal घटकों कल्पना करने के लिए धुंधला Immunofluorescent (यदि) के लिए कार्रवाई की है. बहुसंकेतन मार्करों हालांकि वर्णक्रमीय ओवरलैप है कि अधिकारी फ्लोरोसेंट मार्कर संयोजन के लिए संभावित बेहतर बनाता है एक multispectral इमेजिंग / unmixing मंच का उपयोग कर, महत्वपूर्ण अनुकूलन 7-9 शामिल है कि आमतौर पर इस्तेमाल किया तकनीक है. इस के साथ साथ हम हम सेलुलर मूल, सेलुलर भेदभाव सेंट का विश्लेषण करने के क्रम में दाग और एक एकल स्लाइड पर एक ट्यूमर अनुभाग के भीतर आठ मार्करों के लिए ऊपर का विश्लेषण करने के लिए मल्टिप्लेक्स सेलुलर रचनाओं की MIMicc-multispectral पूछताछ कॉल एक तकनीक पेशatus और ट्यूमर microenvironment भीतर घटकों के सेल सेल बातचीत. इस सरल उदाहरण एंटीबॉडी के उपयोग के पांच, छह, या अधिक मार्कर या intracellular प्रमोटर संचालित फ्लोरोसेंट अभिव्यक्ति. तालिका 1 सूचियों को ध्यान में रखा उपयुक्त प्रजातियों के साथ संभावित फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी धुंधला संयोजन का विश्लेषण करने के क्रम में पर विस्तार होने की संभावना है.
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Protocol
Syngeneic Murine अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण (BMT) संस्थागत IACUC प्रोटोकॉल द्वारा अनुमोदित के रूप में (नोट: इस प्रोटोकॉल की सफलता multispectral विश्लेषण के लिए लक्ष्य के रूप में किसी भी लेबल सेल प्रकार (ओं) का उपयोग की आवश्यकता है, और नीचे की ओर विश्लेषण की सुविधा के लिए, एक किसी भी आनुवंशिक दोहन कर सकते हैं या स्थिर सेलुलर लेबलिंग. हम किसी भी कोशिका, ऊतक, या अंग होने वाली एक प्रत्यारोपण मॉडल को और अनुसंधान उपयोगी समझे प्रत्यारोपण के रूप में कई अनूठी लेबल आबादी नियंत्रित कर सकते हैं कि लागू किया जा सकता है. इसके अतिरिक्त, सेलुलर सिस्टम बहु लेबल ऐसे कई वंश युक्त ट्रांसजेनिक चूहों में पाए जाने वाले के रूप में प्रतिबंधित fluorescently आबादी सकते हैं कुछ रोग राज्यों के अध्ययन के लिए प्रत्यारोपण जटिलताओं को खत्म करने के लिए तैयार किया जा लेबल.
- घातक दाता अस्थि मज्जा के साथ पुनर्गठन से पहले 9.5 Gy चार घंटे की एक खुराक के साथ BMT प्राप्तकर्ता चूहों चमकाना. (BMT GFP प्राप्तकर्ताओं उम्र के 6-10 सप्ताह होना चाहिए).
- कतरन और बाँझ शल्य कैंची से हिंद अंग को बेनकाब करने के लिए इसे वापस छीलने से पहले 70% इथेनॉल के साथ माउस खाल गीले. Sacroiliac संयुक्त पर श्रोणिफलक शिखा सहित पूरे पैर निकालें. बस टखने के ऊपर और फिर अच्छी तरह हड्डी से सभी मांसपेशियों, ligaments और अतिरिक्त ऊतक को हटाने के काटने से पैर त्यागें. पीबीएस (पीबीएस -2) में 2% बाँझ FBS का उपयोग कर एक 23 जी सुई के साथ टिबिया, fibia और श्रोणिफलक शिखा से फ्लश मज्जा. (BMT आरएफपी दाताओं संस्थागत मानकों के अनुसार बलिदान किया जाना चाहिए.)
- धीरे टुकड़ा और एक स्केलपेल और संदंश का उपयोग टुकड़ों में शेष हड्डी को कुचलने और फिर 300 rpm पर 37 डिग्री सेल्सियस पर मैं 1 घंटे के लिए 3 ग्राम / एमएल collagenase साथ 50 मिलीलीटर में शंक्वाकार ट्यूब जगह.
- पीबीएस-2 के साथ ट्यूब बंद ऊपर और एक ताजा ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा करने और लाल कोशिकाओं के साथ गठबंधन. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 250rpm पर स्पिन
- पीबीएस 2 में कोशिकाओं Resuspend और 40 एनएम सेल फिल्टर के माध्यम से फिल्टर. इस बिंदु पर, कोशिकाओं fluorescen के लिए लेबल किया जा सकताटी के BMT के लिए विशिष्ट आबादी में हेरफेर करना चाहता है छंटनी (FACS) सेल सक्रिय है.
- माउस प्रति 100 μl पीबीएस प्रति 2 x 10 6 कोशिकाओं, Resuspend. प्रणालीबद्ध पूंछ या रेट्रो कक्षीय नस उठाव साइड अप द्वारा विकिरणित GFP प्राप्तकर्ता चूहों में इंजेक्षन 29 जी सुई का प्रयोग करें. केवल engraftment नियंत्रण के रूप में 100 μl पीबीएस के साथ एक माउस इंजेक्षन. इंजेक्शन के लिए पहले वाहिकाओं को चौड़ा करना और इंजेक्शन पर एक पूंछ नस इंजेक्शन संयम का उपयोग करने के लिए एक गर्मी दीपक का उपयोग करें. पूंछ पद इंजेक्शन के लिए प्रकाश दबाव लागू करने के लिए उपलब्ध बाँझ धुंध है.
- तीन सप्ताह, BMT पोस्ट खून रेट्रो orbitally इकट्ठा और GFP परिसंचारी कोशिकाओं की उपस्थिति और आरएफपी परिसंचारी कोशिकाओं के अभाव की पुष्टि करने के लिए प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण. नियंत्रण माउस इस बिंदु पर मारे गए हैं जाएगा.
2. ट्यूमर engraftment संस्थागत IACUC दिशा निर्देशों के अनुसार
- ID8 पूर्व vivo में इंजेक्शन (1 x 10 6 सी के लिए इन विट्रो में डिम्बग्रंथि murine ट्यूमर कोशिकाओं को विकसितमाउस प्रति एल्स). इंजेक्शन के दिन, Trypsinize कोशिकाओं, 100 μl प्रति 1 x 10 6 कोशिकाओं पर पीबीएस में पीबीएस के साथ धोने और resuspend.
- माउस का intaperitoneal गुहा में ट्यूमर कोशिकाओं इंजेक्षन, सुई उठाव की ओर होना चाहिए. 70% इथेनॉल के साथ इंजेक्शन दृष्टि जीवाणुरहित. निचले बाएँ या पेट के निचले सही चक्र में इंजेक्ट (कपाल और थोड़ा महिला माउस के पेट निपल्स के अवर सेट करने के लिए औसत दर्जे का), अंगों मार से बचने के. कूड़ा द्वारा हथियाने और कनिष्ठा या अनामिका के साथ पूंछ पकड़ से माउस को नियंत्रित करना. चूहे इस प्रक्रिया के लिए isoflurane के साथ anesthetized किया जा सकता है.
- इस तरह के मामूली पेट की सूजन के रूप में ट्यूमर engraftment के लक्षण,, स्पष्ट कर रहे हैं जब चूहों बलिदान. यह 4-12 सप्ताह से अधिक हो जाएगा.
- आईपी गुहा से आबकारी ट्यूमर. गुहा के भीतर ट्यूमर अंगों की सतह पर और चारों ओर सफेद पिंड की तरह दिखेगा. एक स्केलपेल के साथ, ट्यूमर को हटाने और 24 घंटा निर्धारण के लिए 10% formalin के एक ट्यूब / जार में रखें. ऊतकीय पीमरम्मत विकृति / ऊतक विज्ञान कोर को sourced किया जा सकता है अभिकर्मकों और सामग्री आयल embedding और स्लाइड तैयार करने के लिए आसानी से उपलब्ध नहीं हैं. बाद धुंधला प्रक्रियाओं के लिए गिलास स्लाइड पर 5-8 सुक्ष्ममापी स्लाइस में धारा ऊतक.
3. मल्टी पैरामीटर immunofluorescent धुंधला
- प्रयोग में उपयोग हर फ्लोरोसेंट जांच के लिए एकल रंग नियंत्रण स्लाइड तैयार करें. इस परिदृश्य में, चार रंगों का उपयोग किया जाता है. इसलिए, प्रत्येक व्यक्ति के रंग के लिए चार स्लाइड के साथ ही पृष्ठभूमि शोर नियंत्रण और पूर्ण संयोजन धुंधला के लिए अंत में एक स्लाइड के लिए एक स्लाइड. (कुल स्लाइड्स = 6) सभी स्लाइड्स प्रयोगात्मक भिन्नता को कम करने के लिए एक समान फैशन में कंधे से कंधा मिलाकर कार्रवाई की जाएगी.
- 1 घंटे के लिए 56 डिग्री सेल्सियस पर आयल वर्गों सेंकना.
- धो स्लाइड xylene में 10 मिनट 3x.
- 2x 5 मिनट 100% इथेनॉल धो लें.
- 1x 3 मिनट 95% इथेनॉल धो लें
- 1x 2 min90% इथेनॉल धो लें.
- 1x 2 min70% इथेनॉल धो लें.
- पिछले धोने श्रृंखला के दौरान 2 मिनट (उच्च पर माइक्रोवेव) के लिए पूर्व फोड़ा सोडियम साइट्रेट बफर. (प्रयोग में एंटीबॉडी के आधार पर Tris-EDTA बफर के साथ जगह ले सकते हैं)
- सोडियम साइट्रेट बफर (10% बिजली पर या एक प्रेशर कुकर में माइक्रोवेव) में 20 मिनट के लिए स्लाइड उबाल लें. बफर फोड़े हैं, माइक्रोवेव बंद कर देते हैं और बैठते हैं.
- गर्मी स्रोत से निकालें और स्लाइड नीचे शांत करने के लिए सोडियम साइट्रेट बफर में 30 मिनट के लिए आराम करते हैं.
- 5 मिनट के लिए पानी में स्लाइड्स कुल्ला.
- पैप कलम के साथ ट्यूमर वर्गों के आसपास मार्क और 1 घंटे के लिए अवरुद्ध बफर 2% बीएसए / 1% FBS Maleic एसिड डाल दिया. उन्हें इस कदम के दौरान बाहर सूखा नहीं करने के लिए व्यक्तिगत रूप से स्लाइड तैयार करें.
- अवरुद्ध बफर में इष्टतम कमजोर पड़ने पर प्राथमिक एंटीबॉडी तैयार करें. (प्रयोग में एंटीबॉडी विभिन्न प्रजातियों के सभी (या आईजीजी श्रृंखला भिन्नता-पूर्व कर रहे हैं: एक ही प्रजाति के IgG2a बनाम IgG1) के रूप में वे दौरान संयोजन में इस्तेमाल किया जा सकता हैचिमनी ऊष्मायन अवधि. एंटीबॉडी प्रजातियों ओवरलैप करते हैं, तो incubations एंटीबॉडी पार प्रतिक्रिया को कम करने के लिए क्रमिक रूप से बाहर किया जाना चाहिए.)
- इस बिंदु पर, केवल अवरुद्ध बफर के साथ दो स्लाइड छोड़ दें. इन दो स्लाइड बेदाग नियंत्रण और परमाणु दाग नियंत्रण के रूप में काम करेगा. अन्य एकल रंग नियंत्रण व्यक्तिगत प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ incubated किया जाएगा. केवल विश्लेषण स्लाइड प्राथमिक एंटीबॉडी का एक संयोजन होगा.
- पर धीमी गति से घूर्णन प्रकार के बरतन पर एक नमी कक्ष बॉक्स में प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ स्लाइड्स सेते 4 ° रातोंरात (~ 16-20 घंटा) (नोट: 4 + fluorophores, अनुक्रमिक धुंधला या प्रत्यक्ष विकार के साथ काम कर जब एंटीबॉडी पार प्रतिक्रिया को कम करने के लिए आवश्यक हो सकता है . सभी एंटीबॉडी स्लाइड्स पर लागू कर रहे हैं जब तक इन परिस्थितियों कदम 1.16-1.21 दोहराने के तहत.)
- धीरे प्रकार के बरतन पर PBST में 10 मिनट (2x) के लिए स्लाइड्स धो लें
- धोने जा रहा है, एक अंतिम कमजोर पड़ने के लिए Alexafluor 488, 594 और 647 माध्यमिक एंटीबॉडी तैयारअवरुद्ध बफर में 1:1,000 की. (इन एंटीबॉडी और dilutions बैचों में और समय के साथ प्रतिदीप्ति संरक्षित करने के लिए हर समय 4 डिग्री सेल्सियस और अंधेरे में रखा जाता है सुनिश्चित करें.)
- एकल रंग नियंत्रण स्लाइड्स पर, प्रयोग प्राथमिक एंटीबॉडी की प्रजातियों मिलान एकल Alexafluor dilutions जगह है. सभी माध्यमिक एंटीबॉडी विश्लेषण स्लाइड पर रखा जाएगा. बेदाग और परमाणु दाग नियंत्रण स्लाइड्स इस कदम भर अवरुद्ध बफर के साथ रहेगा.
- 2 घंटे के लिए आरटी पर धीमी गति से घूर्णन प्रकार के बरतन पर (प्रकाश जोखिम से बचने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर) एक नमी कक्ष बॉक्स में सेते हैं.
- धीरे प्रकार के बरतन पर PBST में 5 मिनट (2x) के लिए स्लाइड धो लें. प्रकाश से बचाने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर.
- 1 DAPI केवल स्लाइड करने के लिए न्यूनतम और विश्लेषण स्लाइड के लिए DAPI (1:10,000) जोड़ें. प्रकाश से बचाने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर. अन्य स्लाइड्स धो कंटेनर में कवर छोड़ा जा सकता है.
- दो DAPI-incubated धो लेंDAPI दाग के साथ अन्य स्लाइड्स को दूषित नहीं करने के रूप में पहले 5 मिनट धोने के लिए एक अलग कंटेनर में स्लाइड. दूसरा 5 मिनट धोने के लिए, स्लाइड्स (सभी washes के एक प्रकार के बरतन पर आयोजित किया जाना चाहिए) PBST में जोड़ा जा सकता है. प्रकाश से बचाने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर.
- पानी में संक्षेप में डुबकी स्लाइड्स से पहले कवर फिसल (प्रतिदीप्ति संरक्षित करने के लिए जलीय बढ़ते मीडिया के साथ 1.5 मोटाई)
- आरटी पर अंधेरे में सूखे 3 घंटा करते हैं.
- नाखून hardener साथ कवर पर्ची के किनारों को सील. (एसीटोन फ्लोरोसेंट संकेत बुझाने सकता है के रूप में नेल पॉलिश का उपयोग न करें).
- तुरंत स्लाइड विश्लेषण या भविष्य के विश्लेषण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर.
4. Multispectral इमेजिंग
- डेटा संग्रह के लिए अति सूक्ष्म अंतर सॉफ्टवेयर के साथ एक OLYMPUS X-63 ईमानदार माइक्रोस्कोप पर (एक लिक्विड क्रिस्टल tunable फ़िल्टर युक्त) एक अति सूक्ष्म अंतर EX कैमरे का उपयोग multispectral छवियों को इकट्ठा.
- संकल्प को बढ़ाने के लिए एक तेल उद्देश्य का उपयोग कर छवियों लीजिए.
- पहलएल सेट अप प्रयोग में प्रत्येक fluorophore के लिए वर्णक्रमीय रेंज की स्थापना भी शामिल है.
- 4 रंग के लिए:
- DAPI: 420-480nm
- AF488: 490-580nm
- AF594: 590-640nm
- AF647: 650-720nm
- 4 रंग के लिए:
- वर्णक्रमीय श्रेणियों में से प्रत्येक के लिए उचित जोखिम बार प्राप्त करने के लिए विश्लेषण स्लाइड के एक प्रारंभिक छवि ले लो.
- सॉफ्टवेयर एक दूसरे से fluorophores का संकेत करने वाली शोर अनुपात और पृष्ठभूमि संकेत की पहचान और अलग करने के लिए प्रयोग करेंगे कि "वर्णक्रमीय पुस्तकालय" बनाएँ. (नोट: 3 fluorophores = 4 नियंत्रण स्लाइड्स, 5 fluorophores = 6 नियंत्रण स्लाइड: प्रत्येक fluorochrome डेटा सेट के समुचित विश्लेषण उदाहरण सुनिश्चित करने के लिए उचित तरंगदैर्ध्य घटता के साथ एक वर्णक्रमीय पुस्तकालय को इकट्ठा करने के क्रम में अपने स्वयं के एकल रंग नियंत्रण स्लाइड होना आवश्यक है.).
- पहली छवि बेदाग स्लाइड. इस स्लाइड वर्णक्रमीय librar भीतर नामित किया जाएगापृष्ठभूमि के रूप में y.>
- छवि DAPI केवल दूसरे स्लाइड. इस स्लाइड "आकर्षित" उपकरण के साथ DAPI दाग नाभिक को नामित करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा और DAPI के रूप में वर्णक्रमीय पुस्तकालय में सहेज दिया जाएगा.>
- छवि AF488 केवल तीसरे स्लाइड. इस स्लाइड "आकर्षित" उपकरण के साथ AF488 से सना हुआ क्षेत्रों को नामित करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा और AF488 के रूप में वर्णक्रमीय पुस्तकालय में सहेज दिया जाएगा.>
- छवि AF594 केवल चौथी स्लाइड. इस स्लाइड "आकर्षित" उपकरण के साथ AF594 से सना हुआ क्षेत्रों को नामित करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा और AF594 के रूप में वर्णक्रमीय पुस्तकालय में सहेज दिया जाएगा.>
- छवि AF647 केवल पांचवें स्लाइड. इस स्लाइड "आकर्षित" उपकरण के साथ AF647 से सना हुआ क्षेत्रों को नामित करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा और AF647 के रूप में वर्णक्रमीय पुस्तकालय में सहेज दिया जाएगा.>
- प्रत्येक व्यक्ति वर्णक्रमीय घटक के संग्रह के बाद,वर्णक्रमीय पुस्तकालय और प्रोटोकॉल बचा.>
- वर्णक्रमीय पुस्तकालय पूरा हो जाए, छवियों को बचाने / माइक्रोस्कोप पर विश्लेषण स्लाइड पर ब्याज के क्षेत्रों को खोजने और इकट्ठा.>
5. Multispectral छवियां के मात्रात्मक विश्लेषण
- सॉफ्टवेयर सूचित अधिग्रहण का उपयोग अति सूक्ष्म अंतर छवियों का एक प्रतिनिधि वर्गीकरण आयात करें.
- कार्यक्रम के निर्देशानुसार बचाया वर्णक्रमीय लायब्रेरी खोलें
- विश्लेषण किया जा करने के लिए ब्याज की ऊतक क्षेत्रों की पहचान. (वसा ऊतकों की तुलना में जैसे ट्यूमर के ऊतक).
- DAPI दाग के आधार पर व्यक्ति की कोशिकाओं की पहचान. कोशिका द्रव्य नाभिक के आकार के आधार पर स्वचालित रूप से परिभाषित किया जाएगा.
- प्रत्येक फ्लोरोसेंट पैरामीटर के लिए पसंद की फ्लोरोसेंट तीव्रता पढ़ने के लिए बाहर उठाओ (जैसे मतलब है, मानक विचलन)
- बैच छवियों का अधिग्रहण किया और प्रस्तावित एल्गोरिथ्म का उपयोग सॉफ्टवेयर प्रक्रिया करते हैं.
- इमेज प्रोसेसिंग समाप्त हो गया है, मर्जपरिणाम फ़ाइलें.
- एक्सेल (या किसी भी अन्य विश्लेषणात्मक सॉफ्टवेयर पैकेज) में परिणाम खोलें और XY अक्ष पर एक दूसरे के खिलाफ दो फ्लोरोसेंट तीव्रता साजिश है. प्रत्येक फ्लोरोसेंट तीव्रता सेल प्रति दिया जाता है. डबल सकारात्मक कोशिकाओं ऊपरी सही चक्र में दिखाई देगा. उपयोगकर्ता का आधारभूत फ्लोरोसेंट तीव्रता को परिभाषित करना होगा.
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Representative Results
हमारे ट्रांसजेनिक BMT माउस मॉडल में engrafted ट्यूमर का विश्लेषण करने के लिए एक multispectral इमेजिंग तकनीक का उपयोग करना, हम अस्थि मज्जा मूल के हैं कि stromal ट्यूमर घटकों विचार करने में सक्षम हैं. प्रारंभिक BMT फ्लो से तीन सप्ताह के बाद प्रत्यारोपण (चित्रा 1) की पुष्टि की थी. Orthotopically BMT engraftment पुष्टियों प्रारंभिक ट्यूमर इंजेक्शन के बाद excised और formalin 6 सप्ताह तय किया गया निम्नलिखित unlabeled डिम्बग्रंथि ट्यूमर इंजेक्शन. आयल एम्बेडेड ट्यूमर वर्गों <8 माइक्रोन स्लाइस में sectioned और दाग रहे थे. उचित ही रंग नियंत्रण स्लाइड पृष्ठभूमि autofluorescence के लिए एक सहित प्रत्येक fluorophore के लिए किए गए थे. 1 टेबल संभावित नकदी और 2-7 मापदंडों के लिए fluorochrome संयोजन भी शामिल है. धुंधला प्रक्रिया के बाद, छवियों को एक अति सूक्ष्म अंतर कैमरा लगाव और अति सूक्ष्म अंतर सॉफ्टवेयर का उपयोग कर हासिल किया गया. एकल रंग नियंत्रण स्लाइड के साथ एक वर्णक्रमीय पुस्तकालय (2A चित्रा) बनाने के बाद, हम wअरे सक्षम करने के लिए "unmix" (एंटीबॉडी # 1) परमाणु DAPI और दो अन्य मार्करों के साथ GFP की अभिव्यक्ति दिखा लिया गया है कि बहु - लेबल डिम्बग्रंथि ट्यूमर वर्गों की छवियों (एंटीबॉडी # 2 और # 3). अधिक मार्कर की (चित्रा 2B) इसके अलावा संभव है और -2 सी डी छह मार्कर के साथ साथ एक परमाणु दाग के साथ एक ट्यूमर खंड की छवि दिखाता आंकड़े. अंत में, सभी का अधिग्रहण छवियों के विश्लेषण के लिए सूचित (CaliperLS, Hopkinton, एमए) सॉफ्टवेयर में आयात किया गया. अति सूक्ष्म अंतर (CaliperLS, Hopkinton, एमए) सॉफ्टवेयर MetaMorph (आण्विक उपकरण) या IPLab (Scanalytics, बी.डी. बायोसाइंसेज) जैसे अन्य संकुल के साथ संगत है. इसके अलावा, छवियों और वर्णक्रमीय डेटासेट भी झगड़ा फ़ाइलों के रूप में सहेजे गए और इस फाइल प्रारूप पढ़ता है कि किसी भी कार्यक्रम में देखा जा सकता है. सूचित सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, हम ट्यूमर वर्गों के भीतर ब्याज की ऊतक क्षेत्रों (आंकड़े 3 ए और ई) वर्गीकृत और सेल बस प्रति प्रत्येक fluorochrome के फ्लोरोसेंट तीव्रता के लिए एल्गोरिदम सेट करने में सक्षम थेDAPI परमाणु दाग पर एड (आंकड़े -3 बी सी). अंत में, हम दो मार्करों, AF488 और AF647 (चित्रा 3 डी) के फ्लोरोसेंट तीव्रता के आधार पर प्रत्येक व्यक्ति के सेल की साजिश कर रहे थे. हम एक निर्धारित फ्लोरोसेंट तीव्रता सीमा (चित्रा 4) पर आधारित एक डबल सकारात्मक सेल आबादी की स्थापना की. डेटा सेट में एकाधिक मापदंडों के साथ और अधिक जटिल हो जाता है के रूप में डेटा कुदाल सॉफ्टवेयर 10 (घनत्व सामान्यीकृत घटनाओं के फैले पेड़ प्रगति विश्लेषण) का उपयोग करते हुए विश्लेषण किया जा करने के लिए यह प्रदर्शन किया जाना अभी बाकी है, हालांकि, वहाँ की क्षमता है. यह सॉफ्टवेयर बड़े डेटा सेट पर सह अभिव्यक्ति के रुझान के दृश्य के लिए सक्षम बनाता है और विश्लेषण ऊतक वर्गों के भीतर सह व्यक्त मार्करों के समूहों के बीच सहयोग / रिश्तों संकेत कर सकते हैं.
तालिका 1. 2-7 रंग मल्टीप्लेक्स धुंधला के लिए immunofluorescent धुंधला नियंत्रण तैयारी. (ए) एक चार रंग विकल्प अप करने के लिए शामिल है. (बी) (सी) दृश्य प्रकाश स्पेक्ट्रम के भीतर एक सात रंग विकल्प भी शामिल है, जबकि प्रकाश स्पेक्ट्रम के निकट अवरक्त भाग उल्लंघनों कि एक एंटीबॉडी का उपयोग एक सात रंग विकल्प अप करने के लिए शामिल है.
चित्रा 1. फ्लो ने अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण पुष्टि. (ए) आरएफपी + नियंत्रण और GFP + कोशिकाओं के लिए + GFP चूहों और नकारात्मक (सी) पर नियंत्रण की तुलना आरएफपी + hematopoietic कोशिकाओं के लिए (बी) सकारात्मक है जो GFP ट्रांसजेनिक प्राप्तकर्ता माउस के भीतर परिसंचारी hematopoietic कोशिकाओं आबादी के डॉट साजिश.
चित्रा 2. प्रेतसंबंधी अमिश्रित छवि प्रक्रिया. (ए) (बी) Multispectral छवि fluorescently लेबल कोशिकाओं दिखा एक murine डिम्बग्रंथि ट्यूमर अनुभाग, # 1: AF488 (पूर्व 495 एनएम / उन्हें 510 एनएम), # 2 : AF594 (ex590/em617 एनएम); # 3: AF647 (पूर्व 650/em 668 एनएम) और परमाणु: DAPI (पूर्व 350/em 470 एनएम). एकल रंग सफेद में दिखाए जाते हैं डिम्बग्रंथि ट्यूमर वर्गों के विश्लेषण के लिए बनाई गई 7 रंग वर्णक्रमीय पुस्तकालय (सी) स्क्रीनशॉट (डी) Multispectral छवि fluorescently लेबल कोशिकाओं दिखा एक murine डिम्बग्रंथि ट्यूमर अनुभाग, परमाणु:.. DAPI (ex350/em470 एनएम ); AF488 (पूर्व 495/em 519 एनएम); AF514 (ex518/em540 एनएम); AF568 (पूर्व 578/em 603 एनएम); AF594 (पूर्व 590/em 617 एनएम); AF633 (पूर्व 632/em 647 एनएम); AF660 (पूर्व 663/em 690 एनएम) और. एकल रंग सफेद रंग के रूप में अच्छी तरह से मिलान मिश्रित रंग में दिखाया गया है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 3. मात्रात्मक की MIMicc चित्रण विश्लेषण को सूचित करें. (क) पहले छवि (बी) परमाणु दाग DAPI के आधार पर कोशिकाओं के विभाजन के द्वारा पीछा ऊतक क्षेत्रों के वर्गीकरण का प्रतिनिधित्व करता है. (सी) फ्लोरोसेंट लेबल की मात्रा का ठहराव नाभिक और cytoplasm में मापा जाता है और (डी) में निर्यात किया जा सकता है आगे के विश्लेषण के लिए Excel. (ई) ऊतक विभाजन एल्गोरिथ्म आगे ऊतक वास्तुकला पर और न केवल अलग ऊतक क्षेत्रों में धुंधला वर्गीकृत करने के लिए एक और अधिक मजबूत विश्लेषणात्मक उपकरण उपलब्ध कराने fluorochrome पहचान पर आधारित ऊतक उपप्रकार की पहचान करने में सक्षम है. इस छवि में, कंप्यूटर Architectura के आधार पर 5 उप क्षेत्रों की पहचान करने के लिए प्रशिक्षित किया गया हैऊतक के भीतर एल पैटर्न पृष्ठभूमि रिक्त स्थान से परिभाषित किया गया है, रक्तलायी ट्यूमर के ऊतक के भीतर लाल रक्त कोशिकाओं की बहुतायत से परिभाषित किया गया है, ट्यूमर घनी आबादी कोशिकाओं द्वारा परिभाषित किया गया है, वसा बड़े, सममित, खाली सेलुलर डिब्बों द्वारा परिभाषित है, और मांसपेशी है एक धारीदार पैटर्न द्वारा परिभाषित. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 4. 20 अधिग्रहीत छवियों से व्यक्ति की कोशिकाओं के प्लॉट AF647 के साथ लेबल AF488 और αSMA साथ लेबल GFP के फ्लोरोसेंट तीव्रता के आधार पर डबल सकारात्मक कोशिकाओं दिखा.
अनुपूरक दस्तावेज़. बहुसंकेतन 5 या ज्यादा जांच के लिए टिप्स और ट्रिक्स.
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Discussion
इस के साथ साथ हम हम ट्यूमर microenvironment की अस्थि मज्जा व्युत्पन्न stromal घटकों का विश्लेषण करने के लिए, मल्टिप्लेक्स सेलुलर रचनाओं की MIMicc-multispectral पूछताछ के रूप में वर्णन multispectral इमेजिंग के आवेदन का वर्णन है, लेकिन इस पद्धति को और अवधारणा एक जटिल रचना है कि अन्य सेलुलर तत्वों का गूढ़ रहस्य के लिए लागू किया जा सकता है इस तरह के घाव भरने प्रतिक्रियाओं के दौरान या एक पुनर्योजी ऊतक के दौरान देखा उन लोगों के रूप में ऊतकों. इन प्रयोगों में हम fluorescently एक engrafted ट्यूमर microenvironment भीतर मेजबान ली गई कोशिकाओं से अस्थि मज्जा व्युत्पन्न कोशिकाओं को अलग करने के लिए ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग, लेकिन यह तकनीक किसी भी पत्रकार जीन लेबल की कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए उधार देता है, और जीन लेबल व्यक्त कोशिकाओं को विशेष रूप से सुधारने योग्य है कि , हा, झंडा टैग लेबल कोशिकाओं, आदि 11 - आसानी से इस तरह lacZ, glucuronidase, उनकी (6X) के रूप में, immunohistochemistry द्वारा प्रत्यक्ष कर रहे हैं.
हमारे मॉडल में, निम्नप्रतिरोपित चूहों का बलिदान, ट्यूमर वर्गों संसाधित और सेल की मूल पहचान करने के लिए एंटीबॉडी के साथ दाग रहे थे, आरएफपी + अस्थि मज्जा व्युत्पन्न दाता या GFP + मेजबान ऊतक व्युत्पन्न. चित्रा 2 में, हम ट्यूमर microenvironment भीतर मेजबान व्युत्पन्न GFP + कोशिकाओं के साथ सह व्यक्त दो मार्करों दिखा. हालांकि, हम चित्रा 2 डी में एक ही प्रणाली का उपयोग कर सात रंग धुंधला के लिए क्षमता दिखा.
ये आंकड़े हमारे प्रत्यारोपण और multispectral इमेजिंग मॉडल का उपयोग करने में सक्षम है क्या का प्रतिनिधित्व कर रहे हैं. यह प्रणाली अत्यंत लचीला है और सहित अतिरिक्त मापदंडों को समायोजित कर सकते हैं: 1 बदल BMT आबादी / ट्रांसजेनिक माउस मॉडल, 2-वैकल्पिक ट्यूमर / रोग मॉडल, या 3 वैकल्पिक मार्कर (जैसे सतह, intracellular, phospho प्रोटीन). आमतौर पर, एक ही स्लाइड पर immunohistochemical दाग की बढ़ती संख्या के साथ, डेटा विश्लेषण हालांकि एक multispectral इमेजिंग प्लेटफार्मों और एसोसिएट्स का उपयोग कर, कठिन हो जाता हैciated unmixing सॉफ्टवेयर, कुशल, विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणामों के लिए सक्षम बनाता है. हम संभावित एंटीबॉडी प्रजातियों और तालिका 1 में फ्लोरोसेंट लेबल संयोजन प्रदान करते हैं. इसके अलावा, इस तकनीक की वजह से बुनियादी अनुसंधान मॉडल के अलावा नैदानिक ऊतकों के नमूनों के लिए लागू इस तकनीक बनाने के लिए दोनों स्थिर और आयल एम्बेडेड ऊतक वर्गों का उपयोग करने की क्षमता की जांच / एंटीबॉडी चयन में बहुमुखी प्रतिभा के लिए अनुमति देता है.
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Disclosures
FCM, CMB, और एल्स खुलासा करने के लिए कोई संघर्ष और कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
हम डीआरएस से विचार विमर्श, मार्गदर्शन और समर्थन के लिए आभारी हैं. माइकल Andreeff एमडी, पीएचडी., और जारेड Burks पीएचडी. एमडी एंडरसन फ्लो और सेलुलर इमेजिंग कोर सुविधा से. इस काम FCM के लिए राष्ट्रीय कैंसर संस्थान (RC1-CA146381, सीए 083639, R01NS06994, CA116199 और CA109451 से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था. एल्स भी रक्षा की सेना विभाग (BC083397) द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||||||||||||||||
| .2 μm filter | Fisher | 09-740-35A | |||||||||||||||||||||||||||||
| 10 ml lure lock | BD | 309604 | |||||||||||||||||||||||||||||
| 25 G needle | Cardinal | BF305122 | |||||||||||||||||||||||||||||
| 40nm filter | BD | 352340 | |||||||||||||||||||||||||||||
| 50 ml conical tube | Fisher | 1495949A | |||||||||||||||||||||||||||||
| Alexafluor 488-ms1 | invitrogen | A21121 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Alexafluor 594-Rb | invitrogen | A21207 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Alexafluor 647-ch | Invitrogen | A21449 | |||||||||||||||||||||||||||||
| BSA | Sigma | A7906-500G | |||||||||||||||||||||||||||||
| Cover slips | Corning | 2940-243 | |||||||||||||||||||||||||||||
| CRI-Nuance | Caliper Life Sciences | ||||||||||||||||||||||||||||||
| Dapi | Invitrogen | D1306 | |||||||||||||||||||||||||||||
| DMEM | CellGro | 10-017-CV | |||||||||||||||||||||||||||||
| Ethanol | Dharmacon | 4004-DV | |||||||||||||||||||||||||||||
| FBS | invitrogen | 16000-044 | |||||||||||||||||||||||||||||
| GFP-ms1 | Abcam | ab38689 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Insulin needle | BD | 329424 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Maleic acid | Acros | 100-16-7 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Moisture chamber box | Evergreen | 240-9020-Z10 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Mounting media | dako | S3023 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Nail hardener | Sally Hansen | 2103 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Pap pen | Abcam | Ab2601 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Pen/Strep L Glut | invitrogen | 10378016 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Steril PBS | invitrogen | 14040-182 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Trypsin | invitrogen | 252000-56 | |||||||||||||||||||||||||||||
Blocking Buffer
Antigen retrieval buffers:
|
|||||||||||||||||||||||||||||||
References
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- Bataille, F. Multiparameter immunofluorescence on paraffin-embedded tissue sections. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 14, 225-228 (1097).
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- Qiu, P., et al. Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE. Nat Biotechnol. 29, 886-891 (2011).
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