טכניקות לעיני עיבוד השתלה תותבת רשתית לניתוח Histopathological מרוכזות

Summary

טכניקות להדמית cytoarchitecture רשתית ישירות בסמוך לאלקטרודות בודדות בתוך ממריץ רשתית.

Abstract

עם ההתפתחות האחרונה של תותבות ברשתית, חשוב לפתח טכניקות אמינות להערכת הבטיחות של מכשירים אלה במחקרים פרה. עם זאת, הקיבוע סטנדרטי, הכנה, והליכי היסטולוגיה אוטומטיים הם לא אידיאליים. כאן אנו מתארים נהלים חדשים להערכת סיכון של הבריאות של הרשתית ישירות הסמוכה לשתל. פרוטזות רשתית כוללות מערכי אלקטרודה במגע עם רקמות העין. שיטות קודמות לא הצליחו מרחבית למקם את רקמת העין הסמוכה לאלקטרודות בודדות בתוך המערך. בנוסף, עיבוד היסטולוגית סטנדרטי לעתים קרובות תוצאות ניתוק artifactual ברוטו של שכבות הרשתית בעת הערכת עיניים מושתלות. כתוצאה מכך, זה כבר קשה להעריך נזק מקומי, אם קיים, שנגרם על ידי השתלה וגירוי של מערך האלקטרודה מושתל. לכן, פיתחנו שיטה לזיהוי ואיתור רקמות העין הסמוכות לדואר מושתלlectrodes באמצעות ערכה (בצבעים) צבע סימון, ואנחנו שונה טכניקת קיבוע העין כדי למזער את היפרדות רשתית artifactual. שיטה זו גם הפכה את לובן העין שקופה, המאפשרת ללוקליזציה של אלקטרודות בודדות וחלקים ספציפיים של שתל. לבסוף, השתמשנו בביקורת מותאמת כדי להגדיל את כוחו של הערכות histopathological. לסיכום, שיטה זו מאפשרת אפליה אמינה ויעילה והערכה של cytoarchitecture הרשתית בעין מושתל.

Introduction

פרוטזות רשתית עשויות להפוך בקרוב התערבויות קליניות שימושיות לטיפול בצורות שונות של אובדן ראייה חמור. בתנאים מסוימים, כגון רטיניטיס פיגמנטוזה (RP), מביאים לניוון הנרחב של קולטני האור בעיניים, אלו הם תאי אחראי transducing אור לאותות עצביים. עם זאת, כמה תאים בשכבות אחרות של הרשתית יישארו והם יעדים פוטנציאליים לגירוי חשמלי עם ¹ תותב רשתית. תוצאות מוקדמות של ניסויים קליניים בבני אדם כבר מבטיחות למערכי אלקטרודה המושתלים ^ב2,3 epiretinal, subretinal ^4,5, וintrascleral ⁶ מקומות. מכשירים אלו עשויים מחומרים שונים עם צורות שונות, אך כולם משתמשים בפולסים חשמליים כדי להפעיל את הנוירונים קיימא הנותרים של הרשתית על מנת ליצור תפיסות חזותיות.

הקבוצה הגדולה יותר שלנו (Bionic החזון אוסטרליה) פיתחה שתל רשתית שיש Progressed למחקר פיילוט קליני עם 3 חולי RP מושתלים אלקטרודה עם מערכי suprachoroidal (מספר ניסויים קליני: NCT01603576). איור 1 א מציג תותב רשתית אב טיפוס suprachoroidal זה.

בטיחות מטופל היא בעל חשיבות עליונה במחקרים קליניים, ולכן, לפני תחילת ניסויים בבני אדם, ביצענו בדיקות אקוטיות וכרוניות נרחבות במודלים פרה (איור 1). הערכות histopathological היו חיוניות כדי לחדד את ההליכים כירורגיים, לחזר דרך עיצוב אלקטרודה, וסופו של דבר לקבוע את הבטיחות של השתל. כדי לשמור על זרימת עבודה יעילה השתלבה עם שיטות פתולוגיה קליניות סטנדרטיות, טכניקת הטבעת פרפין הועסקה. גם זה היה רצוי לנצל הליכים מכתים השוואה לסטנדרטים קליניים, כגון haematoxylin ו eosin (H & E), שמתפרשים בקלות על ידי פתולוגים. גם אנחנו רוצים טכניקה שיכולה להיות מותאמות לניתוחי immunohistochemical, בעל מנת להקל עוד יותר הערכה תאית של הרקמות.

Biocompatibility של חומרי השתל, והבטיחות של גירוי חשמלי כרוני, צריך להיות מוערך בזהירות. זה חשוב להיות מסוגל לבחון histopathology של רקמת העין הסמוכה לאלקטרודות גירוי הבודדות בתוך המערך. עם זאת, את המערכים יש לסלקו קודם לעיבוד הדגימות, כדי שיוכלו להיבחן, ובגלל שהרכיבים המתכתיים שלהם לא היו יכולים להיות בקלות מחולק. כתוצאה מכך, הכנת הרקמה ומבוססת שלנו לא התירה לוקליזציה ומיפוי של רקמה ביחס לאלקטרודות המושתלות ^7. בנוסף לחוסר שיטת לוקליזציה רקמות, הקיבעון מבוסס פורמלדהיד הסטנדרטי וטכניקות עיבוד הביאו לממצאים נרחבים וניתוק של רשתית עקב להצטמקות ההפרש של השכבות השונות של העין (איור 2). בשל אי - ההומוגניות של tהוא הרשתית, היה קשה לעשות השוואות תקפות עם רקמת שליטה, במיוחד עבור מדידות כמותיות. מגבלות אלה בשילוב מסובכת הערכות מדויקות של נזק האפשרי שנגרם על ידי המערכים המושתלים שלנו.

כאן אנו מציגים טכניקות חדשניות להתגברות על מגבלות אלה. יש לנו שונה טכניקות קיבעון ועיבוד מיוחדות עיניים ^8-10 כדי לשמור על תאימות עם היסטולוגיה המבוססת על הנפט. יש לנו שונה וכתמים היסטולוגית immunohistochemical רגילים לתת תוצאות דומות, המבוסס על משוב מפתולוגים קליניים. לאחר בצוע שקוף רקמת scleral, צבע קוד צבע מבוסס הועסק כדי לסמן את רקמת העין הצמודה לכל אלקטרודה בודדות, לפני הסרת המערך ממרחב suprachoroidal. על ידי סימון מערך האלקטרודה ואתרי אלקטרודה הבודדים, דגימות יכולה להיות שנאספו מדויקת מהאזורים סמוכים אלקטרודה. דגימות תאמו יכולה להיות שנאספו מההעין שליטה אלקטרונית על מנת להקל על השוואות pairwise.

Protocol

1. Enucleation ולאחר קיבוע

פרוטוקול זה מבוסס על ההנחה כי הנושא כבר מושתל באופן חד צדדי עם מערך אלקטרודות suprachoroidal.

1. פתרונות postfix להכין בבקבוקי זכוכית שוט.
   1. הפתרון מקבע של דוידסון, 2x 100 מ"ל
      • 2 מיליליטר פורמלין (37% פורמלדהיד)
      • חומצה אצטית קרחונים 10 מ"ל (99.7%)
      • 35 מ"ל אתנול (98%)
      • מים מזוקקים 53 מ"ל
   2. 50% אתנול, 2x 100 מ"ל
   3. 70% אתנול, 2x 100 מ"ל
2. Transcardially perfuse נושא עם חמימים (37 מעלות צלזיוס) מלח heparinized ואחריו קר (4 מעלות צלזיוס) ניטראלי שנאגרו פורמלין (10%).
3. לקשור את התפרים בימבוס מעולה (או מיקום שהוא רחוק ממערך suprachoroidal) של שתי העיניים - בקנה אחד עם שריר Rectus, לשמש כנקודת ציון.
4. עיני Enucleate, שמירה על כל הפניות חיצוניות מהעין המושתלת.
5. הנח EACשעות העין ב100 מ"ל של הפתרון מקבע של דוידסון ולהשאיר לפוסט לתקן בטמפרטורת חדר.
6. לאחר 18-36 שעות במקבע של דוידסון, להעביר לאתנול 50% (טמפרטורת חדר) עבור 6 - 8 שעות, ולבסוף לאתנול 70% (טמפרטורת חדר).
7. מקרר דגימות על 4 מעלות צלזיוס ובחנות עד לנתיחה.

גלובס עיניים תמימים והדחוס כבר מאוחסן באופן זה לתקופה של עד 3 חודשים, מבלי להשפיע לרעה על תוצאת היסטולוגיה.

2. זיהוי ומיפוי רקמות

פרוטוקול הקיבעון לעיל (שלב 1) הפך את לובן העין השקופה והמערך הוא כעת גלוי - לרבות באתרי אלקטרודה הבודדים (איור 3).

1. הסר את העולם המושתל מאתנול ולקצץ משם בזהירות רקמה עודפת, כולל הלחמית והכמוסה של המחבר. חתוך עצב ראייה ל2 - 3 מ"מ אורך (איור 3 א).
2. באמצעות צבע מרקין היסטולוגיתגרם תכנית, תווית את האלקטרודות עם קוד צבע מוגדר מראש, נזהרת שלא להכתים את הצבע.

• אנחנו בחרנו חבילה זמינה מסחרי של צבע היסטולוגית מיוחד (ראה נספח). כמויות קטנות של הצבע יושמו בזהירות עם מברשת צבע קנס היטה (גודל Roymac 00) לרקמות ואפשרו לייבוש באוויר לתקופה של עד 5 דקות.
• לענייננו, יש לנו נבחרו: ירוק לאלקטרודה הפעילה (ים) שהייתה (היו) מגורה מקסימאלי, ברמות suprathreshold, למשך תקופת המחקר; אדום עבור אלקטרודות פעילה אחרות; צהוב על האלקטרודות תשואת הקוטר גדולה יותר, ו כחול למדריכים ו / או סימנים למרחקים אנטומיים (איורים 3 ב ו 3 ג) נוספים.
• ניסוי והטעייה חלקם עשויים להידרש כדי למצוא צבע שהוא יציב לאורך כל השלבים הבאים. לדוגמה, באיור 4, ניתן לראות שהצבע הירוק היה עמיד יותר מהצבע האדום. דילול הצבע ב 70% אתנול מסייע לשפר penet שומנים בדםמנה וציפוי רקמות.
• זה שימושי לשרטט או לצלם את העולם הצבוע לשימוש עתידי.

3. חזור אל 70% אתנול לייבש את הצבע.
4. חזור על שלב 2.1 לגלובוס שליטת unimplanted.
5. שימוש בתפרים מהשלב 1.3, ליישר את העין השליטה ועין המושתלת כזוג שיקוף.
6. מניחים בתבנית סיליקון (עם אותם הממדים כמו המערך אלקטרודות) במיקום השיקוף על העין השליטה כמו השתל ממוקם בעין המושתלת (נ.ב. בלובן עין השקוף וסימוני הצבע מהשלב 2.2 לאפשר הדמיה מוכנה של מערך העמדה המושתלת ).
7. בצע את השלבים 2.2 ו -2.3 לעין השליטה, כך שכל אתר האלקטרודה מושתל יש זוג שליטה במיקום אנטומית דומה (כלומר המראה המתאים שווה ערך).

3. נתיחה והטבעה

1. הסר את מערך השתל מהעין ולהסיר את החלק הקדמי של העין(כולל קרנית, קשתית העין ועדשה). הסר את נוזל זגוגית העין מהכוס הנותרת (קאמרי אחורי).
2. לנתח את העין המושתלת לרצועות יציגים מרובות (~ 2 מ"מ עובי) המכיל כל אחד מהם קבוצת משנה של אזורי הצבע המסומנים (איור 3D). שים לב שהנטייה של הרצועות צריכה להיות שנבחרה כדי לסייע בהערכת היבטים שונים של תגובת הרקמות לשתל ^7.

זה שימושי, לשימוש עתידי, כדי להפוך את שיא של אזורי שצבע נמצאים בכל רצועה ומיקומים היחסיים שלהם (וצבעים).

3. הנח את הרצועה על צדו לתוך בריכת רדודה של אגר הנוזלי (4%; 80 - 90 מעלות צלזיוס) עם הצד להיחתך פונה כלפי מטה ראשון (איור 3E).
4. ברגע שאגר קבע, לחתוך סביב הדוגמא והמקום לקלטת רקמה נתמכת על ידי מוסיף קצף (איור 3F).
5. חזור על שלבים 3.1-3.3 לעין השליטה - takטיפול ing לנתח בהתאמת מראה רצועות.
6. לעבד את כל הקלטות באמצעות טכניקת עיבוד פרפין הסטנדרטי (אוטומטית לילה).
7. שבץ רקמת מעובד בפרפין עם הצד להיות לחתוך כלפי מטה מול ראשון.

4. חיתוך וצביעה

1. חותכים לקוביות פרפין 5 סעיפים המתייחסים באופן קבוע מיקרומטר לביאורים מהשלבים 2 ו -3.
2. איסוף חלקים מכל אחד מאזורים הצבועים והר בשקופיות.

כעת ניתן להעריך את האזור מייד בסמוך לכל נקודה צבועה של לובן העין בביטחון שזה היה בקרבה הקרובה ביותר לאלקטרודה המקבילה במערך (איור 4).

3. כתם או לבצע immunofluorescence המועדפים. כתמי דוגמה ואימונוהיסטוכימיה מוצגות באיור 5 הם: H &E; Luxol המהיר כחול (LFB); סגול cresyl; Trichrome הכחול של האסון; החומצה שיף התקופתי (PAS); כחול הפרוסים sta 'פרלסב; synthetase אנטי גלוטמין (GS); חלבון אנטי neurofilament (NF); חלבון אנטי גליה fibrillary חומצי (GFAP) ו4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
4. כתמים רגילים ומיוחדים בוצעו כמפורט:
   1. צביעת H & E בוצעה לפי הפרוטוקול המסופק על ידי לייקה multistainer אמבטיה מערך ST5020 (לייקה Biosystems).
   2. סגולה LFB וcresyl (שונה ^מ11):
      1. Dewax ב3 שינויים של קסילן (2 דקות 3x) ו -2 שינויים של אתנול (100%, 100%) (2x 1 דקות) ולשטוף במים ברז (45 שניות).
      2. סעיפי מימה עד 95% אתנול.
      3. מקום בפתרון LFB ¹¹ ב 37 - 42 מעלות צלזיוס (לילה).
      4. יש לשטוף את עודפי כתם עם 70% אתנול.
      5. יש לשטוף במים מזוקקים.
      6. מקום ביתיום קרבונט לדלל (8%) (כמה שניות).
      7. להבדיל באתנול 70% (כמה שניות).
      8. יש לשטוף במים מזוקקים.
      9. חזור על צעדים ל4.4.2.6 4.4.2.8, במידת צורך, עד שבackground הוא חסר צבע.
      10. מקום בפתרון עובד אצטט סגול cresyl על 37 מעלות צלזיוס (10 דקות).
      11. אין לשטוף במים.
      12. ליבש ב3 שינויים של אלכוהול מוחלט (1x 30 שניות, 2x 20 שניות) ו3 שינויים של קסילן (1x דקות 30 שניות 1, 2x דקות 1).
      13. הר וcoverslip עם dpx.
   3. של אסון Trichrome הכחול (שונה ^מ11):
      1. Dewax לפי 4.4.2.1.
      2. להביא חלקים למים (2 דקות).
      3. כתם הגרעינים באמצעות ברזל haematoxylin של Weigert (2 דקות).
      4. לשטוף במים ברז, יש לשטוף במים מזוקקים.
      5. כתם בתמיסת fuchsin ארגמן חומצת Biebrich (5 דקות).
      6. יש לשטוף במים מזוקקים.
      7. להבדיל בחומצה phosphomolybdic-phosphotungstic עד קולגן הוא ורוד בהיר (6 דקות).
      8. יש לשטוף במים מזוקקים.
      9. Counterstain באנילין הכחול (1 דקות).
      10. לשטוף היטב ב1% חומצה אצטית (1 דקות).
      11. מייבשים, הר וcoverslip כעמ 'אה 4.4.2.12 ו4.4.2.13.
   4. PAS (שונה ^מ11):
      1. Dewax לפי 4.4.2.1.
      2. חמצן ב1% חומצה תקופתית (15 דקות).
      3. לשטוף במים זורמים ואז מים מזוקקים.
      4. כתם במגיב של שיף (15 דקות).
      5. לשטוף במים (5 דקות).
      6. Counterstain עם האריס haematoxylin דקות (1).
      7. בקצרה לשטוף במים ברז.
      8. להבדיל ב0.5% אלכוהול חומצה (מח"ש 1).
      9. לשטוף היטב במים ברז.
      10. הכחול במים ברזו של סקוט (1 דקות).
      11. לשטוף היטב במים.
      12. מייבשים, הר וcoverslip לפי 4.4.2.12 ו4.4.2.13.
   5. 'פרלס הפרוסי כתם כחול כפי שמתואר ^ב11.
5. מכתים immunofluorescence בוצע כמפורט:
   1. Dewax לפי 4.4.2.1.
   2. יש לשטוף במים מזוקקים (2x 5 דקות).
   3. לבצע אחזור אנטיגן באמצעות 0.01% חיץ ציטרט, 6 pH ב 75 - 80 ° C (20 דקות)ד להתקרר ב0.01% פתרון חיץ ציטרט (20 דקות).
   4. סעיפים לשטוף בופר פוספט (PBS) (2x 5 דקות).
   5. Permeabilize קרום התא בפתרון חיץ לשטוף (10 דקות).
   6. דגירה בפתרון לחסום סרום (2 שעות).
   7. דגירה סעיפים בנוגדן ראשוני חד דילול במדלל נוגדנים (% serum/0.1 עז נורמלי טריטון X-100/PBS 10%) (הלילה במקרר). Titre של כל נוגדן ראשוני משמש מוצג בטבלה 1.
   8. לאחר דגירה הלילה, לשטוף את החלקים בפתרון חיץ לשטוף (3 דקות 5x). מנקודה זו ואילך, לשמור על חלקים בחושך.
   9. דגירה סעיפים בנוגדנים משני המקביל בtitre של 1:500 לזמן מסוים (ראה טבלת מס '1 לפרטים נוספים).
   10. לשטוף חלקים בפתרון חיץ לשטוף (5 דקות 3x).
   11. דגירה סעיפים בDAPI (1:25,000 / PBS) (30 דקות).
   12. לשטוף חלקים בפתרון חיץ לשטוף (5 דקות 3x).
   13. ההר וcoverslip באמצעות לזרוחתקשורת הרכבה NT.

דגימות בדיקה ודגימות בקרה מוכנות להשוואת pairwise.

Representative Results

איור 4 מראה סעיף נציג המתקבל מחיתוך המדגם המתואר באיור 3. הקטע נחתך בעובי 5 מיקרומטר ומוכתם עם H & E על פי הפרוטוקולים שתוארו לעיל. הצורה הגולמית של רצועת המדגם נשמרה עם ממצאי רקמות דיפרנציאלי מינימאליים (איור 4 א). שני סימוני הצבע נראו על לובן העין, למרות שהצבע הירוק היה עמיד יותר מאשר האדום (איור 4). שכבות הרשתית לא היו מנותקות artifactually ומורפולוגיה הרשתית נשמרה (4C איור). רקמת הרשתית בסמוך לסימוני הצבע, שמתאים למיקום של האלקטרודות במערך, ניתן לזהות בקלות.

איור 5 מראה כתמים ואימונוהיסטוכימיה נציג מיוחדים של קטעי רקמה שהוכנו על פי הפרוטוקול הנוכחי. עיין באיור 5 captioחומרי n ונוספות לפרטים נוספים על הכתמים הספציפיים ואת השינויים שבוצעו לשימוש שלהם. לאחר השינוי, כתמים אלה ואימונוהיסטוכימיה היו שווי ערך לאמות מידה שנקבעה - כפי שאומתו על ידי פתולוגים.

סוג של נוגדנים וtitre העיקריים (בסוגריים)	GFAP (1:1500)	NF200 (1:100)	GS (1:100)
סוג של נוגדנים וtitre המשני (בסוגריים)	אלקסה פלואוריד 594	אלקסה פלואוריד 488	אלקסה פלואוריד 488
משך הדגירה של נוגדנים משני	שעה 1	2 שעות	45 דקות

טבלת מס '1. סוג הנוגדן, titre ומשך של תיוג.

איור 1. Suprachoroמערך אלקטרודות אבטיפוס idal. תצלום מאקרו) של מערך יצוק כיתה קלינית. ב ') Photomicrograph של מערך קליני בעבודת יד.

איור 2. היסטולוגיה רשתית לשעבר. שיטות היסטולוגית סטנדרטיות שמשו להכנתם, H & E מוכתמת, חלקי העין המושתלת עם מערך אלקטרודות suprachoroidal.) סעיף אורתוגונלי דרך חלל מערך אלקטרודות (מתואר על ידי כוכבים). הרשתית מנותקת מרקמות העין החיצונית. הדבר בולט במיוחד מתחת לאזור המושתל (חץ). אי אפשר לקבוע איזה חלק של רשתית היה צמוד לכל אלקטרודה בודדות של המערך. Scalebar = 1 מ"מ. ב ') ההגדלה גבוהה יותר של האזור התאגרף בלוח. ישנם כמה, במרווחים קבוע, חפצים בLaye הרשתיתRS (חיצים), כמו גם ניתוק גדול מהשכבה tapetal (השכבה רעיוני בעיניים של חתולים). Scalebar = 100 מיקרומטר. ג) ההגדלה גבוהה יותר של האזור התאגרף בלוח ב '. החץ הצביע על מגזרים החיצוניים של קולטני האור, כמו גם את האפיתל pigmental, שנותר על כנן, טוען כי הניתוק היה תופעת לוואי artifactual של העיבוד, בניגוד לנגרם על ידי טראומה בvivo או פתולוגיה. Scalebar = 20 מיקרומטר.

איור 3. לוקליזציה וDissection של אלקטרודה-סמוך רקמות. לספירה) תמונות טווח דינמיים גבוהות המאקרו של העין enucleated, עם מערך אלקטרודות suprachoroidal באתרם.) הודעה קבועה עם המקבע של דוידסון, ולפני הסרת מערך, בלובן העין השקוף מאפשרת הדמיה שלהאלקטרודות הבודדות במערך (דוגמה אחת מסומנת בחץ). ב ') האלקטרודות המסומנים בצבע צבע מוגדר מראש. C) סימוני צבע במרווח קבוע מציוני הדרך אנטומיים משמשים כדי לשמור על עקביות לאורך ניסויים. ד') לאחר ההסרה של מערך, העין היא גזור ביד לדוגמא רצועות. חצים צבעוניים מציינים שניים מהאתרים הסמוכים אלקטרודה על לובן העין. קו מקווקו צהוב מציין מטוס של חתך. ה) מקרו תצלום של רצועת מדגם מוטבעת בתוך בלוק. אגר F) צילום מאקרו ברצועה אגר להטביע מדגם E מהלוח, לגזור והניח בקלטת הטבעה נתמכת על ידי כריות ביופסיה קצף כדי למזער את התנועה של הקטע במהלך עיבוד.

איור 4. היסטולוגיה רשתית חדשה. טרונג> רצועת המדגם לעיל (מאיור 3D), המכילה את כיס אלקטרודה, היה פרפין מוטבע, מחולק ב 5 מיקרומטר ומוכתם H & E.) ירוק ואזורים צבועים באדום (מסומן בחצים, כמו איור 3D) נראים ב לקח את סעיף ברמה של הקו המקווקו הצהוב באיור 3D. בר סולם = 1,000 מיקרומטר. הרשתית אינה מנותקת, לא מתחת לכיס המערך ולא מרחוק. ב ') באזור התאגרף מלוח עם צבע אדום וירוק נראה מצויינים על ידי חיצים, והרשתית שלמה לאורך כל הדרך. בר סולם = 500 מיקרומטר. C) האזור התאגרף מהלוח ב ', המציג את שלמות, מצורפת, רשתית הסמוכה לצבע הירוק. בר סולם = 50 מיקרומטר. ידיעת שהמיקום של הצבע מציין את המיקום של האלקטרודה, אנחנו יכולים בביטחון להעריך את רקמת הרשתית בסמוך לנזק, אם בכלל, שנגרם על ידי גירוי חשמלי.

ve_content "עבור: לשמור-together.within עמודים =" תמיד ">
איור 5. דוגמאות לcytohistochemistry רשתית שונה באמצעות כתמים וimmunofluorescence מיוחדים. השימוש במקבע של דוידסון, בניגוד לטכניקות סטנדרטיות פורמלין קיבעון, שינויים נדרשים בפרוטוקולי הצביעה הרגילים, כפי שתוארו בפרוטוקול הטקסט הראשי. הפתולוגים אישרו כי שינויים אלה הביאו לצביעה שווה ערך.) H &E; haematoxylin כתמים סגולים גרעיני תא תוך הציטופלסמה תא כתמי eosin, קולגן ורקמות תומכים גוונים שונים של ורוד. ב ') LFB כתמים כחולים המיאלין בעוד counterstain הסגול cresyl יכול לשמש כדי . לזהות תאי הגנגליון על ידי צביעת גופי Nissl בתוך perikaryon הכחול ומדגיש את תאי הלווין המקיפים את תאי C) Trichrome הכחול של האסון; Biebrich ארגמן חומצת fuchsin פתרון כתמי השריר FiBers אדום, ואילו את הכתמים הכחולים אנילין קולגן, במקרה זה בלובן העין, הכחול D) PAS;. רכיבי גליקופרוטאין של קרום במרתף ומרכיבי רקמת חיבור מגואלות סגולים, בעוד haematoxylin counterstains תא דואר גרעינים סגול) 'פרלס כחול הפרוסים. באתר של דימום, היווצרות של haemosiderin מתאי דם אדומים מושפלים ושחרור של קומפלקסי ברזל מייצר צבע סגול ואילו התוספת של צבעי כתם אדומים ניטראליים lysosomes אדום F) GS;. האנזים המשפיל הזה מוליך עצבי שנמצא בתאי מולר ¹³ (ירוק ), ניתן לראות הרחבת בשני הכיוונים עם גופי תא מולר בשכבת הגרעין הפנימי וendfeet תא מולר יוצר את הקרום הפנימי הגבלת G) NF-200;. השרשרת כבדה חלבון cytoskeletal (ירוק) שנמצאה בסומה התא ותהליכים , Crosslinks עם neurofilaments אחר כדי לשמור על המבנה של תאי עצב ^14,15. גנגליוןתאים והאקסונים שלהם ניתן לראות בשכבת תא גנגליון ושכבת סיבי עצב, ואילו האקסונים של תאים אופקיים הממוקמים בדייר החיצוני של שכבת הגרעין הפנימית ברשתית של החתולים, הם גם הדגישו. Counterstaining עם DAPI (כחול) מאפשר הדמיה של שכבות רשתית H) GFAP;. חלבון cytoskeletal זה (אדום) התרבו בתאים והאסטרוציטים מולר במהלך דבק ^16, ניתן לראות בתור שכבת סיבי העצב עם תאי מולר להרכיב דקות הרחבות דרך פנימי שכבות רשתית חיצוניות. Counterstaining עם DAPI (כחול) מאפשר הדמיה של שכבות הרשתית. בר סולם = 50 מיקרומטר בכל הלוחות. הרשתית הפנימית מוצגת בחלק העליון של כל תמונה; הרשתית החיצונית מוצגת בחלק התחתון של כל תמונה, לא כולל לוח E, אשר מציגה תגובת subscleral.

Discussion

הערכת הבטיחות של השתל היא שיקול עיקרי למחקרים פרה. לפני תותב רשתית יכולה להיות מושתל בבני האדם הוא חיוני כדי לוודא שזה לא יגרום כל נזק. זה דורש הערכה של שניהם biocompatibility שתל ^17-23 וכן כל נזק פוטנציאלי שיכול להיגרם על ידי גירוי חשמלי כרוני ^24-26. ניסיון עם תותבות עצביות דומות, כגון שתל השבלול, מספק תובנה על מגוון הרחב של גירויים, ופיסיים, פרמטרים שאינם גורמים נזק לרקמות ^27. עם זאת, יש לו את רשתית מאפיינים שונים לאתרים אחרים השתלה ומגבלות בטיחות ולכן מדויקות (כגון צפיפות מטען המרבית) לא ניתן להניח ממחקרים קודמים במערכות אחרות. צפיפויות טעינה הן הגבוהים ביותר באתרי אלקטרודה הפעילים וזה מתכתב עם הפוטנציאל הגדול ביותר לנזק. לכן שיטה לאיתור את הרקמה הסמוכה ישירותלאלקטרודות הפעילים הבודדות יהיה להגדיל באופן משמעותי את השימושיות של מחקרים אלה. הרקמות הסמוכות לאזורים ספציפיים של השתל יכולה גם להיות מודגשות לבדיקה מדוקדקת יותר. גישה ממוקדת זו מאפשרת סעיפים פחות להיות מנותחים, תוך שמירה על ביטחון, כי "תרחיש המקרה הגרוע ביותר" נבדק.

שיטת לוקליזציה צבע scleral המתוארת כאן נבדקה בהרחבה עם סיליקון ביד בצורה והיצוק / אלקטרודה arrays Pt ^28-30. זה כבר נעשה שימוש במערכי סרט דק פוליאמיד ^7,31 וגם סרט דק סיליקון / Pt מערכים ^32. כמה מחקרים תותבים רשתית מועסקים אלקטרודות "כדור בצורת" עם implantations intrascleral ^33. הטכניקה הנוכחית צריכה להיות יעילה להערכת סוג של אלקטרודה arrays זה. עיניים חתוליות עם לובן העין (עובי דק בקוטב אחורי 90-200 מיקרומטר) אפשרו להדמיה של אלקטרודות בודדות במערך. עם זאת, גם אם אדם אלקטרוdes לא היו גלוי לעין, את עמדותיהם אפשר להסיק בקלות שימוש בתבנית סיליקון, כאשר ניתן לראות את קווי המתאר של המערך (בדומה לזה המשמש בשלב 2.6).

מיפוי הצבע מגביל את הצורך בקבלת חלקי רקמות שאינם רלוונטיים כסעיפים רק עם הווה הצבע מתקבלים. היכולת להסיק עמדת האלקטרודה במדויק לא רק מאפשרת ניתוח histopathological רלוונטי וכוח סטטיסטי רב יותר, אך יש לו השפעה גדולה על זמן וניהול עלויות על ידי הפחתת כמות השקופיות ולהבים בשימוש, כמו גם את עלות העבודה. השימוש בצבע שהוא חסיד והוא יכול לעמוד עיבוד רקמות בזמן גם להיות גלוי בחלקי רקמות בלא כתם הוא שיקול חשוב ראשוני. ידע של המיקום של הצבע והכיוון של הרקמות בנתיחה ובמהלך ההטמעה מסייע בתהליך החיתוך. זה כולל כראוי orientating הבלוק כדי להשיג קטע שאינו אלכסון לגזור ונותן representati מלאעל של הרקמה. לכן חשוב שהאדם המבצע את החיתוך הוא נוכח בזמן של צבע יישום, לנתיחה והטבעה.

הפרוטוקול הכולל הוא איתן לשינוי קל, במיוחד עם תזמוני קיבעון. עם זאת, לנתיחה העין וצעדים לציון צבע הם פעולות עדינות הנהנים ממיומנות ידנית טובה כדי למנוע פגיעה בדגימה. בעוד מקבע של דוידסון הוכיח עצם כיעילה להפחתת ניתוק artifactual של הרשתית ליד שתל, זה לא מונע נזק מכאני ישיר במהלך נתיחה. המקבע של דוידסון לא היה תואם בקלות עם כמה נהלים היסטולוגית וimmunohistochemical מיוחדים. לכן לא היה צורך לשנות / לייעל את הפעולות הבאות, כמפורט לעיל. שינויים מצטברים בזמנים מכתים וריכוזים שנעשו עד לקבלת התוצאה האופטימלית הושגה - לקבלת פרטים נוספים, עיינו בחומרים המשלימים.

כימות של רשתיתהיסטולוגיה נותרת בעייתית. הרשתית היא שאינן הומוגני וגם העובי וצפיפות תאים עם שינוי מרחק הולך וגדל מהאזור centralis ^34,35. לכן, רקמות השכנות מושתלת בתוך העין לא יכולות לשמש להשוואות ועין שליטה מועסקת במקום. Pairwise ההתאמה של כל קטע עם העין השליטה נותנת לנו השוואה סטטיסטית חזקה יותר של שינויים פתולוגיים; תוצאות יעילות ובטיחות עם תותבות רשתית טובה יותר העריכה כאשר משווים את עיני חברים ^ב36 נושא. יש לנקוט באמצעי זהירות מיוחד כדי למזער את החיתוך אלכסוני כמו זה ישפיע על כימות.

לסיכום, בשיטות שתוארו לעיל השתפרו ניתוח histopathological שלנו, אשר בתורו הוביל לזרימת עבודה יעילה יותר באופן משמעותי קלינית. התוצאות של מחקרים פרה באמצעות שיטות אלה הובילו ישירות לניסוי קליני בחולים ש3 RP כבר מושתלים בבטחה עם suprachoroiפרוטזות רשתית דאל. שיטות אלה הן רלוונטיות גם לגירוי ברשתית העין ושתלים אחרים שבו התגובה פתולוגית להשתלה לטווח ארוכה צריכה להיות מוערכת. שיטה זו סיפק יתרונות כדאיים לשמירה על cytoarchitecture והרישום של הפתולוגיה לאזורים של עניין על השתל. למרות שלא נבדק באופן ספציפי, שינוי של נהלים אלה עשויים לשמש במינים אחרים ובמקומות אנטומיים אחרים, במיוחד כאשר מערך הוא מושתל שטחי.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
The Davidson marking system	Bradley Products	1163-4 - red 1163-5 - blue 1163-2 - yellow 1163-1- green
Rabbit Polyclonal Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody	Millipore	AB5804	1:1500, overnight incubation
Mouse Monoclonal Anti-Glutamine Synthetase Antibody	Millipore	MAB302	1:100 overnight incubation
Monoclonal Mouse Anti-Neurofilament 200 Antibody	Sigma-Aldrich	N0142	1:100 overnight incubation
4',6-diamindino-2-phenylindole, dilactate (dilactate)	Life Technologies	D3571	1:25,000 30 min incubation
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG	Life Technologies	A11029	1:500
Superfrost 90° yellow	Grale Scientific	SF41299
FLEX IHC Microscope Slides	DAKO	K802021-2
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG	Life Technologies	A11037	1:500
Normal goat serum	Life Technologies	PCN5000	10% serum/0.1% Triton X-100/PBS
Non-Standard Solution Preparation for Special Stains 1% Aqueous Cresyl Violet Stock Solution Cresyl violet 1 g Distilled water 100 ml Cresyl Violet Acetate Working Solution 1% aqueous cresyl violet stock solution 9 ml Distilled water 51 ml 10% acetic acid 0.5 ml Biebrich Scarlet-Acid Fuchsin Solution 1% Beihrich scarlet 90 ml 1% acid fuchsin 10 ml Glacial acetic acid 1 ml Phosphomolybdic-Phosphtungstic Acid Solution Phosphomolybdic acid 2.5 g Phosphotungstic acid 2.5 g Distilled water 100 ml Aniline Blue Solution Aniline blue 2.5 g Glacial acetic acid 2 g Distilled water 100 ml Solutions for Immunohistochemistry Wash Buffer Solution 0.1% Triton X-100 in Phosphate buffered saline (PBS) Serum Block Solution 10% normal goat serum/0.1% Triton X-100 in PBS SUPPLEMENTARY MATERIAL Luxol Fast Blue The purpose of performing a Luxol Fast Blue (LFB) stain was to identify the ganglion cells in the ganglion cell layer through the counterstain of cresyl violet. While LFB stains myelin, the cresyl violet stain binds to the Nissl substances in neurons, composed of rough endoplasmic reticulum and ribosomes. Numerous cells in the retina contain Nissl substance including amacrine cells. These cells usually are located in the inner boundary layer of the inner nuclear layer, but displaced amacrine cells can be found in the ganglion cell layer. The staining of Nissl substance is helpful in differentiating large, heavily stained ganglion cells from smaller displaced amacrine cells. To aid visualisation of these cells, we modified the cresyl violet working solution protocol by increasing the volume of the cresyl violet stock solution in the working solution. We increased the volume in 1.0 ml increments from 6.0 ml to 9.0 ml, in turn reducing the volume of distilled water. Assessing the ease of visualising and identifying the ganglion cells, optimal staining was achieved with 9 ml of additional cresyl violet stock solution and 51 ml of distilled water. Cresyl violet is a basic dye, though to dye the Nissl substance, it is required to be used in an acidic solution, and therefore the volume of acetic acid remained unchanged at 0.5 ml. Periodic Acid Schiff The Periodic Acid Schiff (PAS) stain was performed to highlight polysaccharides especially glycogen, found in basement membranes and fungal cell walls, indicating a fungal infection. The process of the PAS stain is to oxidise the hydroxyl groups in polysaccharides using periodic acid, producing aldehyde groups. The application of the Schiff reagent, binds to the aldehyde groups producing a magenta color with haematoxylin counterstaining producing purple cell nuclei. Our slides showed weak staining at the inner limiting membrane. This may be due to the polysaccharides present, as not all polysaccharides can be oxidised with a standard time frame, especially those containing anionic polysaccharides. We therefore increased the duration of the oxidation step from 10 min to 12, 15, and 20 min. We found that a 15 min oxidation step was most effective in PAS staining. Masson’s Trichrome Blue The principle of the Masson's trichrome blue stain is to stain collagen and muscle, which in our retinal slides can be used to indicate an increase in collagen tissue which may indicate fibrosis due to injury. This stain is sensitive to fixation techniques, so alterations were needed to obtain optimal staining. The process of this stain is to initially stain cytoplasm and muscle fibres red using the acidic Biebrich scarlet-acid fuchsin red dye. Differentiation with phosphomolybdic/phosphotungstic acid competes with the red dye in the collagen fibres. In the sclera, the large phosphomolybdic/phosphotungstic acid molecules are able to penetrate the loose connective tissue, as opposed to the dense muscle fibres which are penetrable to small molecules only. Aniline blue dye is then applied to replace the acid in the collagen fibres producing blue dyed sclera. To optimise this stain in retinal sections, the duration of staining with Biebrich scarlet-acid fuchsin dye was reduced to create a balance between the blue and the red dye. The use of Davidson's fixative also required an extended differentiation time to remove the red dye from the collagen. We trialled differentiation at 5, 6, 8, and 10 min, with optimal results occurring at 6 min. Differentiation also varies on the thickness and cutting of smooth sections, with greater than 6 min differentiation possibly being required. Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Antibody Polyclonal, host species is rabbit, has a molecular weight of 50 kDa. GFAP antigen is an intermediate filament found in the cytoplasm (the cytoplasm of astrocytes and Müller cells in the retina), the antigen is made form 428 amino acids and has a molecular weight of 49512 Da. Neurofilament-200 antibody Monoclonal, host species is mouse, clone N52, isotype IgG1, it recognises phosphorylated and non-phosphorylated forms of the heavy neurofilaments which have a molecular weight of 200 kDa. The antibody will bind to an epitope in the tail domain of the neurofilament. The antibody will stain neurofilaments in the neuronal perikarya, dendrites and axons. Glutamine Synthetase (GS) antibody Monoclonal, clone GS-6, host species is mouse, has a molecular weight of 45 kDa and antibody isotype IgG2a. The GS antigen is found in the cell cytoplasm (cytoplasm of Müller cells in the retina), the antigen has 373 amino acids and a molecular weight of 42,064 Da.