Kwantitatieve Multispectral Analyse Na Fluorescent Tissue Transplantatie voor Visualisatie van de Cel Origins, types en interacties

Summary

Complex weefsel massa, van organen tumoren, zijn samengesteld uit verschillende cellulaire elementen. We opgehelderd de bijdrage van cellulaire fenotypes binnen een weefsel met behulp van multi-gelabelde fluorescerende transgene muizen in combinatie met multiparameter immunofluorescentiekleuring gevolgd door spectrale unmixing naar cel oorsprong evenals karakteristieken van de cel op basis van eiwit expressie ontcijferen.

Abstract

Met de wens om de bijdragen van verschillende cellulaire elementen voor de ontwikkeling van een complex weefsel begrijpen, zoals de vele celtypen die aan regenererend weefsel, tumorvorming of vasculogenese, ontwierpen we een veelkleurig cellulaire transplantatie model van tumorontwikkeling in die celpopulaties afkomstig uit verschillende fluorescentie gekleurde rapporteergen muizen worden getransplanteerd, geënt of geïnjecteerd in en rond een ontwikkelende tumor. De gekleurde cellen worden vervolgens gerekruteerd en opgenomen in de tumor stroma. Om beenmerg afgeleide tumor stromale cellen kwantitatief te beoordelen, we getransplanteerde GFP tot expressie transgene hele beenmerg in dodelijk bestraalde RFP uiten muizen zoals goedgekeurd door IACUC. 0ovarian tumoren die orthotopically werden geïnjecteerd in de getransplanteerde muizen uitgesneden 6-8 weken na implantatie en beenmerg marker vertrek (GFP) alsook antilichaam markers tumor geassocieerde detecteren geanalyseerdstroma behulp van multispectrale beeldvormende technieken. Vervolgens hebben we aangepast een methodiek we MIMicc-Multispectral Ondervraging van Multiplexed cellulaire composities noemen, met behulp van multispectrale unmixing van fluoroprobes kwantitatief beoordelen welke gelabelde cel kwam waaruit beginnen populaties (gebaseerd op originele reporter gen labels), en ons vermogen om te scheiden, 4, 5 , 6 of meer spectra per dia toeneemt, hebben we extra immunohistochemie verband met cellijnen of differentiatie om de precisie te verhogen toegevoegd. Gebruik te maken van software om co-gelokaliseerde multiplex-fluorescerende signalen, tumor stromale populaties kunnen worden getraceerd, geïnventariseerd en gekarakteriseerd op basis van marker vlekken op te sporen. ¹

Introduction

Inzicht in de ontwikkeling en reparatie weefsel is belangrijk om het ophelderen van de deelnemende cellulaire componenten bij wondgenezing, ^2,3 regeneratieve geneeskunde, ontwikkelingsbiologie en de tumor biologie. Onder omstandigheden van de reparatie, talrijke celtypen infiltreren de omringende micro-omgeving om te helpen bij vascularisatie, ECM afzetting, proliferatie en herstructurering weefsel. Cellulaire factoren en fenotypes worden geïdentificeerd op basis van multiparameter, multiplex markers die de lokalisatie kan identificeren, differentiatie status en interactie cellulaire componenten binnen de onderzochte micro. Hierin beschrijven we de ontwikkeling van tumoren als een prototypisch voorbeeld van deze multicolor-meercellige transplantatie model gevolgd door multispectrale beeldvorming en spectrale ontmenging methodologie.

Tumorprogressie is een proces van meerdere stappen dat wordt gekenmerkt door een aantal verworven mogelijkheden die verbeterde proliferatie, een onderntiapoptotic, invasieve en angiogene eigenschappen. ⁴ Tumor ontwikkeling wordt vergemakkelijkt door niet-neoplastische cellen die worden gerekruteerd in de omgeving groeifactoren, structurele matrices, vasculaire netwerken en immuunmodulatie bieden. ^1,5,6 Dit microhabitat bestaat uit cellen afkomstig van lokaal, naburige weefsels zoals vet en bloedvaten en verre bronnen zoals beenmerg afgeleide cellen ^1. De mate van niet-neoplastische cel opname hangt af van de vraag van de tumor, die vaak overeenkomt met de fase / graad van de tumor. De rol van het tumor ondersteunende micro begrijpen, moet men de oorsprong en de differentiatie potentieel van de niet-neoplastische cel populaties begrijpen.

Dit protocol is ontworpen om te helpen bij de interpretatie van tumorprogressie door visualisatie van zowel het beenmerg afgeleide cellulaire componenten en de lokale weefsel derived cellen. Gebruik te maken van fluorescerende reporter-gen uitdrukken transgene muizen, we getransplanteerd GFP (groen-fluorescerend eiwit) beenmerg in een dodelijk bestraald RFP (rood-fluorescerend eiwit) muis. Na succesvolle beenmerg aanslaan, is een syngene tumorcellijn orthotopically geïnjecteerd en mogen inenten voor 4-8 weken. De resulterende tumor wordt uitgesneden uit de muis en verwerkt voor immunofluorescentie (IF) kleuring om de stromale componenten te visualiseren. Multiplexing IF markers is een veelgebruikte techniek die aanzienlijke optimalisatie ^7-9 omvat, maar met een multispectrale / unmixing platform verbetert de mogelijkheid van fluorescente merker combinaties die spectrale overlap hebben. Hierin presenteren we een techniek die we noemen MIMicc-multispectrale ondervraging gemultiplexte cellulaire samenstellingen om vlekken en analyseren maximaal acht merkers binnen een tumor gedeelte op een dia om de cellulaire oorsprong, celdifferentiatie st analyserenAtus en cel-cel interacties van onderdelen binnen de tumor micro-omgeving. Deze vereenvoudigde voorbeeld heeft het potentieel worden opgevoerd om vijf, zes of meer markeringen behulp antilichamen of intracellulair-promoter gedreven fluorescerende expressie. Tabel 1 geeft potentiële fluorescent antilichaam kleuring combinatie met geschikte soorten in aanmerking genomen te analyseren.

Protocol

Syngenetische Muriene beenmergtransplantatie (BMT), zoals goedgekeurd door institutionele IACUC protocollen (Opmerking: Het succes van dit protocol vereist het gebruik van een gelabeld celtype (s) als de doelstelling voor multispectrale analyse, en de downstream-analyse te vergemakkelijken, kan men elke genetische exploiteren of stabiele cellulaire kenmerken. Wij stellen een cel, weefsel of orgaan te worden kan worden toegepast op een proefdiermodel en dat de transplantatie kan zoveel unieke bestempeld populaties bevatten het onderzoek nodig acht. Bovendien meerdere gemerkte celsystemen , zoals in transgene muizen die multipele afstamming beperkte-fluorescent gelabelde-populaties kunnen worden ontworpen om transplantatie complicaties voor de studie van bepaalde pathologische toestanden te elimineren.

1. Dodelijk bestralen BMT ontvangende muizen met een enkele dosis van 9,5 Gy uur voor reconstitutie met donor beenmerg. (BMT GFP ontvangers moet 6-10 weken oud).
2. Bevochtig de muis pels met 70% ethanol voor het knippen en peeling het terug naar de achterste ledematen bloot met steriele chirurgische schaar. Verwijder de hele been inclusief het bekken bij het SI-gewricht. Gooi de voet door te snijden net boven de enkel en vervolgens grondig uit been verwijder alle spieren, ligamenten en overtollige weefsel. Flush merg uit het scheenbeen, fibia en bekkenkam met een 23 G naald met behulp van 2% steriele FBS in PBS (PBS-2). (BMT RFP donoren moeten worden opgeofferd volgens de institutionele normen.)
3. Plak en voorzichtig plet de resterende bot in fragmenten met een scalpel en pincet en plaats in 50 ml conische buis met 3 ug / ml collagenase I gedurende 1 uur bij 37 ° C bij 300 rpm.
4. Bovenkant van de buis met PBS-2 en het verzamelen van supernatans in een nieuwe buis en combineren met gespoelde cellen. Spin neer 250rpm gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
5. Resuspendeer cellen in PBS-2 en filtreer door 40 nm cel filter. Op dit punt kunnen de cellen voor fluorescen gelabeldt geactiveerde celsortering (FACS) wil men specifieke populaties van de BMT manipuleren.
6. Resuspendeer 2 x 10 ⁶ cellen per 100 ul PBS, per muis. Gebruik 29 G naald om systemisch te injecteren in bestraalde GFP ontvangende muizen door de staart of de retro-orbitale ader-schuine-side-up. Injecteer een muis met 100 ul PBS alleen als innesteling controle. Gebruik een warmtelamp aan schepen voor de injectie verwijden en gebruik een staartaderinjectie terughoudendheid bij injectie. Steriel gaas beschikbaar voor lichte druk op de staart na de injectie.
7. Drie weken na BMT, verzamel bloed retro-orbitaal en geanalyseerd door flow cytometrie voor de aanwezigheid van GFP circulerende cellen en de afwezigheid van RFP circulerende cellen bevestigen. De controle muis zal zijn gestorven op dit punt.

2. Tumor Engraftment Volgens Institutionele IACUC Guidelines

1. Kweek ID8 ovariale muizen tumorcellen in vitro voorafgaand aan in vivo injectie (1 x 10 ⁶ cellen per muis). Dag van de injectie, trypsinize cellen, wassen met PBS en resuspendeer in PBS bij 1 x 10 ⁶ cellen per 100 ul.
2. Injecteren tumorcellen in intaperitoneal holte van de muis, moet de naald schuine-side-up zijn. Steriliseren injectie zicht met 70% ethanol. Injecteren in de linker of rechter kwadrant van de buik (craniale en iets mediaal van de inferieure set van abdominale tepels van de vrouwelijke muis), vermijd het raken van de organen. Bedwingen muis door te grijpen door de nekvel en houdt de staart met de pink of ringvinger. Muizen worden verdoofd met isofluraan voor deze procedure.
3. Offer de muizen wanneer tekenen van tumor implantatie, zoals een licht opgeblazen gevoel, zijn duidelijk zichtbaar. Dit zal plaatsvinden gedurende 4-12 weken.
4. Accijnzen tumoren van IP holte. Tumoren in de holte zal zien als witte knobbeltjes op en rond het oppervlak van de organen. Met een scalpel, verwijder de tumoren en plaatsen in een buis / potje van 10% formaline gedurende 24 uur fixatie. Histologische preparatie kan worden uitbesteed aan pathologie / histologie kern als reagentia en materialen zijn niet direct beschikbaar voor inbedden in paraffine en voorbereiding glijbaan. Sectie weefsel in 5-8 micrometer plakjes op glasplaatjes voor volgende kleuringen.

3. Multi-parameter immunofluorescentiekleuring

1. Bereid Een kleur controleglaasjes voor elke fluorescente probe gebruikt in het experiment. In dit scenario worden vier kleuren gebruikt. Daarom vier dia's voor elke individuele kleur, maar ook een glijbaan voor achtergrondgeluid controle en tenslotte een glijbaan voor de volledige combinatie kleuring. (Totaal slides = 6) Alle objectglaasjes worden verwerkt naast elkaar op dezelfde wijze als experimentele variatie te minimaliseren.
2. Bak paraffine secties 56 ° C gedurende 1 uur.
3. Was de dia's 3x 10 min. in xyleen.
4. Wassen 2x 5 min. 100% ethanol.
5. Was 1x 3 min 95% ethanol
6. Was 1x 2 min90% ethanol.
7. Was 1x 2 min70% ethanol.
8. Tijdens de laatste wasbeurt serie, pre-kook natriumcitraatbuffer gedurende 2 minuten (magnetron op hoog). (Kan vervangen tris-EDTA buffer afhankelijk van de antilichamen gebruikte)
9. Kook de dia's voor 20 min in natriumcitraatbuffer (magnetron op 10% vermogen of in een snelkookpan). Als buffer kookt, zet magnetron en laat zitten.
10. Verwijderen warmtebron en laat de schuiven rusten 30 min in natriumcitraatbuffer afkoelen.
11. De glaasjes spoelen met water gedurende 5 minuten.
12. Mark rond tumorsecties met Pap Pen en zet 2% BSA / 1% FBS maleïnezuur blokkerende buffer gedurende 1 uur. De dia's te bereiden individueel om niet laten uitdrogen tijdens deze stap.
13. Bereid primaire antilichamen op optimale verdunning in het blokkeren van buffer. (Als de antilichamen gebruikte zijn verschillende soorten (of IgG-keten variant ex: IgG1 vs IgG2a van dezelfde soort) die kunnen worden gebruikt in combinatie bij alsIngle incubatietijd. Als antilichaamspecies overlappen, dan incubaties worden sequentieel uitgevoerd om antilichaam kruisreactie minimaliseren.)
14. Op dit punt, laat twee dia's met alleen het blokkeren van buffer. Deze twee dia's zullen dienen als ongekleurd controle en vlek controle nucleaire. De andere enkele kleur controles zullen worden geïncubeerd met individuele primaire antilichamen. Alleen de analyse dia zal een combinatie van primaire antilichamen hebben.
15. Incubeer dia's met primair antilichaam in een vocht kamerdoos op langzaam roterende schudder bij 4 ° gedurende de nacht (~ 16-20 uur) (Opmerking: bij het ​​werken met 4 fluoroforen, sequentiële kleuring of directe conjugatie kan nodig zijn om antilichamen kruisreactie minimaliseren . Onder deze omstandigheden 1,16-1,21 stappen herhalen tot alle antilichamen worden toegepast op de dia.)
16. Was de dia's voor 10 min in PBST (2x) voorzichtig op shaker
17. Terwijl wassen gaat, bereiden Alexafluor 488, 594 en 647 secundaire antilichamen voor een uiteindelijke verdunningvan 1:1000 in het blokkeren van buffer. (Zorg ervoor dat deze antilichamen en verdunningen bewaard bij 4 ° C en in het donker te allen tijde fluorescentie in batches en tijd behouden.)
18. Op de enkele kleur controleglaasjes, plaatst enkele Alexafluor verdunningen die overeenkomen met de soort van het primaire antilichaam gebruikt. Alle secundaire antilichamen zullen op de analyse dia worden geplaatst. De ongekleurde en de nucleaire gekleurd controleglaasjes zal met blokkerende buffer gedurende deze stap blijven.
19. Incubeer in een vocht kamerdoos (afgedekt met aluminiumfolie om blootstelling aan licht te voorkomen) op langzame roterende schudder bij kamertemperatuur gedurende 2 uur.
20. Was de dia's voor 5 min in PBST (2x) voorzichtig op shaker. Dek af met aluminiumfolie om te beschermen tegen licht.
21. Voeg DAPI (1:10.000) gedurende 1 min om de zuivere DAPI glijbaan en de analyse schuif. Dek af met aluminiumfolie om te beschermen tegen licht. De andere dia's kunnen achterblijven die in de was containers.
22. Was de twee DAPI geïncubeerddia's in een aparte container voor de eerste 5 min wassen als de andere dia's niet verontreinigen met DAPI vlek. Voor de tweede 5 min wassen, kan de dia's worden gecombineerd in PBST (alle wasbeurten moeten worden uitgevoerd op een shaker). Dek af met aluminiumfolie om te beschermen tegen licht.
23. Kort dipslides in water voordat kap-slippen (1,5 dikte met waterige montage media om fluorescentie te behouden)
24. Laten drogen 3 uur in het donker bij kamertemperatuur.
25. Dicht de randen van het dekglas met nagelverharder. (Geen nagellak niet als de aceton het fluorescente signaal kan blussen).
26. Analyseer objectglaasjes onmiddellijk of bewaar bij 4 ° C voor toekomstige analyse.

4. Multispectrale

1. Verzamel multispectrale beelden met behulp van een Nuance EX camera (met daarin een vloeibare kristallen afstembare filter) op een Olympus X-63 rechtopstaande microscoop met Nuance-software voor het verzamelen van gegevens.
2. Verzamel beelden met behulp van een olie-doelstelling om de resolutie te verhogen.
3. Initial set-up bestaat uit het instellen van de spectrale bereik voor elk fluorofoor in gebruik.
   1. Voor 4 kleuren:
      1. DAPI: 420-480nm
      2. AF488: 490-580nm
      3. AF594: 590-640nm
      4. AF647: 650-720nm
4. Neem een ​​eerste beeld van de analyse dia de juiste belichtingstijden verkrijgen voor elk van de spectrale bereiken.
5. Code "spectrale library" die de software gebruikt om de signaal-ruisverhouding van de fluoroforen van elkaar en achtergrondsignaal identificeren en te scheiden. (Opmerking: Elke fluorchroom moet zijn eigen enkele kleur controle dia hebben om een spectrale bibliotheek met de juiste golflengte bochten monteren om een goede analyse van de dataset Voorbeeld zorgen: 3 fluorophores = 4 controleglaasjes; 5 fluorophores = 6 controleglaasjes.).
   1. Afbeelding eerst de ongekleurde dia. Deze slide zal binnen de spectrale librar worden aangewezeny als achtergrond.>
   2. Afbeelding de DAPI-only schuiven tweede. Deze schuif wordt gebruikt om de DAPI gekleurde kernen met "draw" tool duiden en wordt opgeslagen binnen de spectrale bibliotheek en DAPI.>
   3. Afbeelding de enige AF488-schuiven derde. Deze schuif wordt gebruikt om de AF488-gekleurde gebieden duiden met "draw" gereedschap en wordt opgeslagen binnen de spectrale bibliotheek en AF488.>
   4. Afbeelding de enige AF594-vierde schuiven. Deze schuif wordt gebruikt om de AF594-gekleurde gebieden duiden met "draw" gereedschap en wordt opgeslagen binnen de spectrale bibliotheek en AF594.>
   5. Afbeelding de enige AF647 vijfde schuiven. Deze schuif wordt gebruikt om de AF647-gekleurde gebieden duiden met "draw" gereedschap en wordt opgeslagen binnen de spectrale bibliotheek en AF647.>
   6. Na het verzamelen van elke individuele spectrale component,sla de spectrale bibliotheek en het protocol.>
6. Zodra de spectrale bibliotheek is voltooid, vinden gebieden van belang op de analyse dia op de microscoop en verzamel / afbeeldingen opslaan.>

5. Kwantitatieve analyse van multispectrale beelden

1. Importeer een representatief assortiment van verworven Nuance beelden met behulp InForm Software.
2. Open het opgeslagen spectrale bibliotheek zoals aangegeven door het programma
3. Identificeer weefselgebieden plaats te analyseren. (Bijv. Tumorweefsel versus vetweefsel).
4. Identificeer individuele cellen op basis DAPI-kleuring. Cytoplasma automatisch bepaald gebaseerd op de vorm van de kern.
5. Kies de fluorescentie-intensiteit uitlezing van de keuze voor elke fluorescerende parameter (bv. gemiddelde, standaarddeviatie)
6. Batch de verkregen beelden en laat de software proces met behulp van de voorgestelde algoritme.
7. Wanneer de beeldverwerking is voltooid, samenvoegende resultaatbestanden.
8. Open de resultaten in Excel (of andere analytische softwarepakket) en teken twee fluorescente intensiteiten tegen elkaar XY-as. Elke fluorescentie-intensiteit wordt gegeven per cel. De dubbele positieve cellen zal verschijnen in het kwadrant rechtsboven. De gebruiker moet de basislijn fluorescerende intensiteiten definiëren.

Representative Results

Met behulp van een multispectrale beeldvormende techniek om tumoren geënt in onze transgene BMT muismodel analyseren, kunnen we stromale tumor componenten die van beenmerg herkomst te onderscheiden. De aanvankelijke BMT werd drie weken na transplantatie door flowcytometrie (figuur 1) bevestigd. Orthotopically ingespoten ongelabelde ovariële tumoren na BMT innesteling bevestigingen werden uitgesneden en formaline gefixeerde 6 weken na de eerste tumor injectie. Paraffine ingebedde tumor secties werden coupes in <8 urn plakjes en gekleurd. Passende enkele kleur controleglaasjes zijn voor elkaar gemaakt fluorofoor waaronder een voor achtergrond autofluorescentie. Tabel 1 bevat potentieel specie en fluorochroom combinaties voor 2-7 parameters. Na de kleuring procedure, werden beelden verkregen met behulp van een door Nuance camera gehechtheid en Nuance Software. Na het aanmaken van een spectrale bibliotheek met enkele kleur controleglaasjes (Figuur 2A), we were kunnen "scheiden," beelden van multi-gemerkte ovariale tumor secties werden genomen die de expressie van GFP (Antilichaam # 1) samen met nucleaire DAPI en twee markers (antistoffen # 2 en # 3). (Figuur 2B) toevoeging van meer markers mogelijk en Figuren 2C-D toont het beeld van een tumor gedeelte met zes markers en een nucleaire kleuring. Tot slot werden alle verkregen beelden in kennis stellen (CaliperLS, Hopkinton, MA) software voor analyse geïmporteerd. Nuance (CaliperLS, Hopkinton, MA) software is compatibel met andere pakketten zoals MetaMorph (Molecular Devices) of IPlab (Scanalytics, BD Biosciences). Verder kunnen foto's en spectrale datasets ook worden opgeslagen als TIFF-bestanden en bekeken worden in elk programma dat dit bestandsformaat leest. De Inform Software, konden we de weefselgebieden van belang in de tumorsecties (Figuren 3A en E) classificeren en stel algoritmes voor fluorescentie intensiteiten van elk fluorochroom per cel based op DAPI nucleaire vlek (figuren 3B-C). Tenslotte konden we elke individuele cel gebaseerd op de fluorescentie-intensiteiten van twee markers, AF488 en AF647 (figuur 3D) plot. We hebben een dubbele positieve celpopulatie op basis van een bepaalde fluorescentie-intensiteit drempel (Figuur 4). Als de dataset ingewikkelder met meerdere parameters, de mogelijkheid van de gegevens worden geanalyseerd met software SPADE ¹⁰ (spanning-tree progressie analyse dichtheid genormaliseerd gebeurtenissen), maar dit is nog niet uitgevoerd. Met deze software kan de visualisatie van co-expressie trends over grote datasets en kunnen associatie / relaties tussen clusters van co-expressie markers binnen geanalyseerd coupes impliceren.

Tabel 1. Immunofluorescentiekleuring control voorbereiding 2-7 kleur multiplex kleuring. (A) Inclusief tot vier kleuren optie. (B) (C) bestaat uit een zeven kleuren optie binnen het zichtbare lichtspectrum.

Figuur 1. Beenmerg bevestiging transplantatie door flowcytometrie. (A) puntdiagram van de circulerende hematopoietische populatie cellen in de GFP transgene ontvangende muizen die positief (B) voor RFP + hematopoietische cellen vergeleken RFP + controle en controle GFP + muizen en negatieve (C) voor GFP + cellen.

Figuur 2. Spectraal ongemengde afbeelding proces. (A) (B) Multispectral afbeelding een muizen-ovariële tumorsectie tonen fluorescent gelabelde cellen; # 1: AF488 (ex 495 nm / em 510 nm); # 2 : AF594 (ex590/em617 nm); # 3: AF647 (ex 650/em 668 nm) en nucleaire: DAPI (ex 350/em 470 nm). Enkele kleuren worden getoond in het wit (C) Screenshot van de 7 kleuren spectrale bibliotheek gemaakt voor de analyse van de ovariële tumor secties (D) Multispectral afbeelding een muizen-ovariële tumorsectie tonen fluorescent gelabelde cellen; nucleaire:.. DAPI (ex350/em470 nm ); AF488 (ex 495/em 519 nm); AF514 (ex518/em540 nm); AF568 (ex 578/em 603 nm); AF594 (ex 590/em 617 nm); AF633 (ex 632/em 647 nm); AF660 (ex 663/em 690 nm) en. Enkele kleuren worden getoond in het wit, evenals de bijpassende composiet kleur. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 3. MIMicc Afbeelding van kwantitatieve Inform analyse. (A) Eerste beeld vertegenwoordigt de indeling van weefselsegmenten gevolgd door (B) de segmentatie van de cellen op basis van nucleaire DAPI gekleurd. (C) De kwantificering van fluorescentie merkteken kan worden gemeten in de kern en het cytoplasma en geëxporteerd in (D) Excel voor verdere analyse. (E) Het weefsel segmentatie algoritme kan verder identificeren weefsel subtypes gebaseerd op weefselarchitectuur en niet alleen op fluorochroom identificatie een meer robuust analytisch instrument om vlekken te delen in verschillende weefselgebieden. In deze afbeelding is de computer getraind om 5 subregio's op basis van architectural patronen in het weefsel: achtergrond wordt gedefinieerd door lege ruimte wordt hemolytische tumor gedefinieerd overvloed van rode bloedcellen in het weefsel, tumor wordt gedefinieerd door dichtbevolkte cellen, vet wordt gedefinieerd door grote, symmetrisch, lege cellulaire compartimenten en spieren gedefinieerd door een gestreept patroon. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 4. Perceel van individuele cellen van 20 verworven beelden tonen de dubbele positieve cellen op basis van fluorescerende intensiteiten van GFP gelabeld met AF488 en αSMA gelabeld met AF647.

Aanvullend Document. Tips en trucs voor Multiplexing 5 of meer sondes.

Discussion

Hierin beschrijven we de toepassing van multispectrale we beschrijven als MIMicc-multispectrale ondervraging gemultiplexte cellulaire samenstellingen, het beenmerg afgeleide stromale bestanddelen van de tumor micro-analyse, maar deze methode en concept kan worden toegepast op het ontcijferen andere cellulaire elementen die een complexe samenstellen weefsels zoals waargenomen tijdens wondgenezing reacties of tijdens een regeneratief weefsel. In deze experimenten gebruiken we transgene muizen fluorescent onderscheiden beenmerg afgeleide cellen van de gastheer afgeleide cellen in een tumor micro geënt, maar deze techniek leent zich voor gebruik van een reportergen gemerkte cellen en is bijzonder amendeerbaar voor cellen die dat gen labels zijn gemakkelijk te onderscheiden door immunohistochemie, zoals LacZ, glucuronidase, Zijn (6X) -, HA, FLAG-tag gelabelde cellen, enz. ^11.

In ons model na deopoffering van getransplanteerde muizen, werden de tumorsecties verwerkt en gekleurd met antilichamen tegen de oorsprong van de cel bepalen; RFP + beenmerg donor afgeleide of GFP + gastheerweefsel afgeleid. In fig. 2 tonen we twee markers die co-expressie met gastheer afgeleide GFP + cellen in de tumor micro-omgeving. Echter, tonen we de mogelijkheid van zeven kleuren kleuring met hetzelfde systeem in figuur 2D.

Deze gegevens zijn een weergave van wat in staat is gebruik te maken van onze transplantatie en multispectrale model. Dit systeem is uiterst flexibel en kan een extra parameters, waaronder: 1-altered BMT populatie / transgene muismodellen, 2-plaatsvervanger tumor / ziekte modellen, of 3-alternatieve markers (bijv. oppervlakte, intracellulaire, fosfo-eiwitten). Meestal met toenemende aantallen immunohistochemische vlekken op dezelfde dia, gegevensanalyse wordt lastig, maar met een multispectrale platforms en associatieciated unmixing software maakt een efficiënte, betrouwbare en reproduceerbare resultaten. Wij bieden potentiële soorten antilichaam en fluorescent label combinaties in Tabel 1. Bovendien, deze techniek zorgt voor veelzijdigheid in probe / antilichaam selectie vanwege de mogelijkheid om zowel diepvries-en paraffine-ingebed weefsel secties gebruik maken van deze techniek van toepassing op klinische weefselmonsters naast fundamenteel onderzoek modellen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
.2 μm filter	Fisher	09-740-35A
10 ml lure lock	BD	309604
25 G needle	Cardinal	BF305122
40nm filter	BD	352340
50 ml conical tube	Fisher	1495949A
Alexafluor 488-ms1	invitrogen	A21121
Alexafluor 594-Rb	invitrogen	A21207
Alexafluor 647-ch	Invitrogen	A21449
BSA	Sigma	A7906-500G
Cover slips	Corning	2940-243
CRI-Nuance	Caliper Life Sciences
Dapi	Invitrogen	D1306
DMEM	CellGro	10-017-CV
Ethanol	Dharmacon	4004-DV
FBS	invitrogen	16000-044
GFP-ms1	Abcam	ab38689
Insulin needle	BD	329424
Maleic acid	Acros	100-16-7
Moisture chamber box	Evergreen	240-9020-Z10
Mounting media	dako	S3023
Nail hardener	Sally Hansen	2103
Pap pen	Abcam	Ab2601
Pen/Strep L Glut	invitrogen	10378016
Steril PBS	invitrogen	14040-182
Trypsin	invitrogen	252000-56
Blocking Buffer maleic acid 14.51 g NaCl 10.95 g NaOH pellets (to 7.5pH) 9+g Distilled water 250 ml *add 0.2% Tween-20 to 1x solution for blocking buffer with 2%BSA/2%FBS. Stir and filter. Antigen retrieval buffers: Tris-EDTA Buffer (10 mM Tris Base, 1 mM EDTA Solution, 0.05% Tween 20, pH 9.0) Tris Base 1.21 g EDTA 0.37 g Distilled water 1000 ml (100 ml to make 10x, 50 ml to make 20x) Tween 20 0.5 ml *Store at RT for 3 months or at 4 ° C for longer Sodium Citrate Buffer (10 mM Sodium Citrate, 0.05% Tween 20, pH 6.0) Tri-sodium citrate (dihydrate) 2.94 g Distilled water 1000 ml HCl (adjust pH to 6.0) 1N Tween 20 0.5 ml