Summary
Сложные массы ткани, из органов к опухолям, состоят из различных клеточных элементов. Мы выяснены вклад сотовых фенотипов в ткани с использованием мульти-меченых флуоресцентными трансгенных мышей в сочетании с окрашиванием многопараметрических иммунофлуоресцентным последующим спектральным несмешивания расшифровать клеток происхождение, а также характеристики клеток, основанные на экспрессии белка.
Abstract
С желанием понять вклад нескольких клеточных элементов в развитие сложной ткани, такие, как многочисленных типов клеток, участвующих в регенерации ткани, образование опухолей, или васкулогенез, мы разработали разноцветные сотовой трансплантата модель развития опухоли у которые популяции клеток происходят из различных флуоресцентно цветных гена-репортера мышей и пересаживают, привиты или вводят в и вокруг развивающейся опухоли. Эти цветные клетки затем на работу и включены в строме опухоли. Для того, чтобы количественно оценить костного мозга стромальные клетки опухоли, мы трансплантировали GFP выражения трансгенного весь костный мозг летально облученных в RFP, экспрессирующих мышей, утвержденной IACUC. 0ovarian опухоли, которые были ортотопически вводили в трансплантированных мышей вырезали 6-8 недель после приживления и анализировали на маркера костного мозга происхождения (GFP), а в качестве маркеров для выявления антител, ассоциированных с опухольюстромы с помощью мультиспектральных методов визуализации. Затем мы адаптировали методику мы называем MIMicc-Мультиспектральный Допрос мултиплексу сотовых композиций, используя мультиспектральных расслоении fluoroprobes количественно оценить, какие помечены ячейки пришли из которых, начиная населения (на основе оригинальных гена-репортера этикеток), и, как нашей способности unmix 4, 5 , 6 или более спектры в увеличении слайд, мы добавили дополнительную иммуногистохимию связанный с клеточных клонов или дифференциации повышения точности. Используя программное обеспечение для обнаружения совместно локализованные уплотненные-люминесцентные сигналы, популяции стромальных опухолей можно проследить, перечисленные и характеризующиеся на основе окрашивания маркера. 1
Introduction
Понимание развития и восстановления тканей имеет важное значение для выяснения, участвующих клеточные компоненты в заживлении ран, 2,3 регенеративной медицины, биологии развития и биологии опухоли. В условиях ремонта, многочисленные типы клеток проникнуть в окружающую микросреду, чтобы помочь в васкуляризации, осаждения ECM, пролиферации и реструктуризации ткани. Клеточные факторы и фенотипы могут быть определены на основе многопараметрических, мультиплексированных маркеров, которые могут идентифицировать локализацию, состояние дифференциации и взаимодействия между клеточными компонентами в пределах исследуемого микросреды. Здесь мы описываем развитие опухоли как прототип, например, для этого многоцветного-многоклеточные модели трансплантации последующим мультиспектральных изображений и спектрального методологии несмешивания.
Прогрессия опухоли является многоэтапный процесс, который характеризуется несколько приобретенных возможностей, которые включают повышенную пролиферацию, а,ntiapoptotic, инвазивные и ангиогенные свойства. 4 Развитие опухоли способствует неопухолевых клеток, которые набранных в окружающую среду, чтобы обеспечить факторы роста, структурные матрицы, сосудистых сетей и иммунную модуляцию. 1,5,6 Это микросреда состоит из клеток, полученных из местные, соседние ткани, такие как жировой, и кровеносные сосуды и далекие источники, такие как костного мозга, полученных клеток 1. Степень неопухолевых включения клеток зависит от спроса со стороны опухоли, которая часто соотносится с этапа / сорта опухоли. Чтобы понять роль опухоли поддерживающей микросреды, нужно понять происхождение и дифференциации потенциал населения неопухолевых клеток.
Этот протокол был разработан, чтобы помочь в интерпретации опухолевой прогрессии через визуализации обеих костного мозга, полученных клеточных компонентов, и местные DERIV тканиред клетки. Используя флуоресцентные репортер генов, экспрессирующих трансгенных мышей, мы пересадили GFP (зеленый-флуоресцентный белок) костного мозга в летально облученных RFP (красно-флуоресцентный белок) мыши. После успешного приживления костного мозга, сингенными линия клеток опухоли вводится ортотопически и позволило привить в течение 4-8 недель. В результате опухоль вырезали из мыши и обработаны для иммунофлуоресцентного (ИФ) окрашивания для визуализации стромальных компонентов. Мультиплексирование ЕСЛИ маркеры является широко используемым методом, который включает в себя значительную оптимизацию 7-9, однако с использованием мультиспектральных изображений / несмешивания платформу улучшает потенциал для люминесцентных комбинаций маркеров, которые обладают спектральной перекрытие. Здесь мы представляем технику мы называем MIMicc-мультиспектральный допрос мултиплексу сотовых композиций для окрашивания и анализировать до восьми маркеров в рамках секции опухоли на одном слайде для анализа клеточных происхождение, клеточной дифференцировки улАТУС и межклеточные взаимодействия компонентов внутри микросреды опухоли. Это упрощенный пример имеет потенциал, чтобы быть расширена на для анализа пять, шесть или более маркеров, использующие антитела или внутриклеточная промоутер управляемой люминесцентные экспрессии. В таблице 1 приведены потенциальные люминесцентные комбинаций окраски антитела с соответствующими видами учитывать.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Сингенная мышиный Пересадка костного мозга (ТКМ), утвержденного институциональных протоколов IACUC (Примечание: Успех этого протокола требуется использование любой надписью типа (типов) клеток в качестве цели для мультиспектральных анализа, а также содействовать потоку анализ, можно использовать любой генетический или стабильной сотовой маркировка. Мы полагаем, что любая клетка, ткань, орган или-к-быть может быть применен к модели трансплантата и что трансплантат может содержать множество уникальных меченых популяции как исследование считает полезным. Кроме того, мульти-меченого сотовые системы , таких, как те, что в трансгенных мышей, содержащий множественное происхождение ограниченным флуоресцентно меченных населения-могут быть разработаны для устранения трансплантации осложнений для изучения некоторых патологических состояний.
- Летально облучать мышей-реципиентов BMT с одной дозой 9,5 Гр четырех часов до восстановления с донором костного мозга. (Получателей BMT GFP должно быть 6-10 недельного возраста).
- Смочите шкуру мыши с 70% этанола до отсечки и пилинг его обратно, чтобы разоблачить задние конечности стерильными хирургическими ножницами. Удалить всю ногу включая гребня подвздошной кости в крестцово-подвздошных сочленений. Откажитесь от ногу за счет сокращения чуть выше лодыжки, а затем тщательно удалить все мышцы, связки и лишнюю ткань из кости. Флеш мозг от голени, fibia и гребня подвздошной кости с иглой 23 G с использованием 2% FBS в стерильные PBS (PBS-2). (BMT RFP доноры должны быть принесены в жертву в соответствии с институциональными нормами.)
- Срез и осторожно раздавить оставшиеся кости на фрагменты с помощью скальпель и пинцет, а затем поместить в 50 мл коническую пробирку с 3 мкг / мл коллагеназы I в течение 1 часа при 37 ° С при 300 оборотах в минуту.
- Завершают трубку с PBS-2 и собрать супернатант в новую пробирку и смешать с румянцем клеток. Спин вниз на 250rpm в течение 5 мин при 4 ° С.
- Ресуспендируют клеток в PBS-2 и фильтруют через 40 фильтра нм клеток. В этот момент клетки могут быть помечены для fluorescenт Активированный сортировки клеток (FACS), если кто-то хочет манипулировать конкретные группы населения, для ТКМ.
- Ресуспендируют 2 х 10 6 клеток на 100 мкл PBS, на мышь. Используйте 29 г иглы для системно впрыснуть в облученных мышей-реципиентов GFP хвостом или ретро-орбитальной вены-конической стороной вверх. Введите одну мышь с 100 мкл PBS только в качестве контроля приживления. Используйте тепла лампы, чтобы расширить сосуды перед инъекцией и использовать в хвостовую вену впрыска сдержанность при инъекции. Есть стерильную марлю доступный для применения светового давления инъекции в хвостовую сообщению.
- Три недели после ТКМ, собирать ретро-орбитально крови и анализ с помощью проточной цитометрии, чтобы подтвердить наличие GFP циркулирующих клеток и отсутствие RFP циркулирующих клеток. Управление мышью умрет в этой точке.
2. Опухоль Приживление По институциональных IACUC Руководства
- Расти ID8 яичников мышиных опухолевых клеток в пробирке до в естественных условиях инъекций (1 х 10 6 грлоктей на мышь). День инъекции, Trypsinize клетки, промывают PBS и ресуспендируют в PBS в 1 х 10 6 клеток на 100 мкл.
- Введите опухолевых клеток в intaperitoneal полости мыши, игла должна быть конической стороной вверх. Стерилизовать впрыска прицел с 70% этанола. Введите в левом нижнем углу или правом нижнем квадранте живота (черепной и слегка медиально к нижней набора брюшной соски женской мыши), избежать столкновения органы. Задержите курсор, захватывая за шкирку и проведение хвост с мизинец или безымянном пальце. Мыши могут быть анестезируют изофлураном для этой процедуры.
- Жертвоприношение мышей, когда признаки приживления опухоли, такие как небольшой вздутие живота, являются очевидными. Это произойдет более 4-12 недель.
- Акцизные опухоли от IP полости. Опухоли внутри полости будет выглядеть белыми узелков на поверхности органов и вокруг. С помощью скальпеля, удалить опухоли и поместите в трубке / банку 10%-ного формалина в течение 24 часов записи. Гистологическое рвозмещение может быть из-источников, чтобы патология / гистологии ядра, если реагенты и материалы не являются легкодоступными для парафин и подготовки слайд. Раздел ткани в 5-8 мкм ломтики на стеклах для последующих процедур окрашивания.
3. Многопараметрическая Иммунофлуоресцентное Окрашивание
- Подготовка Single слайды управления цветом для каждого флуоресцентного зонда, используемого в эксперименте. В этом случае используются четыре цвета. Таким образом, четыре горки для каждого отдельного цвета, а также один слайд для контроля фонового шума и, наконец, одного слайда для полного окрашивания комбинированной. (Всего скользит = 6) Все слайды будут обработаны бок о бок в идентичным образом, чтобы минимизировать экспериментальную вариации.
- Выпекать парафиновых срезов при 56 ° С в течение 1 часа.
- Вымойте слайды 3x 10 мин в ксилоле.
- Вымойте 2x 5 мин 100% этанола.
- Вымойте 1x 3 мин 95% этанола
- Вымойте 1x 2 min90% этанола.
- Вымойте 1x 2 min70% этанола.
- Во время последней серии стирки, предварительно кипятить цитрат натрия буфера в течение 2 мин (СВЧ на высокий). (Можно заменить с Трис-ЭДТА буфере в зависимости от антител в использовании)
- Отварить слайды в течение 20 мин в натрия буфера цитрата (СВЧ на 10% мощности или в скороварке). Если буфер закипит, выключить микроволновку и пусть сидят.
- Удалить из источника тепла и пусть слайды отдохнуть в течение 30 мин в буфере цитрата натрия, чтобы остыть.
- Промыть слайды в воде в течение 5 мин.
- Mark вокруг опухолевых срезах с Pap Перо и положить 2% BSA / 1% FBS малеиновую кислоту блокирующем буфере в течение 1 часа. Подготовьте слайды индивидуально, чтобы не позволить им высохнуть на этом этапе.
- Подготовка первичных антител при оптимальном разведении в блокирующем буфере. (Если антитела в использовании все из различных видов (или IgG цепь изменение экс-: IgG1 против IgG2a того же вида) они могут быть использованы в сочетании в течение какИнгл инкубационный период. Если антитела видов перекрываются, то инкубации должна осуществляться последовательно, чтобы минимизировать перекрестные антитела реакцию.)
- На данный момент, оставить две горки с блокировки только буфер. Эти две горки будет служить незапятнанной контроля и контроля над ядерными пятен. Другие единичные управления цветом будет инкубировали с отдельных первичных антител. Только анализ слайд будет иметь сочетание первичных антител.
- Выдержите слайды с первичным антителом в камерном влаги коробке на медленно вращающейся качалке при 4 ° в течение ночи (~ 16-20 час) (Примечание: при работе с 4 + флуорофорами, последовательного окрашивания или прямого сопряжения может быть необходимо, чтобы минимизировать антител кросс-реакцию . В этих условиях повторить шаги 1,16-1,21, пока все антитела не применяются к слайдам.)
- Промыть слайдов в течение 10 мин в PBST (2х) осторожно на шейкере
- В то время как мыть собирается, подготовить AlexaFluor 488, 594 и 647 вторичных антител для конечного разведения1:1000 в блокирующем буфере. (Убедитесь, что эти антитела и разведения хранить при температуре 4 ° С и в темноте во все времена, чтобы сохранить флуоресценции через партиями и с течением времени.)
- На отдельных слайдов управления цветом, поместите одиночные разведения AlexaFluor, соответствующие виды первичного антитела используются. Все вторичные антитела будут размещены на анализ слайда. В неокрашенные и ядерные окрашенных слайды управления останется блокирующим буфером в течение этого шага.
- Выдержите в камерном влаги окне (покрытой алюминиевой фольгой для предотвращения попадания света) на медленной вращающейся качалке при комнатной температуре в течение 2 часов.
- Промыть слайдов в течение 5 мин в PBST (2х) осторожно на шейкере. Накрыть алюминиевой фольгой для защиты от света.
- Добавить DAPI (1:10000) в течение 1 мин к DAPI только горкой и анализа слайда. Накрыть алюминиевой фольгой для защиты от света. Остальные слайды могут быть оставлены покрыты промывных емкостей.
- Вымойте два ДАПИ инкубировалислайды в отдельной емкости в течение первых 5 мин стирки, чтобы не загрязнить другие слайды с DAPI пятна. Для второго 5 мин стирки, слайды могут быть объединены в PBST (все моет следует проводить на шейкере). Накрыть алюминиевой фольгой для защиты от света.
- Кратко погружные скользит в воде, прежде чем крышка-скольжения (1,5 толщины с водных монтажных СМИ для сохранения флуоресценции)
- Дайте высохнуть 3 ч в темноте при комнатной температуре.
- Печать края покровного стекла с лаком для отвердителя. (Не используйте лак для ногтей, как ацетон может утолить флуоресцентного сигнала).
- Сразу Анализ слайды или хранить при 4 ° С для последующего анализа.
4. Мультиспектральных изображений
- Сбор мультиспектральных изображений, использующие камеру Нюанс EX (содержащий жидкокристаллический фильтр перестраиваемый) на Olympus X-63 прямой микроскоп с Nuance программного обеспечения для сбора данных.
- Сбор фотографий с использованием масляного цели увеличить разрешение.
- Первол установка включает в себя установку спектральный диапазон для каждого флуорофора в использовании.
- Для 4 цвета:
- DAPI: 420-480nm
- AF488: 490-580nm
- AF594: 590-640nm
- AF647: 650-720nm
- Для 4 цвета:
- Возьмем начальное изображение анализа ползуна для получения надлежащих время экспозиции для каждого из спектральных диапазонов.
- Создание "спектральные библиотеки", что программное обеспечение будет использовать для выявления и отделить отношение сигнал-шум из флуорофорами друг от друга и фоновый сигнал. (Примечание: Каждый флуорохромом должен иметь свой собственный отдельный слайд управления цветом для того, чтобы собрать спектральную библиотеку с соответствующими кривыми длин волн для обеспечения надлежащего анализа набора данных Пример: 3 флуорофоры = 4 горки контроля; 5 флуорофоры = 6 горки Control.).
- Изображение неокрашенных слайд первым. На этом слайде будут обозначены в спектральном Librarу в качестве фона.>
- Изображение DAPI только скользить второй. На этом слайде будет использоваться для обозначения DAPI-окрашенные ядра с помощью инструмента "привлечь" и будет сохранен в спектральном библиотеки как DAPI.>
- Изображение AF488 только скользить треть. На этом слайде будет использоваться для обозначения AF488-окрашенные регионы с помощью инструмента "привлечь" и будет сохранен в спектральном библиотеки как AF488.>
- Изображение AF594 только скользить четвертый. На этом слайде будет использоваться для обозначения AF594-окрашенные регионы с помощью инструмента "привлечь" и будет сохранен в спектральном библиотеки как AF594.>
- Изображение AF647 только скользить пятый. На этом слайде будет использоваться для обозначения AF647-окрашенные регионы с помощью инструмента "привлечь" и будет сохранен в спектральном библиотеки как AF647.>
- После сбора каждого отдельного спектрального компонентасохранить спектральные библиотеки и протокол.>
- После того, как спектральная библиотека будет завершена, найти интересующие участки на анализ слайда на микроскопе и собирать / сохранения изображений.>
5. Количественный анализ мультиспектральных изображений
- Импорт представительный ассортимент получаемых изображений Nuance использованием InForm Software.
- Откройте сохраненный спектральные библиотеки в соответствии с указаниями программы
- Определить ткани регионах, представляющих интерес для анализа. (Например, опухоли тканей по сравнению с жировой ткани).
- Определить отдельные ячейки на основе DAPI-пятно. Цитоплазма будет определяться автоматически в зависимости от формы ядра.
- Выберите интенсивность флуоресценции считывания выбора для каждого флуоресцентного параметра (например, среднее значение, стандартное отклонение)
- Пакетная полученных изображений и пусть процесс программного обеспечения с помощью предложенного алгоритма.
- Когда обработка изображений закончена, объединятьрезультирующие файлы.
- Откройте результаты в Excel (или любой другой аналитической программного пакета) и земельный участок два флуоресцентных интенсивности друг против друга на XY оси. Каждый интенсивность флуоресценции дано на клетку. Двойные позитивные клетки появится в правом верхнем квадранте. Пользователь должен определить базовые люминесцентные интенсивности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Использование мультиспектральных метод воображения для анализа опухолей насаждаемое в нашей трансгенной модели ТКМ мыши, мы можем различить стромальных компонентов опухоли, которые происхождения костного мозга. Первоначальный БМТ было подтверждено три недели после трансплантации с помощью проточной цитометрии (рис. 1). Ортотопически вводят немеченые опухоли яичников следующие BMT приживления подтверждения вырезали и фиксированных формалином 6 недель после первой инъекции опухоли. Парафином опухолевые срезы в <8 мкм ломтиками и окрашивают. Соответствующие одиночные горки управления цветом были сделаны для каждого флуорофора в том числе один для фона флуоресценции. Таблица 1 включает в себя потенциальную звонкой и флуорохромом комбинации для 2-7 параметров. В соответствии с процедурой окрашивания, изображения были получены с использованием монтажа камеры Nuance и Nuance Software. После формирования спектрального библиотека с отдельных слайдов управления цветом (рис. 2A), мы жпрежде чем сможет "unmix" образы мульти-меченых яичников опухолевых срезах, которые были приняты, показывающий экспрессию GFP (антитело # 1) вместе с атомной DAPI и двух других маркеров (антитела # 2 и # 3). (Рис. 2В) Добавление более маркеров можно и цифры 2C-D показывает образ разделе опухоли с шестью маркерами плюс ядерной пятно. Наконец, все полученные изображения были импортированы в ИНФОРМ (CaliperLS, Hopkinton, Массачусетс) программного обеспечения для анализа. Нюанс (CaliperLS, Hopkinton, Массачусетс) Программное обеспечение совместимо с другими пакетами типа Метаморф (Molecular Devices) или IPLab (Scanalytics, BD Biosciences). Кроме того, изображения и спектральные наборы данных могут быть сохранены как в формате TIFF файлы и просматривать в любой программе, которая читает этот формат. Использование сообщить Software, мы смогли классифицировать ткани регионах, представляющих интерес в рамках секциях опухолевых (рис. 3А и Е) и установить алгоритмы для флуоресцентных интенсивностей каждого флуорохромом на клеточных БАСизд на DAPI окрашивающим ядра (фиг. 3B-C). Наконец, мы смогли построить каждый отдельный элемент на основе флуоресцентных интенсивностей двух маркеров, AF488 и AF647 (рис. 3D). Мы создали двойной положительный клеточной популяции на основе определенного флуоресцентного порога интенсивности (рис. 4). Как набор данных становится более сложной с несколькими параметрами, есть потенциал для данных, которые будут проанализированы с использованием лопатой программное обеспечение 10 (связующего дерева прогрессии анализ плотности нормированных событий), хотя это до сих пор не выполнены. Это программное обеспечение позволяет визуализировать тенденции коэкспрессии над большими наборами данных и может подразумевать Ассоциация / отношения между кластерами совместно выраженных маркеров в пределах анализируемых срезах тканей.
Таблица 1. Подготовка контроль окрашивание Иммунофлуоресцентное для 2-7 окрашивания цвет мультиплекса. (А) включает в себя до опции четыре цвета. (В) (C) включает в себя опцию семь цвета в пределах видимого спектра.
Рисунок 1. Костный мозг подтверждение трансплантации с помощью проточной цитометрии. (A) Dot участок циркулирующего гемопоэтических клеток населения в пределах GFP трансгенной мыши-реципиента, который является положительным (B) для RFP + гемопоэтических клеток по сравнению с контрольными RFP + и контролировать GFP + мышей и отрицательный (С) в течение GFP + клеток.
Рисунок 2. Спектрально несмешанный образ процесса. (A) (В) Мультиспектральный изображение мышиным яичников разделе опухоли показывая флюоресцентно меченых клеток; # 1: AF488 (экс 495 нм / EM 510 нм); № 2 : AF594 (ex590/em617 нм); # 3: AF647 (экс 650/em 668 нм) и ядерное топливо: DAPI (экс 350/em 470 нм). Холост цвета показаны в белом (С) Скриншот из 7 цвета спектральной библиотеке, созданной для анализа яичников срезах опухоли (D) Мультиспектральный изображение мышиным яичников разделе опухоли показывая флюоресцентно меченых клеток; ядерное топливо:.. DAPI (ex350/em470 нм ); AF488 (экс 495/em 519 нм); AF514 (ex518/em540 нм); AF568 (экс 578/em 603 нм); AF594 (экс 590/em 617 нм); AF633 (экс 632/em 647 нм); AF660 (экс 663/em 690 нм) и. Холост цвета показаны в белом, а также соответствующие композитного цвета. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Рисунок 3. Анализ MIMicc изображение количественных информ. () Первое изображение представляет собой классификацию участков ткани с последующим (Б) сегментации элементов на основе ядерного окрашенных DAPI. (C) Количественный анализ флуоресцентной меткой может быть измерена в ядре и цитоплазме и экспортируются в (D) Excel для дальнейшего анализа. (E) ткань алгоритм сегментации способен дальнейшей идентификации тканей подтипы на основе архитектуры ткани, а не только на флуорохромом идентификации, обеспечивающей более надежный аналитический инструмент для классификации окрашивание в различных регионах ткани. На этом изображении, компьютер был обучен для выявления 5 субрегионов на основе Architecturaл узоры внутри ткани: фон определяется пустое пространство, гемолитическая опухоли определяется обилием красных кровяных клеток в ткани, опухоль определяется густонаселенных клеток, жир определяется большими, симметричных, пустых сотовых отсеков, и мышца определяется поперечно-полосатой картины. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Рисунок 4. Земельный отдельных клеток из 20 приобретенных изображения показывают двойные положительные элементы на основе флуоресцентных интенсивностей GFP меченных AF488 а αSMA меченных AF647.
Дополнительный документов. Советы и рекомендации для мультиплексирования 5 или более зондов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы опишем применение мультиспектральных изображений мы описываем как MIMicc-многоспектрального допроса мултиплексу сотовых композиций, проанализировать костного мозга стромальных компонентов микросреды опухоли, однако эта методология и концепция может быть применена к расшифровке другие клеточные элементы, которые составляют комплекс тканей, таких как замеченные в течение заживления ран реакций или во время рекуперативного ткани. В этих экспериментах мы используем трансгенных мышей, чтобы отличить флуоресцентно костного мозга, полученные клетки от клеток, полученных из хост внутри привиты микроокружения опухоли, однако этот метод пригоден для использования в любой ген репортер меченых клеток, и особенно исправимый в клетках, экспрессирующих ген метки, которые легко различимы с помощью иммуногистохимии, таких как LacZ, глюкуронидазой Его (6x) -, HA, ФЛАГ-тегов меченых клеток и т.д. 11.
В нашей модели, следуяжертва трансплантированных мышей, секции опухоли были обработаны и окрашивали антителами для определения происхождение клетки; RFP + кости донорский костный мозг получены или GFP + тканей хозяина происходит. На рисунке 2 мы показываем два маркера коэкспрессирующей с принимающими получены GFP + клеток в опухоли микроокружения. Тем не менее, мы покажем потенциал для семи цвета окрашивания с использованием той же системы на рисунке 2D.
Эти данные являются представлением что способен, используя нашу пересадку и мультиспектральных модель изображения. Эта система является очень гибким и может вместить дополнительные параметры, включая: 1-измененных населения BMT / трансгенных мышиных моделях; моделей 2-альтернативных опухоль / болезни, или 3-альтернативных маркеров (например, поверхности, внутриклеточного, фосфо-белков). Как правило, с увеличением числа иммуногистохимических пятен на тот же слайд, анализ данных становится трудным, однако с помощью мультиспектральных платформы визуализации и Associated программное обеспечение несмешивание позволяет эффективных, надежных и воспроизводимых результатов. Мы предоставляем потенциальных видов антител и комбинации флуоресцентной метки в таблице 1. Кроме того, этот метод позволяет универсальность в выборе зонд / антител из-за возможности использовать оба замороженных и залитые парафином тканевые срезы делает эту технику применим к образцам клинических тканей в дополнение к основным научно-исследовательских моделей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ТСМ, CMB, и ELS нет конфликтов и ничего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарны обсуждений руководством и при поддержке доктора. Майкл Andreeff MD, PhD., И Джаред Беркс кандидат. от MD Anderson проточной цитометрии и визуализации клетки основной комплекс. Эта работа была частично поддержана грантами от Национального института рака (RC1-CA146381, CA-083639, R01NS06994, CA116199 и CA109451 для ТСМ. ELS также поддерживается армии Министерства обороны (BC083397).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||||||||||||||||
| .2 μm filter | Fisher | 09-740-35A | |||||||||||||||||||||||||||||
| 10 ml lure lock | BD | 309604 | |||||||||||||||||||||||||||||
| 25 G needle | Cardinal | BF305122 | |||||||||||||||||||||||||||||
| 40nm filter | BD | 352340 | |||||||||||||||||||||||||||||
| 50 ml conical tube | Fisher | 1495949A | |||||||||||||||||||||||||||||
| Alexafluor 488-ms1 | invitrogen | A21121 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Alexafluor 594-Rb | invitrogen | A21207 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Alexafluor 647-ch | Invitrogen | A21449 | |||||||||||||||||||||||||||||
| BSA | Sigma | A7906-500G | |||||||||||||||||||||||||||||
| Cover slips | Corning | 2940-243 | |||||||||||||||||||||||||||||
| CRI-Nuance | Caliper Life Sciences | ||||||||||||||||||||||||||||||
| Dapi | Invitrogen | D1306 | |||||||||||||||||||||||||||||
| DMEM | CellGro | 10-017-CV | |||||||||||||||||||||||||||||
| Ethanol | Dharmacon | 4004-DV | |||||||||||||||||||||||||||||
| FBS | invitrogen | 16000-044 | |||||||||||||||||||||||||||||
| GFP-ms1 | Abcam | ab38689 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Insulin needle | BD | 329424 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Maleic acid | Acros | 100-16-7 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Moisture chamber box | Evergreen | 240-9020-Z10 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Mounting media | dako | S3023 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Nail hardener | Sally Hansen | 2103 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Pap pen | Abcam | Ab2601 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Pen/Strep L Glut | invitrogen | 10378016 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Steril PBS | invitrogen | 14040-182 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Trypsin | invitrogen | 252000-56 | |||||||||||||||||||||||||||||
Blocking Buffer
Antigen retrieval buffers:
|
|||||||||||||||||||||||||||||||
References
- Kidd, S., et al. Origins of the tumor microenvironment: quantitative assessment of adipose-derived and bone marrow-derived stroma. PLoS ONE. 7, e30563 (2012).
- Quintavalla, J., et al. Fluorescently labeled mesenchymal stem cells (MSCs) maintain multilineage potential and can be detected following implantation into articular cartilage defects. Biomaterials. 23, 109-119 (2002).
- Sasaki, M. Mesenchymal stem cells are recruited into wounded skin and contribute to wound repair by transdifferentiation into multiple skin cell type. Journal of immunology. 180, 2581-2587 (2008).
- Spaeth, E. L. Mesenchymal stem cell transition to tumor-associated fibroblasts contributes to fibrovascular network expansion and tumor progression. PLoS ONE. 4, e4992 (2009).
- Wels, J., Kaplan, R. N., Rafii, S., Lyden, D. Migratory neighbors and distant invaders: Tumor-associated niche cells. Genes and Development. 22, 559-574 (2008).
- Weis, S. M., Cheresh, D. A. Tumor angiogenesis: molecular pathways and therapeutic targets. Nat. Med. 17, 1359-1370 (2011).
- Bataille, F. Multiparameter immunofluorescence on paraffin-embedded tissue sections. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 14, 225-228 (1097).
- van Vlierberghe, R. L., et al. Four-color staining combining fluorescence and brightfield microscopy for simultaneous immune cell phenotyping and localization in tumor tissue sections. Microscopy research and technique. 67, 15-21 (2005).
- Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue. BMC cell biology. 9, 13 (2008).
- Qiu, P., et al. Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE. Nat Biotechnol. 29, 886-891 (2011).
- Belizario, J. E., Akamini, P., Wolf, P., Strauss, B., Xavier-Neto, J. New routes for transgenesis of the mouse. Journal of applied. 53, 295-315 (2012).
