Summary
Komplekse vev massene, av organer til tumorer, er sammensatt av forskjellige cellulære elementer. Vi belyst bidrag av cellulære fenotyper i en vev utnytte multi-merket fluorescerende transgene mus i kombinasjon med multiparameter immunofluorescent flekker etterfulgt av spektral unmixing å dechiffrere celle opprinnelse samt celleegenskaper basert på protein uttrykk.
Abstract
Med ønske om å forstå bidragene fra flere cellulære elementer til å utvikle et sammensatt vev, slik som de tallrike celletyper som deltar i regenererende vev, tumordannelse, eller vaskulogenese, har vi utviklet en flerfarget celletransplantasjonsmodell for tumorutvikling som cellepopulasjoner stammer fra forskjellige fluorescently fargede reporter gen mus og er transplantert, innpodet eller injiseres i og rundt et utviklings svulst. Disse fargede cellene blir deretter rekruttert og inkorporert inn i svulsten stroma. For å kvantitativt vurdere benmarg avledet stromale tumorceller, transplantert vi GFP uttrykker transgene hele benmarg inn lethally bestrålt RFP uttrykke mus som er godkjent av IACUC. 0ovarian svulster som ble orthotopically injisert i de transplanterte musene ble skåret i 6-8 uker etter engraftment og analysert for benmargs markør utstedt (GFP), så vel som antistoff-markører for å påvise tumor assosiertstroma bruker multispektrale bildeteknikker. Vi deretter tilpasset en metode vi kaller MIMicc-Multispectral Avhør av multiplekskanaler cellulære komposisjoner, ved hjelp av multispektrale unmixing av fluoroprobes til kvantitativt vurdere hvilke merket celle kom fra hvilke start populasjoner (basert på originale reporter gen etiketter), og som vår evne til å unmix 4, 5 , 6 eller flere spektra per lysbilde øker, har vi lagt ekstra immunhistokjemi forbundet med celle linjene eller differensiering for å øke presisjonen. Utnytte programvare for å oppdage samlokalisert multipleksede-fluorescerende signaler, svulst stromal populasjoner kan spores, oppregnet og preget basert på markør farging. 1
Introduction
Forstå vev utvikling og reparasjon er viktig å belyse deltar cellulære komponenter i sårheling, 2,3 regenerativ medisin, utviklingsbiologi og tumorbiologi. Under omstendighetene reparasjon, mange celletyper infiltrere omkringliggende mikromiljøet til hjelp i vascularization, ECM deponering, spredning og vev restrukturering. Cellulære faktorer og fenotyper kan identifiseres basert på multiparameter, multipleksede markører som kan identifisere lokalisering, differensiering status og samhandling mellom cellulære komponenter innenfor undersøkt mikromiljøet. Heri beskriver vi tumor utvikling som en prototypisk eksempel på dette flerfarget-flercellet transplantasjon modellen etterfulgt av multispektrale bildebehandling og spektral unmixing metodikk.
Tumorprogresjon er en flertrinns prosess som er preget av flere oppkjøpte funksjoner som omfatter økt spredning, enntiapoptotic, invasive og angiogenetiske egenskaper. 4 Tumor utvikling er tilrettelagt av ikke-neoplastiske celler som er rekruttert inn i det omkringliggende miljø for å gi vekstfaktorer, strukturelle matriser, vaskulære nettverk og immunmodulering. 1,5,6 Denne mikrohabitat består av celler som stammer fra lokale, nabo vev som adipose, og blodårer og fjerne kilder som for eksempel benmarg avledet celler en. Graden av ikke-neoplastisk celle inkorporering avhenger av etterspørselen fra tumoren, noe som ofte er den samme som fasen / karakteren av svulsten. For å forstå rollen av svulsten støttende mikromiljøet, må man forstå opprinnelsen og differensiering potensial av de ikke-neoplastiske cellepopulasjoner.
Denne protokoll er blitt utviklet for å hjelpe til med forståelsen av tumor progresjon gjennom visualisering av både benmarg avledet cellulære komponenter, og det lokale vevet derived celler. Utnytte fluorescerende reporter gen-uttrykke transgene mus, transplantert vi GFP (green-fluorescerende protein) benmarg til en lethally bestrålt RFP (red-fluorescerende protein) mus. Etter vellykket benmarg engraftment, er en syngene tumor cellelinje injisert orthotopically og lov til å innpode i 4-8 uker. Den resulterende tumor er fjernet fra musen og behandlet for immunofluorescent (IF) farging for å visualisere de stromale komponenter. Multipleksing IF markører er en vanlig brukt teknikk som innebærer betydelig optimalisering 7-9, men ved hjelp av en multispektrale avbildning / unmixing plattformen øker potensialet for fluoriserende fargestoff kombinasjoner som besitter spektral overlapping. Heri vi presentere en teknikk vi kaller MIMicc-multispektrale avhør av multiplekskanaler cellulære komposisjoner å farge og analysere opptil åtte markører innenfor en svulst seksjon på et enkelt lysbilde for å analysere de cellulære opprinnelse, cellulær differensiering stAtus og celle-celle interaksjoner av komponenter innenfor tumormikromiljøet. Dette forenklet eksempel har potensial til å bli utvidet på for å analysere fem, seks eller flere markører utnytte antistoffer eller intracellulær promoter-drevet fluorescerende uttrykk. Tabell 1 lister potensielle fluorescerende antistoffarging kombinert med egnede arter tatt i betraktning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Syngene Murine benmargstransplantasjon (BMT) som er godkjent av institusjonelle IACUC protokoller (Merk: Suksess for denne protokollen krever utnyttelse av eventuelle merket celletype (r) som mål for multispektrale analyse, og å legge til rette for nedstrøms analyse, kan man utnytte noen genetiske eller stabil cellemerking. Vi foreslår at en hvilken som helst celle, vev eller organ-å-være kan påføres på et transplantat modell og at transplantatet kan inneholde så mange unike merkede populasjoner som forskningen anser å være nyttig. Andre flermerkede cellulære systemer , slik som de som finnes i transgene mus som inneholder flere avstamning med begrenset fluorescensmerkede populasjoner-kan være utformet for å eliminere transplantasjons komplikasjoner for studiet av visse patologiske tilstander.
- Lethally irradiate BMT mottaker mus med en enkelt dose på 9,5 Gy fire timer før tilberedning med donor benmarg. (BMT GFP mottakere bør være 6-10 ukers alder).
- Fukt mus pelsen med 70% etanol før klipping og peeling den tilbake for å avsløre de baklemmene med sterile kirurgiske saks. Fjern hele beinet inkludert hoftekam på sacroiliac felles. Kast foten ved å kutte like over ankelen, og fjern deretter grundig alle muskler, leddbånd og overflødig vev fra benet. Flush marg fra tibia, fibia og hoftekam med en 23 G nål ved anvendelse av 2% steril FBS i PBS (PBS-2). (BMT RFP givere bør bli ofret i henhold til institusjonelle standarder.)
- Skive og forsiktig knuse den gjenværende ben i fragmenter ved hjelp av en skalpell og pinsetter, og deretter plassere i 50 ml konisk rør med 3 ug / ml kollagenase I i 1 time ved 37 ° C ved 300 rpm.
- Toppen av røret med PBS-2 og samle supernatanten til et nytt rør og kombinere med bluss celler. Spinn ned på 250rpm for 5 min ved 4 ° C.
- Suspender cellene i PBS-2 og filtrere gjennom 40 nm celle filter. På dette punktet, kan cellene bli merket for fluorescent aktivert celle sortering (FACS) hvis man ønsker å manipulere spesifikke populasjoner for BMT.
- Susp 2 x 10 6 celler per 100 mL PBS, per mus. Bruk 29 G nål til systemisk injisere i bestrålt GFP mottaker mus etter halen eller retro-orbital vene-fas-side-up. Sprøyt en mus med 100 mL PBS bare som engraftment kontroll. Bruk en varmelampe for å strekke fartøy før injeksjon og bruke en hale vene injeksjon holdenhet ved injeksjon. Har steril kompress tilgjengelig for å bruke et lett trykk til halen etter injeksjonen.
- Tre uker etter BMT, samle blod retro-transorbitalt og analysere ved flowcytometri for å bekrefte tilstedeværelse av GFP sirkulerende celler og fravær av RFP sirkulerende celler. Kontrollen mus vil ha dødd på dette punktet.
2. Tumor engraftment Ifølge Institusjonelle IACUC Retningslinjer
- Dyrk ID8 ovarian murine tumorceller in vitro forut for in vivo injeksjon (1 x 10 6 calen pr mus). Dag for injeksjon, trypsinize cellene, vaskes med PBS og resuspender i PBS ved 1 x 10 6 celler pr 100 ul.
- Sprøyt kreftceller inn intaperitoneal hulrom av musen, bør nålen være skrå-side-up. Steril injeksjon synet med 70% etanol. Injisere i nedre venstre eller nedre høyre kvadrant av abdomen (kranie og litt medial til dårligere sett med mage brystvorter av hunnmus), unngå å treffe de organer. Beherske musen ved å gripe etter Scruff og holde halen med pinky eller ringfingeren. Mus kan bli bedøvet med isofluran for denne prosedyren.
- Ofre mus når tegn til svulst engraftment, som svært små abdominal oppblåsthet, er åpenbar. Dette vil skje over 4-12 uker.
- Avgifter svulster fra IP hulen. Tumorer innenfor hulrommet vil se ut som hvite knuter på og rundt overflaten av organene. Med en skalpell, fjerne svulster og plassere i en tube / krukke med 10% formalin for 24 timers fiksering. Histologisk poppreisning kan bli satt ut til patologi / histologi kjerne hvis reagenser og materialer er ikke lett tilgjengelig for parafin innebygging og lysbilde forberedelse. Seksjon vevet inn 5-8 mikrometer skiver på glassplater for etterfølgende farvningsprosedyrer.
Tre. Multi-parameter Immunofluorescent Farging
- Forbered Enkle fargekontroll lysbilder for hver fluorescerende probe benyttes i forsøket. I dette scenariet, er fire farger som brukes. Derfor, fire sklier for hvert enkelt farge samt en sklie for bakgrunnsstøy kontroll og til slutt ett lysbilde for hele kombinasjonen farging. (Total slides = 6) Alle bilder vil bli behandlet ved siden av hverandre på en identisk måte for å redusere eksperimentelle variasjoner.
- Bake parafinsnitt ved 56 ° C i 1 time.
- Vask lysbilder 3x 10 min i xylen.
- Vask 2 x 5 min 100% etanol.
- Vask 1x 3 min 95% etanol
- Vask 1x 2 min90% etanol.
- Vask 1x 2 min70% etanol.
- Under den siste vaskeserien, pre-kokning natriumsitrat-buffer i 2 min (mikrobølgeovn på høy). (Kan erstatte med tris-EDTA-buffer, avhengig av antistoffer som er i bruk)
- Kok lysbildene i 20 min i natrium-citratbuffer (mikrobølgeovn på 10% kraft, eller i en trykkoker). Hvis buffer koker, skru av mikrobølgeovn og la sitte.
- Fjern varmekilden og la skinnene hvile i 30 min i natrium-citratbuffer til å kjøle seg ned.
- Vask objektglassene i vann i 5 min.
- Mark rundt tumor seksjoner med Pap Pen og satte 2% BSA / 1% FBS malelnsyre blokkering buffer for en hr. Forbered lysbildene individuelt som å ikke la dem tørke ut i løpet av dette trinnet.
- Forbered primære antistoffer ved optimal fortynning i blokkering buffer. (Dersom de antistoffer som er i bruk er alle av forskjellige arter (eller IgG-kjeden variant-ex: IgG1 vs IgG2a av samme art) de kan anvendes i kombinasjon i løpet av såingle inkubasjonstid. Dersom antistoff-arter overlapper hverandre, så inkubasjoner må utføres sekvensielt for å minimalisere antistoff kryss-reaksjonen.)
- På dette punktet, la to lysbilder med bare å blokkere buffer. Disse to lysbilder vil tjene som unstained kontroll og kjernefarge kontroll. De andre ensfargede kontroller vil bli inkuberes med individuelle primære antistoffer. Bare analysen glide vil ha en kombinasjon av primære antistoffer.
- Inkuber lysbilder med primære antistoff i en fuktighetskammeret boksen på langsom-roterende risteapparat ved 4 ° over natten (~ 16 til 20 hr) (NB: når man arbeider med 4 + fluoroforer, sekvensiell farging eller direkte konjugasjon kan være nødvendig for å minimalisere antistoff kryssreaksjon . Under disse omstendigheter gjenta trinn 01.16 til 01.21 frem til alle antistoffer brukes til lysbildene.)
- Vask lysbilder for 10 min i PBST (2x) forsiktig på shaker
- Mens vask går, forberede Alexafluor 488, 594 og 647 sekundære antistoffer for en endelig fortynningav 1:1.000 i blokkering buffer. (Sørge for at disse antistoffer og fortynninger blir holdt ved 4 ° C og i mørket til enhver tid å opprettholde fluorescens på tvers av batcher og over tid.)
- På de enkelte fargekontroll lysbilder, plasserer enkelt Alexafluor fortynninger matchende arter av den primære antistoff som brukes. Alle sekundære antistoffer vil bli plassert på analyse lysbilde. De ufargede og den kjernefysiske farget kontroll lysbilder vil være med å blokkere buffer gjennom dette trinnet.
- Inkuber i fuktkammer boks (dekket med aluminiumsfolie for å unngå lyseksponering) på sakte roterende shaker ved RT i to timer.
- Vask lysbilder for 5 min i PBST (2x) forsiktig på shaker. Dekk med aluminiumsfolie for å beskytte mot lys.
- Legg DAPI (1:10.000) i 1 min til DAPI-bare glide og analysen lysbilde. Dekk med aluminiumsfolie for å beskytte mot lys. De andre lysbilder kan stå dekket i vaske beholdere.
- Vask to DAPI-inkubereslysbilder i en egen beholder for den første 5 min vask som å ikke forurense de andre lysbildene med DAPI flekken. For det andre 5 min vask, kan skinnene være kombinert i PBST (alle vaskinger bør gjennomføres på en shaker). Dekk med aluminiumsfolie for å beskytte mot lys.
- Kort dipslides i vann før cover-slipping (1,5 tykkelse med vannholdige monteringsmedier for å bevare fluorescens)
- La tørke 3 timer i mørket på RT.
- Forsegle kantene av dekkglass med spiker herder. (Ikke bruk neglelakk som aceton kan slukke den fluorescerende signal).
- Analyser glir umiddelbart eller lagres ved 4 ° C for videre analyse.
4. Multispektrale Imaging
- Samle multispektrale bilder utnytte en Nuance EX-kamera (som inneholder en flytende krystall tunbare filter) på et Olympus X-63 oppreist mikroskop med Nuance programvare for datainnsamling.
- Samle-bilder ved hjelp av en objektiv olje for å øke oppløsningen.
- Initiativl set-up omfatter innstilling av spektralområdet for hver fluoroforen er i bruk.
- For fire farger:
- DAPI: 420-480nm
- AF488: 490-580 nm
- AF594: 590-640nm
- AF647: 650-720nm
- For fire farger:
- Ta en første bilde av analysen lysbilde for å oppnå de riktige eksponeringstider for hver av de spektrale områder.
- Lag "spektral bibliotek" at programvaren vil bruke for å identifisere og skille de signal-til-støy-forholdet av fluoroforene fra hverandre og bakgrunnssignal. (Merk: Hver fluorochrome må ha sin egen singel fargekontroll lysbilde for å sette sammen en spektral bibliotek med passende bølgelengde kurver for å sikre riktig analyse av datasettet Eksempel: 3 fluoroforer = 4 kontroll lysbilder, 5 fluoroforer = 6 kontroll lysbilder.).
- Bilde den unstained lysbilde først. Dette lysbilde vil bli utpekt i løpet av den spektrale library som bakgrunn.>
- Bilde DAPI-bare skyver andre. Dette lysbilde vil bli brukt til å utpeke DAPI-farget kjerner med "tegne"-verktøyet, og vil bli lagret i spektral bibliotek som DAPI.>
- Bilde på AF488-bare skyv tredje. Dette lysbilde vil bli brukt til å utpeke AF488-farget regioner med "tegne"-verktøyet, og vil bli lagret i spektral bibliotek som AF488.>
- Bilde på AF594-bare skyv fjerde. Dette lysbilde vil bli brukt til å utpeke AF594-farget regioner med "tegne"-verktøyet, og vil bli lagret i spektral bibliotek som AF594.>
- Bilde på AF647-bare skyv femte. Dette lysbilde vil bli brukt til å utpeke AF647-farget regioner med "tegne"-verktøyet, og vil bli lagret i spektral bibliotek som AF647.>
- Etter samling av de enkelte spektral-komponentlagre spektral bibliotek og protokollen.>
- Når spektral bibliotek er komplett, finne områder av interesse på analyse lysbilde på mikroskopet og samle / lagre bilder.>
5. Kvantitativ analyse av Multispectral Images
- Importere et representativt utvalg av oppkjøpte Nuance bilder med InForm Software.
- Åpne den lagrede spektral bibliotek som angis av programmet
- Identifiser vev regioner av interesse som skal bli analysert. (F.eks svulstvev versus fettvev).
- Identifisere enkeltceller basert på DAPI-flekken. Cytoplasma vil bli definert automatisk basert på formen på kjernen.
- Plukk den fluorescerende intensitet lese ut av valget for hver fluorescerende parameter (f.eks gjennomsnitt, standardavvik)
- Batch den ervervede bilder og la programvaren prosessen ved hjelp av den foreslåtte algoritmen.
- Når bildebehandlingen er ferdig, fletteresultatfiler.
- Åpne resultatene i Excel (eller hvilken som helst annen analytisk programvarepakken) og plotte to fluorescerende intensiteter mot hverandre på XY aksen. Hver fluorescerende intensitet er gitt per celle. Den doble positive celler vises i øvre høyre kvadrant. Bruker må definere basis fluorescerende intensiteter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av en multispektrale avbildningsteknikk å analysere svulster innpodet i vår transgen BMT mus modell, er vi i stand til å skjelne stromal tumor komponenter som er av benmargen opprinnelse. Den innledende BMT ble bekreftet tre uker etter transplantasjonen ved strømningscytometri (figur 1). Orthotopically injisert umerkede ovarietumorer følgende BMT engraftment bekreftelser ble skåret ut og formalinfiksert seks uker etter innledende svulst injeksjon. Parafin innebygd tumor delene ble seksjonert i <8 mikrometer skiver og farget. Passende enkeltfargekontroll lysbilder ble gjort for hver Fluoroforen inkludert en for bakgrunns autofluorescence. Tabell 1 omfatter potensiell art og fluorokromkonjugerte kombinasjoner for 2-7 parametere. Etter fargingen prosedyre ble bildene anskaffet ved hjelp av en Nuance kamera vedlegg og Nuance Software. Når du har opprettet en spektral bibliotek med enkle fargekontroll lysbilder (Figur 2A), vi were i stand til å "unmix" bilder av multi-merket eggstokkene tumor seksjoner som ble tatt viser uttrykket av GFP (Antistoff # 1) sammen med kjernefysisk DAPI og to andre markører (antistoffer # 2 og # 3). (Fig. 2B) Tilsetning av flere markører er mulig og figur 2C-D viser et bilde av en svulst seksjon med seks markører pluss en kjernefarge. Til slutt ble alle ervervede bildene importeres til InForm (CaliperLS, Hopkinton, MA) programvare for analyse. Nuance (CaliperLS, Hopkinton, MA) programvare er kompatibel med andre pakker som MetaMorph (Molecular Devices) eller IPLab (Scanalytics, BD Biosciences). Videre kan bilder og spektral datasett også lagres som TIFF-filer og sett på noen program som leser dette filformatet. Bruke InForm Software, var vi i stand til å klassifisere vevsregioner av interesse innenfor kreft seksjoner (Tall 3A og E) og sette algoritmer for de fluoriserende intensiteter av hver fluorochrome per celle based på DAPI kjernefarge (Tall 3B-C). Til slutt var vi i stand til å plotte den enkelte celle basert på de fluoriserende intensiteter av to markører, AF488 og AF647 (Figur 3D). Vi etableres en dobbel positiv cellepopulasjon basert på et bestemt fluorescerende intensitet terskel (figur 4). Som datasettet blir mer komplisert med flere parametere, er det potensial for de data som skal analyseres ved hjelp av SPADE programvare 10 (som strekker seg over-tree progresjon analyse av normaliserte tetthets events), men dette har ennå ikke utføres. Denne programvaren gjør det mulig for visualisering av co-uttrykk trender over store datasett og kan innebære foreningen / relasjoner mellom klynger av co-uttrykt markører innenfor analysert vevssnitt.
Tabell 1. Immunofluorescent farging kontroll forberedelse til 2-7 farge multiplex farging. (A) Inkluderer opp til en fire-farge alternativet. (B) (C) omfatter en syv farger alternativ innenfor det synlige lysspektrum.
Figur 1. Benmargstransplantasjon bekreftelse av flowcytometri. (A) Dot plott av sirkulerende blodkreft celler befolkning innenfor GFP transgene mottaker mus som er positiv (B) for RFP + blodkreft cellene i forhold til å kontrollere RFP + og kontrollere GFP + mus og negativ (C) for GFP + celler.
Figur 2. Spectrally ublandet image prosess. (A) (B) Multispectral bildet en murine ovarial tumor delen viser fluorescensmerkede celler, # 1: AF488 (ex 495 nm / em 510 nm); # 2 : AF594 (ex590/em617 nm); # 3: AF647 (ex 650/em 668 nm) og kjernekraft: DAPI (ex 350/em 470 nm). Enkle farger vises i hvitt (C) Skjermbilde av 7 farge spektral bibliotek opprettet for analyse av ovarian tumor seksjoner (D) Multispectral bildet en murine ovarial tumor delen viser fluorescensmerkede celler; atom:.. DAPI (ex350/em470 nm ); AF488 (ex 495/em 519 nm); AF514 (ex518/em540 nm); AF568 (ex 578/em 603 nm); AF594 (ex 590/em 617 nm); AF633 (ex 632/em 647 nm); AF660 (ex 663/em 690 nm) og. Enkle farger vises i hvitt samt matchende kompositt farge. Klikk her for å se større figur .
Figur 3. MIMicc Visning av kvantitativ Inform analyse. (A) Første bilde representerer klassifisering av vev segmenter etterfulgt av (B) til oppdeling av celler basert på atom farget DAPI. (C) Kvantifisering av fluorescerende markør kan måles i kjernen og cytoplasmaet og eksportert inn i (D) utmerker seg for videre analyse. (E) Vevet segmenteringsalgoritmen er i stand til ytterligere å identifisere vev undertyper basert på vevsarkitektur og ikke utelukkende på fluorokrom momenter som gir en mer robust analytisk verktøy for å klassifisere farging i forskjellige vev regioner. I dette bildet, har datamaskinen blitt opplært til å identifisere fem sub-regioner basert på architectural mønstre i vev: bakgrunnen er definert av tomme mellomrom, er hemolytiske tumor definert av overflod av de røde blodcellene i vevet, blir tumor definert i tettbygde celler, fett er definert av store, symmetrisk, tomme cellene, og muskel er definert av en tverrstripet mønster. Klikk her for å se større figur .
Figur 4. Plot av enkeltceller fra 20 oppkjøpte bildene viser de doble positive celler basert på fluorescerende intensiteter av GFP merket med AF488 og αSMA merket med AF647.
Supplerende dokument. Tips og triks for Multiplexing fem eller flere sonder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Heri beskriver vi anvendelse av multispektrale avbildning vi beskrive som MIMicc-multispektrale utspørring av Multiplexed cellulære sammensetninger, for å analysere de benmarg avledet stromale komponenter i tumor mikromiljøet, men denne metodikk og konsept kan benyttes til å tolke andre cellulære elementer som utgjør et komplekst vev som de sett under sårtilheling reaksjoner eller under en regenerativ vev. I disse forsøk benytter vi transgene mus for å fluorescensmerket skille de benmargceller avledet fra verten avledet celler i løpet av en innpodet tumor mikromiljøet, men denne teknikken gir seg til bruk av noen reporter gen merkede celler, og er spesielt amendable til celler som uttrykker genet etiketter som er lett merkbar ved immunhistokjemi, slik som LacZ, glukuronidase, Hans (6X) -, HA, FLAG-tag merkede celler, etc. 11.
I vår modell følgeofring av transplanterte mus ble svulsten seksjoner behandlet og farget med antistoffer for å identifisere opprinnelsen av cellen, RFP + benmargsdonor avledet eller GFP + verten vev avledet. I figur 2 viser vi to markører ko-uttrykker med verts avledet GFP +-celler i tumoren mikromiljøet. Men vi vise mulighetene for syv farger farging ved hjelp av samme system i figur 2D.
Disse dataene er en representasjon av hva som er i stand til å utnytte vår transplantasjon og multispektrale bildebehandling modell. Dette systemet er svært fleksibelt og kan huse flere parametere inkludert: 1-endrede BMT populasjoner / transgene musemodeller, to-alternative svulst / sykdom modeller, eller tre-alternative markører (f.eks overflate, intracellulær, fosfor proteiner). Vanligvis, med økende antall immunhistokjemiske flekker på samme lysbilde, blir dataanalyse krevende, men bruker en multispektrale bilde plattformer og assorende unmixing programvare gjør det mulig effektive, pålitelige og reproduserbare resultater. Vi gir potensielle antistoff arter og fluorescerende label kombinasjoner i Tabell 1. Videre gir denne teknikken for allsidighet i sonde / antistoff valg på grunn av muligheten for å bruke både frossen og parafin innebygde vevssnitt gjør denne teknikken som gjelder for kliniske vevsprøver i tillegg til grunnleggende forskning modeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
FCM, CMB, og ELS har ingen konflikter og ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi er takknemlige til diskusjoner, veiledning og støtte fra legene. Michael Andreeff MD, PhD., Og Jared Burks PhD. fra MD Anderson flowcytometri og Cellular Imaging Core Facility. Dette arbeidet ble støttet delvis med tilskudd fra National Cancer Institute (RC1-CA146381, CA-083 639, R01NS06994, CA116199 og CA109451 for FCM. ELS er også støttet av hæren Department of Defense (BC083397).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||||||||||||||||
| .2 μm filter | Fisher | 09-740-35A | |||||||||||||||||||||||||||||
| 10 ml lure lock | BD | 309604 | |||||||||||||||||||||||||||||
| 25 G needle | Cardinal | BF305122 | |||||||||||||||||||||||||||||
| 40nm filter | BD | 352340 | |||||||||||||||||||||||||||||
| 50 ml conical tube | Fisher | 1495949A | |||||||||||||||||||||||||||||
| Alexafluor 488-ms1 | invitrogen | A21121 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Alexafluor 594-Rb | invitrogen | A21207 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Alexafluor 647-ch | Invitrogen | A21449 | |||||||||||||||||||||||||||||
| BSA | Sigma | A7906-500G | |||||||||||||||||||||||||||||
| Cover slips | Corning | 2940-243 | |||||||||||||||||||||||||||||
| CRI-Nuance | Caliper Life Sciences | ||||||||||||||||||||||||||||||
| Dapi | Invitrogen | D1306 | |||||||||||||||||||||||||||||
| DMEM | CellGro | 10-017-CV | |||||||||||||||||||||||||||||
| Ethanol | Dharmacon | 4004-DV | |||||||||||||||||||||||||||||
| FBS | invitrogen | 16000-044 | |||||||||||||||||||||||||||||
| GFP-ms1 | Abcam | ab38689 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Insulin needle | BD | 329424 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Maleic acid | Acros | 100-16-7 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Moisture chamber box | Evergreen | 240-9020-Z10 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Mounting media | dako | S3023 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Nail hardener | Sally Hansen | 2103 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Pap pen | Abcam | Ab2601 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Pen/Strep L Glut | invitrogen | 10378016 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Steril PBS | invitrogen | 14040-182 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Trypsin | invitrogen | 252000-56 | |||||||||||||||||||||||||||||
Blocking Buffer
Antigen retrieval buffers:
|
|||||||||||||||||||||||||||||||
References
- Kidd, S., et al. Origins of the tumor microenvironment: quantitative assessment of adipose-derived and bone marrow-derived stroma. PLoS ONE. 7, e30563 (2012).
- Quintavalla, J., et al. Fluorescently labeled mesenchymal stem cells (MSCs) maintain multilineage potential and can be detected following implantation into articular cartilage defects. Biomaterials. 23, 109-119 (2002).
- Sasaki, M. Mesenchymal stem cells are recruited into wounded skin and contribute to wound repair by transdifferentiation into multiple skin cell type. Journal of immunology. 180, 2581-2587 (2008).
- Spaeth, E. L. Mesenchymal stem cell transition to tumor-associated fibroblasts contributes to fibrovascular network expansion and tumor progression. PLoS ONE. 4, e4992 (2009).
- Wels, J., Kaplan, R. N., Rafii, S., Lyden, D. Migratory neighbors and distant invaders: Tumor-associated niche cells. Genes and Development. 22, 559-574 (2008).
- Weis, S. M., Cheresh, D. A. Tumor angiogenesis: molecular pathways and therapeutic targets. Nat. Med. 17, 1359-1370 (2011).
- Bataille, F. Multiparameter immunofluorescence on paraffin-embedded tissue sections. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 14, 225-228 (1097).
- van Vlierberghe, R. L., et al. Four-color staining combining fluorescence and brightfield microscopy for simultaneous immune cell phenotyping and localization in tumor tissue sections. Microscopy research and technique. 67, 15-21 (2005).
- Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue. BMC cell biology. 9, 13 (2008).
- Qiu, P., et al. Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE. Nat Biotechnol. 29, 886-891 (2011).
- Belizario, J. E., Akamini, P., Wolf, P., Strauss, B., Xavier-Neto, J. New routes for transgenesis of the mouse. Journal of applied. 53, 295-315 (2012).
