Summary
复合组织群众，从机关到肿瘤，是由各种细胞成分的。我们阐明了利用多标记的荧光转基因小鼠与多参数免疫荧光染色结合组织随后光谱分离破译细胞起源以及基于蛋白表达细胞特征的细胞内表型的贡献。
Abstract
以理解的多个蜂窝单元，以一种复杂的组织的发展贡献的愿望;如参与再生组织，肿瘤形成，或血管生成中的许多细胞类型中，我们设计了在肿瘤发展的一个多彩色的细胞移植模型该细胞群的不同颜色的荧光报告基因小鼠起源和移植，嫁接或和周围一个发展中的肿瘤注射。然后，这些彩色的细胞被招募并纳入肿瘤基质。为了定量评估骨髓来源的肿瘤基质细胞，我们移植绿色荧光蛋白转基因表达全骨髓成致死剂量照射RFP批准的IACUC表达的小鼠。该被原位注入移植小鼠0ovarian切除肿瘤6-8周后移植和原籍骨髓标记（GFP）以及抗体标记物来检测肿瘤相关分析基质使用多光谱成像技术。然后，我们修改我们称之为复用蜂窝组成MIMicc - 多光谱讯问的方法，使用fluoroprobes的多光谱混合像元分解定量评估这些标记的细胞来自这起群体（以原价报告基因标签），并作为我们UNMIX 4,5能力，每张幻灯片增加6个或更多频谱，我们已经添加了细胞谱系或分化增加精度相关的其他免疫组化。利用软件来检测共定位复用的荧光信号，肿瘤间质的人群可追溯，枚举和特点的基础上标记染色。1
Introduction
了解组织的发育和修复是显著，以阐明在伤口愈合，2,3再生医学，发育生物学，肿瘤生物学参与细胞成分。正在修理的情况下，许多类型的细胞渗透到周围的微环境中血管生成，细胞外基质沉积，增殖和组织结构调整提供帮助。细胞因子和表型可以基于多参数，复用标记，可以识别定位，分化状态和所研究的微环境中的细胞成分之间的相互作用来识别。在这里，我们描述肿瘤的发展作为一个典型的例子为这个多色多细胞移植模型其次是多光谱成像和光谱分离的方法。
肿瘤进展是显着的几个收购功能，包括增强的扩散，一个多步骤的过程ntiapoptotic，浸润和血管生成特性。4肿瘤的发展是由被招募到周围环境中，以提供生长因子，结构基质，血管网络和免疫调节非肿瘤细胞容易。1,5,6这种微生包括衍生自细胞的本地，邻近的组织，例如脂肪，血管和遥远来源如骨髓衍生细胞1。非赘生性细胞结合的程度依赖于来自肿瘤，这往往对应于肿瘤的阶段/级的需求。理解肿瘤微环境中支持的作用，人们必须了解的非肿瘤细胞群的起源和分化潜能。
这个协议被设计在肿瘤进展的同时通过骨髓来源的细胞组分可视化的解释，以帮助和局部组织衍生工编细胞。利用荧光报告基因表达的转基因小鼠，我们移植GFP（绿色荧光蛋白）的骨髓成致死剂量照射的RFP（红色荧光蛋白）鼠标。继成功的骨髓移植，同基因肿瘤细胞系原位注入并允许嫁接4-8个星期。将所得的肿瘤是从小鼠切下并处理用于免疫荧光（IF）染色进行可视化的基质组分。复中频标记是一种常用的技术，它涉及显著优化7-9，不过使用的是多光谱成像/解混平台提高对于具有光谱重叠的荧光标记物的组合的可能性。在此，我们提出我们称之为复用蜂窝组成MIMicc，多光谱审讯染色及分析多达内对单张幻灯片肿瘤部分8标志物，以分析细胞起源，细胞分化ST的技术ATUS和元器件的肿瘤微环境内的细胞 - 细胞相互作用。这个简化的例子有在为了分析五个，六个或更多个标记物，利用抗体或细胞内的启动子驱动的荧光表达， 表1列出潜在荧光抗体染色组合以考虑相应的物种被扩展的可能性。
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Protocol
同基因小鼠骨髓移植（BMT）批准的机构IACUC协议（ 注：此协议的成功需要利用任何标记的细胞类型（S）的为多光谱的分析目标，并促进下游分析，人们可以利用任何遗传或稳定的细胞标记，我们建议的任何细胞，组织或器官将要能够应用于移植模型，而移植可以包含尽可能多的独特标记的种群为研究认为是有用的。此外，多重标记的蜂窝系统，如在转基因小鼠中发现包含多个谱系限制，荧光标记的人群，可以设计，以消除移植并发症的某些病理状态的研究。
- 致死量照射骨髓移植受体小鼠的9.5戈瑞四个小时单剂量重建与捐助骨髓前。 （GFP骨髓移植受者应该是6-10周龄）。
- 剪切，剥离回暴露后肢用无菌手术剪之前弄湿鼠标皮用70％乙醇。删除整个腿部，包括髂嵴在骶髂关节。通过削减略高于脚踝，然后从骨头彻底清除所有的肌肉，韧带和多余的组织丢弃的脚。冲洗骨髓从胫骨，fibia和髂嵴与使用2％无菌胎牛血清的PBS（PBS-2）一23号针头。 （BMT RFP捐助者应根据机构的标准被牺牲。）
- 片，并轻轻挤压剩余骨成使用手术刀和镊子的片段，然后放入50ml锥形管中与3微克/毫升胶原酶我1小时，在37℃，转速300rpm。
- 顶过管子用PBS-2和收集上清到一个新的试管，并结合冲洗细胞。降速以250rpm的转速为5分钟，在4°C。
- 重悬细胞于PBS-2，并通过40纳米细胞过滤器过滤。在这一点上，该细胞可以被标记为fluorescen吨激活细胞分选（FACS）如果一个人想操纵的BMT特定人群。
- 重悬，每100微升PBS 2×10 6个细胞，每只小鼠。使用29号针头由尾部或眶后静脉斜角朝上系统地注入绿色荧光蛋白照射受体小鼠。注入一个鼠标用100微升PBS仅作为植入控制。用热灯前注射扩张血管和注射后用尾静脉注射克制。有无菌纱布可应用于光压到尾后注入。
- 三周后BMT，收集血液眼窝并通过流式细胞术分析，以确认GFP的循环细胞的存在和不存在的RFP循环细胞。控制鼠标会在这一点上已经死亡。
2。肿瘤移植植入据机构IACUC准则
- 成长ID8 体内注射液（1×10 6 C前卵巢鼠的肿瘤细胞在体外每只小鼠的ELL）。注射的当天，胰蛋白酶消化细胞，用PBS洗涤，用PBS重悬在每100μl的1×10 6个细胞。
- 注射肿瘤细胞到小鼠的intaperitoneal腔，针应当斜面朝上。灭菌注射的视线用70％乙醇。注入左下或腹部右下象限（颅稍内侧到下集的雌性小鼠腹部乳头），避免撞上器官。由颈背抓握住尾巴与小指或无名指抑制小鼠。小鼠可以用异氟烷麻醉用于此过程。
- 牺牲小鼠时肿瘤细胞植入的迹象，比如轻微腹胀，是显而易见的。这将发生在4-12个星期。
- 消费肿瘤来自IP腔。在腔内肿瘤的样子就和周围器官的表面的白色结节。用解剖刀，取出肿瘤并放置在10％福尔马林24小时固定的管/罐。组织学p赔偿可以外判予病理学/组织学的核心，如果试剂和材料不容易获得的石蜡包埋和幻灯片的准备。部组织成5-8微米切片载玻片上用于随后的染色过程。
3。多参数免疫荧光染色
- 准备单色控制幻灯片的每个荧光探针在实验中使用。在这种情况下，四种颜色的使用。因此，四张幻灯片为每个单独的颜色以及背景噪声的控制和完整的组合染色最后一张幻灯片一张幻灯片。 （共载玻片= 6）所有的幻灯片将被处理并排以相同的方式，以减少实验误差。
- 烤石蜡切片，在56℃下反应1小时。
- 洗涤载玻片3倍10分钟，二甲苯等。
- 洗2×5分钟，100％乙醇中。
- 洗涤1X 3分钟95％的乙醇
- 洗涤1X 2 min90％的乙醇。
- 洗涤1X 2 min70％的乙醇。
- 在最后一次洗涤系列，2分钟（微波高）预煮柠檬酸钠缓冲液。 （可以用Tris EDTA缓冲液根据所使用的抗体取代）
- 在柠檬酸钠缓冲液（微波对10％的电力，或在高压锅）煮沸的幻灯片20分钟。如果缓冲区沸腾，关掉微波炉，让坐。
- 从热源取出，放幻灯片休息30分钟，在柠檬酸钠缓冲液降温。
- 冲洗载玻片在水中5分钟。
- 周围的肿瘤切片用巴氏钢笔标记，并把2％BSA / 1％FBS的马来酸的封闭缓冲液1小时。单独准备的幻灯片，以不让他们在这一步干出来的。
- 在封闭缓冲液中制备的初级抗体在最佳稀释。 （如果使用的抗体是所有不同种类的（或IgG链的变化，例如：IgG1的对同一物种的IgG2a的），他们可能会期间作为组合使用英格尔潜伏期。如果抗体物种重叠，然后孵育，必须依次进行，以减少抗体的交叉反应。）
- 在这一点上，留下两个幻灯片，只有封闭液。这两个幻灯片将作为未染色的对照和核染色控制。其他单一色彩控制将孵育个别主要抗体。只有在分析滑动将具有第一抗体的结合。
- 孵育在在上缓慢旋转摇床的水分腔框幻灯片与第一抗体4℃过夜（〜16-20小时）（ 注：带4 +的荧光团，连续染色法或直接缀合工作时可能是必要的，以减少抗体的交叉反应在这情况下重复步骤1.16-1.21直到所有的抗体应用于幻灯片。）
- 在PBST 10分钟（2个）轻轻振动筛洗幻灯片
- 虽然洗是怎么回事，准备Alexafluor 488，594和647的二抗的最终稀释在封闭缓冲液中1:1000。 （确保这些抗体和稀释液保存在4℃，并在黑暗中在任何时候都保持荧光跨批次和时间的推移）。
- 在单色控制幻灯片，放置单个Alexafluor稀释匹配使用的主要抗体的物种。所有的二抗将被放置在分析滑动。未染色和核深染控制幻灯片将继续留在封闭液经过该步骤。
- 孵育在缓慢旋转振荡器在室温下2小时的保湿室箱（用铝箔覆盖，避免光线照射）。
- 5分钟在PBST（2个）轻轻振动筛洗幻灯片。盖上铝箔避光。
- 加DAPI（1:10,000），持续1分钟到DAPI只幻灯片和分析滑动 。盖上铝箔避光。其他幻灯片可能会留下覆盖在洗涤容器。
- 洗两DAPI孵育在第5分钟，洗涤，以不会污染其他幻灯片用DAPI染色单独的容器中滑动。对于第二个5分钟的洗涤，幻灯片可以在PBST中进行组合（所有洗涤液应在振荡器上进行的）。盖上铝箔避光。
- 在水中浸简要滑梯前盖片（1.5厚度与水的安装介质保存荧光）
- 让干燥3小时，在黑暗中在室温。
- 密封盖玻片用指甲硬化剂的边缘。 （不要使用指甲油的丙酮可淬的荧光信号）。
- 立即分析幻灯片或在4℃保存，供日后分析。
4。多光谱成像
- 收集的OLYMPUS X-63正置显微镜与Nuance的软件，用于数据收集利用Nuance的EX摄像机（含液晶可调谐滤波器）多光谱影像。
- 使用油浸物镜来提高分辨率搜集图像。
- 创议l设置了包括设置光谱范围为每个使用中的荧光团。
- 对于4色：
- DAPI：420-480nm波长
- AF488：490-580nm范围内
- AF594：590-640nm的
- AF647：650-720nm以下
- 对于4色：
- 取分析滑动的初始图像，以获得适当的曝光时间对于每个光谱范围内的。
- 创建“光谱库”，该软件将用来识别和区分彼此的信号与噪声的荧光团的比例和背景信号。 （ 注：每个荧光染料必须有自己的单一色彩控制幻灯片以组装与适当波长曲线的光谱库，以确保数据集的正确分析举例：3荧光= 4控制幻灯片; 5荧光= 6控制幻灯片）。
- 图像的未染色的幻灯片第一。这张幻灯片将频谱图书馆，A内指定Ÿ为背景 。>
- 图像的DAPI只滑动秒。这张幻灯片将用于指定DAPI染色细胞核与“画”的工具，将谱库为DAPI内保存。>
- 图像的AF488只滑动三分之一。这张幻灯片将用于指定AF488染色区域与“画”的工具，将谱库为AF488内保存。>
- 图像的AF594只滑第四名。这张幻灯片将用于指定AF594染色区域与“画”的工具，将谱库为AF594内保存。>
- 图像的AF647只滑第五名。这张幻灯片将用于指定AF647染色区域与“画”的工具，将谱库为AF647内保存。>
- 下列各个频谱分量的集合，保存该谱库和协议。>
- 一旦谱库完成后，找到自己感兴趣的区域上的显微镜分析幻灯片 ，并收集/保存图像。>
5。多光谱图像的定量分析
- 导入使用的InForm软件收购Nuance的图像的代表品种。
- 打开保存的谱库中所指示的程序
- 确定感兴趣的组织区域进行分析。 （ 如肿瘤组织与脂肪组织）。
- 确定基于DAPI染色的单个细胞。细胞质将自动基于所述核的形状来限定。
- 挑荧光强度读出所选择的每个荧光参数（ 如平均值，标准偏差）
- 一批采集的图像，并让使用该算法的软件过程。
- 当图像处理结束后，合并结果文件。
- 打开结果在Excel（或任何其他分析软件）和暗算对方两种荧光强度的XY轴。各荧光强度每单元给出。的双阳性细胞将出现在右上象限。用户必须定义基线荧光强度。
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Representative Results
利用多光谱成像技术来分析肿瘤植入在我们的转基因骨髓移植小鼠模型，我们能够辨别间质瘤组件是骨髓来源。初始BMT证实3周移植后通过流式细胞术（ 图1）。原位注射未标记卵巢肿瘤BMT后确认植入切除和福尔马林固定的6周后最初的肿瘤注射。石蜡包埋的肿瘤切片，切片在<8μm的切片和染色。适当的单一色彩控制幻灯片的每个荧光基团包括一个用于背景自发荧光而进行。 表1列出了潜在的实物和荧光组合2-7参数。继染色过程中，使用的是Nuance的相机附件，Nuance的软件进行采集的图像。创建谱库用单色控制幻灯片（ 图2A）后，我们瓦特的ERE能够“UNMIX”的拍摄的显示（抗体＃1）随着核的DAPI和其他两个标记GFP表达多重标记的卵巢肿瘤切片图像（抗体＃2和＃3）。 （ 图2B）加法的多种标记物是可能的，并且图2C-D示出了具有六个标志加上一个核染色肿瘤部分的图像。最后，所有采集的图像被导入的InForm（CaliperLS，霍普金顿，MA）软件进行分析。 Nuance公司（CaliperLS，霍普金顿，MA）软件与其他包一样的MetaMorph（Molecular Devices公司）或IPLab（Scanalytics，BD公司）兼容。此外，图像和光谱数据集，也可以保存为TIFF文件和读取该文件格式的任何程序中查看。使用的InForm软件，我们能够对感兴趣的肿瘤切片中的组织区域（ 图3A和E）进行分类，并设置算法的每个细胞浅各荧光染料的荧光强度版上的DAPI核染色（ 图3B-C）。最后，我们可以绘制基于两种标记物，AF488和AF647（ 图3D）的荧光强度的每个单独的单元格。我们建立了一个双阳性细胞群的基础上所确定的荧光强度的阈值（ 图4）。作为数据集变得更复杂具有多个参数，有潜在的用铲软件10（的密度归一化的事件生成树级数分析）来分析数据，尽管这尚未被执行。此软件可共表达趋势在大数据集的可视化，并且可以暗示集群分析组织切片内共表达标记之间的关联/关系。
表1中。 2-7彩色多重染色免疫荧光染色控制的准备。 （a）包括最多四色选项（B） （C）包括可见光光谱内的七种颜色选项的抗体七色选项。
图1。骨髓移植的确认通过流式细胞仪。 （A）中的GFP转基因受体小鼠为正（B）为RFP +造血细胞相比，控制RFP +和GFP +细胞控制的GFP +小鼠和阴性（C）内循环的造血细胞群的点积。
图2。未混合光谱图像处理。 （A） （二）多光谱图像显示荧光标记的细胞小鼠的卵巢肿瘤的部分;＃1：AF488（前495纳米/ EM 510纳米）;＃2 ：AF594（ex590/em617纳米）;＃3：AF647（前650/em 668 nm）和核：DAPI（前350/em 470纳米）。单一颜色显示为白色的卵巢肿瘤切片分析创造了7彩光谱库中的（C）截图（D）多光谱图像显示荧光标记的细胞小鼠的卵巢肿瘤的部分;核：。DAPI（ex350/em470纳米）; AF488（前495/em 519纳米），AF514（ex518/em540纳米）; AF568（前578/em 603纳米），AF594（前590/em 617纳米），AF633（前632/em 647纳米）; AF660（前663/em 690 nm）和。单一颜色显示为白色，以及相匹配的复合色。 点击这里查看大图 。
图3。定量MIMicc描写通知分析。 （一）首先形象代表组织分部其次是（B）基于核DAPI染色细胞的分割分类（C）荧光标记的定量可以在细胞核和细胞质中进行测量，并出口到（D） Excel作进一步分析。（五）组织的分割算法，能够进一步识别基于组织结构，而不是仅仅对荧光鉴定提供了更强大的分析工具，在不同的组织区域分类染色组织亚型。在此图像中，电脑已经被训练识别5分区域的基础上architectura组织内升图案：背景是由空格定义，溶血性肿瘤是由丰富的组织内红细胞定义，肿瘤是由人口密集的单元格定义，脂肪是由大的，对称的，空的细胞区室的定义，肌肉由条纹图案定义。 点击这里查看大图 。
图4。从20获得的图像的单个细胞的情节显示了基于GFP的荧光强度标有AF488和αSMA标有AF647的双阳性细胞。
补充文件。 提示和技巧复用5个或更多的探针。
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Discussion
本文中我们描述了多光谱成像的应用中，我们描述了作为复用的细胞组合物MIMicc-多光谱询问，以分析肿瘤微环境中的源自骨髓的间质成分，但是这种方法和概念可以应用于破译了组成一个复杂的其他细胞成分组织中，例如在伤口愈合反应或再生组织中看到。在这些实验中，我们利用转基因小鼠中，以荧光从内植入肿瘤微环境中的宿主来源的细胞区分骨髓来源的细胞，但该技术适合于使用任何报告基因标记的细胞，并且特别易于进行细胞表达基因的标签很容易被免疫组化可辨，如LacZ基因，葡萄糖醛酸酶，他（6X） - HA，FLAG标签标记的细胞， 等 11。
在我们的模型中，继移植小鼠的牺牲，肿瘤切片处理，染色的抗体，以确定细胞的来源;源性RFP +骨髓捐赠者或GFP +宿主组织来源。在图2中，我们展示两个标记共表达用宿主衍生的GFP +肿瘤微环境内的细胞。然而，我们显示了使用相同的系统在图2D 7色染色的潜力。
这些数据是对什么是能够利用我们的移植及多光谱成像模型的表示。这个系统是非常灵活的，可以容纳更多的参数，包括：1，改变了骨髓移植的人群/转基因小鼠模型，2 -交替肿瘤/疾病模型，或3 -备用标记（ 如表面，细胞内，磷酸化蛋白质）。通常情况下，用同一张幻灯片上提高免疫组织化学染色的数字，数据分析变得艰巨，但是用多光谱成像平台和阿索ciated混溶软件可实现高效，可靠和可重复的结果。我们提供了潜在的抗体种类，并在表1荧光标记物的组合。此外，该技术允许因为使用这两种冷冻和石蜡包埋的组织切片使得这种技术适用于除了基本的研究模型临床组织样本的潜在的多功能性在探针/抗体选择。
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Disclosures
FCM，招商银行和ELS有没有冲突，并没有透露。
Acknowledgments
我们感谢来自博士的讨论，指导和支持。迈克尔Andreeff博士。，和Jared伯克斯博士。从MD安德森流式细胞仪和细胞成像核心设施。这项工作是由美国国家癌症研究所（RC1-CA146381，CA-083639，R01NS06994，CA116199和CA109451对于FCM部分资金。ELS是由国防部陆军部（BC083397）也支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||||||||||||||||
| .2 μm filter | Fisher | 09-740-35A | |||||||||||||||||||||||||||||
| 10 ml lure lock | BD | 309604 | |||||||||||||||||||||||||||||
| 25 G needle | Cardinal | BF305122 | |||||||||||||||||||||||||||||
| 40nm filter | BD | 352340 | |||||||||||||||||||||||||||||
| 50 ml conical tube | Fisher | 1495949A | |||||||||||||||||||||||||||||
| Alexafluor 488-ms1 | invitrogen | A21121 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Alexafluor 594-Rb | invitrogen | A21207 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Alexafluor 647-ch | Invitrogen | A21449 | |||||||||||||||||||||||||||||
| BSA | Sigma | A7906-500G | |||||||||||||||||||||||||||||
| Cover slips | Corning | 2940-243 | |||||||||||||||||||||||||||||
| CRI-Nuance | Caliper Life Sciences | ||||||||||||||||||||||||||||||
| Dapi | Invitrogen | D1306 | |||||||||||||||||||||||||||||
| DMEM | CellGro | 10-017-CV | |||||||||||||||||||||||||||||
| Ethanol | Dharmacon | 4004-DV | |||||||||||||||||||||||||||||
| FBS | invitrogen | 16000-044 | |||||||||||||||||||||||||||||
| GFP-ms1 | Abcam | ab38689 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Insulin needle | BD | 329424 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Maleic acid | Acros | 100-16-7 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Moisture chamber box | Evergreen | 240-9020-Z10 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Mounting media | dako | S3023 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Nail hardener | Sally Hansen | 2103 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Pap pen | Abcam | Ab2601 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Pen/Strep L Glut | invitrogen | 10378016 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Steril PBS | invitrogen | 14040-182 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Trypsin | invitrogen | 252000-56 | |||||||||||||||||||||||||||||
Blocking Buffer
Antigen retrieval buffers:
|
|||||||||||||||||||||||||||||||
References
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