Metoder för hantering Eyes implanterade med en näthinnan protes för lokaliserad Histopatologisk analys

Summary

Tekniker för att visualisera näthinnan cytoarchitecture direkt anslutning till enskilda elektroder inom en retinal stimulator.

Abstract

Med den senaste utvecklingen av retinal proteser, är det viktigt att utveckla tillförlitliga metoder för att bedöma säkerheten av dessa apparater i prekliniska studier. Men standarden fixering, förberedelser, och automatiserade rutiner histologi är inte idealisk. Här beskriver vi nya rutiner för utvärdering av vård av näthinnan i direkt anslutning till ett implantat. Retinal proteser har elektrodfält i kontakt med ögat vävnad. Tidigare metoder har inte kunnat att rumsligt lokalisera den okulära vävnaden intill individuella elektroderna inom arrayen. Dessutom resulterar standard histologisk bearbetning ofta i grov artefaktuella avskiljandet av retinaskikt vid bedömning implanterade ögon. Följaktligen har det varit svårt att bedöma lokala skador, om närvarande, som orsakas av implantation och stimulering av en implanterad elektrod array. Därför utvecklade vi en metod för att identifiera och lokalisera den okulära vävnaden intill implanterad electrodes använder en (färgkodade) färgämne märkning system, och vi ändrat ett teknik ögonfixation att minimera artefaktuella näthinneavlossning. Denna metod gjorde också sklera genomskinlig, vilket möjliggör lokalisering av enskilda elektroder och specifika delar av ett implantat. Slutligen använde vi en matchad kontrollgrupp för att öka kraften i de histopatologiska bedömningar. Sammanfattningsvis tillåter denna metod pålitlig och effektiv diskriminering och bedömning av den retinal cytoarchitecture i ett implanterat öga.

Introduction

Retinal proteser kan snart bli användbara kliniska interventioner för att behandla olika former av svår synnedsättning. Vissa villkor, såsom retinitis pigmentosa (RP), resulterar i utbredd degeneration av fotoreceptorer i ögat, som är de celler som ansvarar för att omvandla ljus till neurala signaler. Men vissa celler i andra skikt i näthinnan kvarstår och är potentiella mål för elektrisk stimulering med en retinal protes ^1. Tidiga resultat från kliniska prövningar har varit lovande för elektrodfält implanteras i epiretinal ^2,3, subretinal ^4,5 och intrascleral ⁶ platser. Dessa anordningar är gjorda av olika material med olika former, men använder sig alla elektriska pulser för att aktivera de återstående viabla neuroner i näthinnan för att skapa visuella percepts.

Vår större grupp (Bionic Vision Australien) har utvecklat en retinal implantat som har successivtsed att en klinisk pilotstudie med 3 RP patienter implanterade med suprakoroidala elektrodanordningar (Clinical Trial Number: NCT01603576). Figur 1A visar denna suprakoroidala prototyp retinal protes.

Patientsäkerheten är av största vikt i kliniska studier och därmed, innan försök på människa, utförde vi omfattande akut och kronisk testning i prekliniska modeller (Figur 1B). Histopatologiska bedömningar var nödvändiga för att förfina kirurgiska ingrepp, iterera genom elektroden konstruktion, och slutligen fastställa implantatets säkerhet. För att upprätthålla ett effektivt arbetsflöde samordnas med vanliga kliniska patologi övar, var en paraffininbäddning teknik som används. Det var också önskvärt att utnyttja färgningsförfaranden jämförbara med kliniska normer, såsom hematoxylin och eosin (H & E), som lätt tolkas av patologer. Vi ville också ha en teknik som kunde anpassas för immunhistokemisk analys, iför att underlätta ytterligare cellulär utvärdering av vävnaderna.

Biokompatibiliteten av implantatet material, och säkerheten av kronisk elektrisk stimulering, måste bedömas noggrant. Det är viktigt att kunna undersöka histopatologi av den okulära vävnaden intill de individuella stimulerande elektroder inom arrayen. Emellertid arrayema ​​behövde avlägsnas före bearbeta prover så att de kan testas, och eftersom deras metalliska komponenter inte kunde vara lätt sektioneras. Följaktligen gjorde vår etablerade vävnad förberedelse tillåter inte lokalisering och kartläggning av vävnad med avseende på de implanterade elektroderna ^7. Förutom avsaknaden av en vävnadslokalisering metod resulterade standard formaldehyd-baserade fixering och bearbetningstekniker till omfattande artefakter och avlossning av näthinnan på grund av olika krympning av de olika skikten i ögat (fig. 2). På grund av den icke-homogenitet hos than näthinnan, var det svårt att göra meningsfulla jämförelser med kontroll vävnad, särskilt för kvantitativa mätningar. Dessa kombinerade begränsningar komplicerade korrekta bedömningar av de potentiella skador som orsakats av våra implanterade arrayer.

Här presenterar vi nya tekniker för att övervinna dessa begränsningar. Vi har modifierat specialiserade ögonfixation och bearbetning tekniker ^8-10 för att bibehålla kompatibilitet med paraffin-baserad histologi. Vi har modifierat vanliga histologiska och immunohistochemical fläckar att ge jämförbara resultat, baseras på feedback från kliniska patologer. Efter gör det senhinnan genomskinliga, var en dye-baserade färg-kod används för att markera den okulära vävnaden intill varje enskild elektrod, innan du tar bort arrayen från suprakoroidala rymden. Genom att markera elektroduppsättningen och enskilda webbplatser elektrod, kan proverna noggrant in från elektroden angränsande regioner. Matchade prov kan hämtas från the kontroll ögat för att underlätta parvisa jämförelser.

Protocol

Ett. Enucleation and Post-Fixering

Detta protokoll förutsätter att motivet har implanterat ensidigt med en suprakoroidala elektrodbäraren.

1. Förbered postfix lösningar i glas Schott flaskor.
   1. Davidsons fixativ lösning, 2x 100 ml
      • 2 ml formalin (37% formaldehyd)
      • 10 ml isättika (99,7%)
      • 35 ml etanol (98%)
      • 53 ml destillerat vatten
   2. 50% etanol, 2x 100 ml
   3. 70% etanol, 2x 100 ml
2. Transcardially BEGJUTA föremål med varmt (37 ° C) hepariniserad saltlösning följt av kall (4 ° C) neutral buffrad formalin (10%).
3. Knyt suturer vid överlägsna limbus (eller en plats som är avlägsen från suprakoroidala array) i båda ögonen - i linje med en rektusmuskeln, att fungera som ett landmärke.
4. Enucleate ögon, bevara några externa ledningar från den implanterade ögat.
5. Placera EACh öga i 100 ml Davidsons fixativ lösning och låt efter positionsbestämningen vid rumstemperatur.
6. Efter 18 - 36 tim i Davidsons fixativ, överföra till 50% etanol (rumstemperatur) i 6 - 8 timmar, sedan slutligen till 70% etanol (rumstemperatur).
7. Refrigerate prover vid 4 ° C och lagra tills dissekering.

Intakt och trycksatt ögon glober har lagrats på detta sätt i upp till 3 månader utan att negativt påverka den resulterande histologi.

2. Identifiering och Tissue Mapping

Ovanstående fixering protokoll (steg 1) har gjort sklera genomskinliga och matrisen är nu synliga - inklusive de individuella elektrodställena (Figur 3).

1. Ta den implanterade jordklotet från etanol och försiktigt klippa bort överflödig vävnad, inklusive konjunktiva och Tenons kapsel. Trim synnerven till en 2 - 3 mm längd (figur 3A).
2. Använda en histologisk färgämne Marking ordningen, etikett elektroderna med en fördefinierad färgkod, noga med att inte sudda färgen.

• Vi valde en kommersiellt tillgänglig svit av specialiserade histologisk färgämne (se bilaga). Små mängder av färgämnet var omsorgsfullt applicerad med en fin spets pensel (Roymac storlek 00) till vävnaden och fick lufttorka under upp till 5 min.
• För våra syften har vi valt: grönt för den aktiva elektroden (s) som var (var) stimuleras maximalt, på suprathreshold nivåer, för varaktigheten av studien, rött för andra aktiva elektroder, gult för de större elektroder diameter återvändande, och blå för ytterligare guider och / eller anatomiska markeringar avstånd (figurerna 3B och 3C).
• Några försök och misstag kan krävas för att hitta ett färgämne som är stabil under de följande stegen. Till exempel i figur 4, kan det ses att det gröna färgämnet var mer motståndskraftig än det röda färgämnet. Utspädning av färgämnet i 70% etanol bidrar till att förbättra lipid Penetranson och vävnad beläggning.
• Det är nyttigt att skissa eller fotografera färgade klot för framtida referens.

3. Återgå till 70% etanol för att dehydratisera färgämnet.
4. Upprepa steg 2.1 för unimplanted kontroll jordklotet.
5. Använda suturer från steg 1.3, rikta kontrollen ögat och den implanterade ögat som en speglad par.
6. Placera en silikon mall (med samma dimensioner som elektroduppsättningen) i den speglade platsen på kontrollögat när implantatet ligger på implanterad ögat (NB det genomskinliga sklera och färgämnet markeringarna från steg 2,2 tillåta klar visualisering av den implanterade matrisposition ).
7. Utför stegen 2.2 och 2.3 för kontroll ögat, så att varje implanterad elektrod webbplats har en kontroll pair i en anatomiskt jämförbara (dvs. spegel matchad motsvarande) läge.

Tre. Dissection och inbäddning

1. Avlägsna implantatet arrayen från ögat och ta bort den främre delen av ögat(Inklusive hornhinnan, iris och lins). Avlägsna den glasartade vätskan från den återstående ögonkoppen (bakre kammaren).
2. Dissekera implanterade ögat i flera representativa remsor (~ 2 mm tjocklek) som vardera innehåller en delmängd av de markerade dye regionerna (Figur 3D). Observera att orienteringen av remsorna bör väljas för att bistå vid bedömningen av olika aspekter av den vävnad svar på implantatet ^7.

Det är nyttigt, för framtida referens, för att göra ett register över vilka preparat regioner är närvarande på varje remsa och deras relativa lägen (och färger).

3. Placera remsan på sin sida i en grund pool av flytande agar (4%, från 80 till 90 ° C) med den sida som ska skäras först vänd nedåt (figur 3E).
4. När agar har satt, skär runt provet och placera i en vävnad kassett stöds av skuminlägg (Fig. 3F).
5. Upprepa steg 3,1-3,3 för kontroll ögat - TakIng omsorg att dissekera spegel-matchade remsor.
6. Bearbeta alla kassetter via standard (automatisk över natten) paraffin behandlingsteknik.
7. Bädda bearbetas vävnad i paraffin med den sida som ska skäras först nedåt.

4. Kapning och färgning

1. Skär paraffinblock till 5 ìm sektioner hänvisar regelbundet till tonerna från steg 2 och 3.
2. Samla sektioner från vardera av de färgade områdena och montera på diabilder.

Regionen omedelbart intill varje färgad fläck på sklera kan nu bedömas med tillförsikt att det var närmast närhet till motsvarande elektrod i array (Figur 4).

3. Stain eller utföra immunofluorescens och returresa. Exempel fläckar och immunohistokemi visas i fig 5 är: H &E; Luxol snabb blå (LFB), kresylviolett; Massons trikrom blått; perjodsyra Schiff (PAS), Perls 'berlinerblått STAin, anti-glutaminsyntetas (GS), anti-neurofilamentprotein (NF), anti-gliafibrillärt surt protein (GFAP) och 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
4. Standard-och special fläckar utfördes så detaljerat:
   1. H & E-färgning utfördes enligt protokollet tillhandahållet av Leica multistainer bad array ST5020 (Leica Biosystems).
   2. LFB och kresylviolett (modifierad från ^11):
      1. Dewax i 3 byten av xylen (3x 2 min) och två byten av etanol (100%, 100%) (2x 1 min) och skölj i kranvatten (45 sek).
      2. Hydrate sektioner till 95% etanol.
      3. Placera i LFB lösning ¹¹ vid 37 till 42 ° C (över natten).
      4. Skölj bort överflödig färg med 70% etanol.
      5. Skölj i destillerat vatten.
      6. Placera i utspädd litiumkarbonat (8%) (några sekunder).
      7. Differentiera i 70% etanol (några sekunder).
      8. Skölj i destillerat vatten.
      9. Upprepa steg 4.4.2.6 till 4.4.2.8, om nödvändigt, tills background är färglös.
      10. Placera i kresylviolett acetat arbetslösning vid 37 ° C (10 min).
      11. Tvätta inte i vatten.
      12. Torka i 3 byten av absolut alkohol (1x 30 sek, 2x 20 sek) och 3 byten av xylen (1x 1 min 30 sek, 2x 1 min).
      13. Montera och täckglas med DPX.
   3. Masson trikrom blue (modifierad från ^11):
      1. Dewax enligt 4.4.2.1.
      2. Ta med avsnitt till vatten (2 min).
      3. Fläck kärnorna med Weigerts järn haematoxylin (2 min).
      4. Tvätta i rinnande vatten, skölj i destillerat vatten.
      5. Stain i Biebrich scarlet-syrafuxin lösning (5 min).
      6. Skölj i destillerat vatten.
      7. Differentiera in fosfomolybdensyra-fosforvolframsyra tills kollagen är ljusrosa (6 min).
      8. Skölj i destillerat vatten.
      9. Motfärga i anilinblått (1 min).
      10. Tvätta väl i 1% ättiksyra (1 min).
      11. Torka, montera och täckglas som per 4.4.2.12 och 4.4.2.13.
   4. PAS (modifierad från ^11):
      1. Dewax enligt 4.4.2.1.
      2. Oxidera i 1% perjodsyra (15 min).
      3. Tvätta i rinnande vatten och därefter destillerat vatten.
      4. Stain i Schiffs reagens (15 min).
      5. Tvätta i vatten (5 min).
      6. Motfärga med Harris hematoxylin (1 min).
      7. Tvätta snabbt i kranvatten.
      8. Differentiera i 0,5% sur alkohol (1 doppning).
      9. Skölj väl i kranvatten.
      10. Blue i Scotts kranvatten (1 min).
      11. Tvätta väl i vatten.
      12. Torka, montera och täckglas enligt 4.4.2.12 och 4.4.2.13.
   5. Perls 'berlinerblått fläck såsom beskrivs i ^11.
5. Immunofluorescensfärgning utfördes så detaljerat:
   1. Dewax enligt 4.4.2.1.
   2. Skölj i destillerat vatten (2x 5 min).
   3. Utför antigenåtervinning användning av 0,01% citrat-buffert, pH 6 vid 75 till 80 ° C (20 min) end låt svalna i 0,01% citratbuffertlösning (20 min).
   4. Tvätta avsnitt i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) (2x 5 min).
   5. Permeabilize cellmembranet i tvättbuffertlösning (10 min).
   6. Inkubera i serum blocklösning (2 h).
   7. Inkubera avsnitt i en enda primär antikropp utspädd i antikroppsspädning (10% normal get serum/0.1% Triton X-100/PBS) (över natten i kylskåp). Titern av varje använd primär antikropp visas i tabell 1.
   8. Efter inkubation över natten, tvätta sektioner i tvättbuffertlösning (5x 3 min). Från denna punkt, hålla sektioner i mörkret.
   9. Inkubera avsnitt i motsvarande sekundär antikropp vid en titer på 1:500 för en viss tid (se tabell 1 för detaljer).
   10. Tvätta avsnitt i tvättbuffertlösning (3x 5 min).
   11. Inkubera avsnitt i DAPI (1:25,000 / PBS) (30 min).
   12. Tvätta avsnitt i tvättbuffertlösning (3x 5 min).
   13. Mount och täckglas med fluorescerarnt montering media.

Prov och kontrollprover är redo för parvisa jämförelsen.

Representative Results

Figur 4 visar en representativ sektion erhållits vid styckning provet visas i fig. 3. Avsnittet skars vid 5 ^ m tjocklek och färgades med H & E i enlighet med de protokoll som beskrivs ovan. Den brutto formen av provet remsan är bevarad med minimala artefakter differentiella vävnad (Figur 4A). Både färg markeringar var synliga på sklera, även om det gröna färgämnet var mer motståndskraftig än den röda (Figur 4B). De retinaskikt inte artifactually loss och näthinnans morfologi bevaras (Figur 4C). Den näthinnevävnad intill färgämnet märkningar, vilket motsvarar placeringen av elektroderna i uppsättningen, kan lätt identifieras.

Figur 5 visar representativa speciella färgning och immunohistokemi av vävnadssnitt framställdes enligt det nuvarande protokollet. Se Figur 5 caption och kompletterande material för mer information om de specifika fläckar och de ändringar som gjorts till deras användning. Post-modifiering, dessa fläckar och immunohistokemi var likvärdiga med etablerade standarder - som kontrolleras av patologer.

Typ av primär antikropp och titer (inom parentes)	GFAP (1:1500)	NF200 (1:100)	GS (1:100)
Typ av sekundär antikropp och titer (inom parentes)	Alexa Fluor 594	Alexa Fluor 488	Alexa Fluor 488
Varaktighet för inkubation av sekundär antikropp	1 hr	2 tim	45 min

Tabell 1. Antikropp Type, Titre och varaktighet märkning.

Figur 1. Suprachoroidal Prototype elektrodgrupp. A) Macro fotografi av en klinisk kvalitet gjuten array. B) Photomicrograph av en handgjord preklinisk array.

Figur 2. Fd Retinal Histologi. Standard histologiska metoder användes för att framställa dessa, H & E färgade, sektioner av ett öga implanteras med en suprakoroidala elektrodbäraren. A) En ortogonal sektion genom elektroduppsättningen hålighet (visat med en stjärna). Näthinnan är avskild från den yttre ögonvävnaden. Detta är särskilt tydligt under det implanterade området (pil). Det är omöjligt att avgöra vilken del av näthinnan var intill varje enskild elektrod i matrisen. Scalebar = 1 mm. B) En högre förstoring av den inramade regionen i panel A. Det finns flera, regelbundet åtskilda, artefakter i retinal layers (pilar), samt stora lossnar från tapetal skiktet (det reflekterande skiktet i kattdjur ögon). Scalebar = 100 nm. C) En högre förstoring av den inramade området i panel B. Arrow indikerade de yttre segment av fotoreceptorerna, liksom den PIGMENTALSTRANDE epitelet, som förblir intakt, vilket tyder på att avskiljandet var en artefaktuella bieffekt av behandlingen, i motsats till att orsakas av en in vivo-trauma eller patologi. Scalebar = 20 | im.

Figur 3. Lokalisering och Dissektion av elektrod-intilliggande vävnad. AD) High Dynamic Range makro fotografier av en enukleerat öga, med en suprakoroidala elektrodgrupp in situ. A) Post fixeras med Davidsons fixativ, och innan array bort, gör det genomskinliga sklera visualisering avde enskilda elektroderna i uppsättningen (enda exempel indikeras med pilen). B) Elektroderna är markerade med en fördefinierad färg färg. C) Dye markeringar med jämna mellanrum från anatomiska landmärken används för att upprätthålla överensstämmelse mellan experiment.) D Vid avlägsnande av arrayen, ögat dissekeras för hand i provremsor. Färgade pilar indikerar två av elektroden angränsande platser på sklera. Gul streckad linje anger plan sektionering. E) Macro-fotografi av provremsan inbäddad i en agar blocket. F) Macro fotografi av agar-inbäddade prov remsa från Panel E, klippa ut och placerades i en inbäddning kassett stöds av skum biopsi kuddar för att minimera rörelse av sektionen under bearbetning.

Figur 4. Ny Retinal histologi. trong> Ovanstående prov remsa (från figur 3D), innehållande elektroden fickan, var paraffininbäddad, snittades vid 5 pm och färgades med H & E. A) Gröna och röda färgade regioner (indikeras med pilar, samma som figur 3D) är synliga i ett snitt taget på nivån för den streckade gula linjen i fig. 3D. Skala bar = 1,000 nm. Näthinnan är inte fristående, varken under array ficka eller på distans. B) Den inramade området från Panel A med synlig röd och grön färg anges med pilar, och intakta näthinnan hela. Skala bar = 500 nm. C) Den inramade region från Panel B, visar intakta, bifogade, retina intill den gröna färgen. Skala bar = 50 pm. Att veta att placeringen av färgämnet anger positionen för en elektrod, kan vi med tillförsikt bedöma intilliggande näthinnevävnad för skador, om någon, som orsakas av elektrisk stimulering.

ve_content "fo: keep-together.within-sida =" alltid ">
Figur 5. Exempel på modifierade retinal cytohistochemistry med speciella fläckar och immunofluorescens. Användningen av Davidsons fixativ, i motsats till vanliga formalin fixering tekniker, krävs förändringar av de vanliga färgning protokoll, vilket beskrivs i det huvudsakliga protokollet text. Patologer har bekräftat att dessa ändringar ledde till likvärdig färgning. A) H &E; haematoxylin fläckar cellkärnor lila medan eosin fläckar cellcytoplasma, kollagen och stödjevävnad olika nyanser av rosa. B) LFB fläckar myelin blå medan kresylviolett motfärg kan användas för att . identifiera ganglieceller genom färgning Nissl organ inom perikaryon blå och belyser satellit celler som omger cellerna C) Masson trikrom blå, den Biebrich Scarlet-syrafuxin lösning fläckar muskel fimarna röd, medan anilin blå fläckar kollagenet, i detta fall sklera, blå D) PAS,. glykoprotein komponenter av basalmembranet och bindväv komponenter vävnad färgas lila, medan hematoxylin counterstains cellkärnor purpur E) Perls 'berlinerblått.; på platsen för blödning, producerar bildandet av haemosiderin från nedbrutna röda blodkroppar och frisättning av järnkomplex en lila färg medan tillsats av neutral röd fläck färger lysosomer röd F) GS,. denna signalsubstans enzym som finns i Müller-celler ¹³ (grön ), kan ses som sträcker sig i båda riktningarna med Müller cellkroppama i det inre nukleära lagret och Müller celler endfeet bildar den inre begränsande membranet G) NF-200,. denna tunga kedjan cytoskelettprotein (grön) som finns i cellen soma och processer , antipyridinantikropp med andra neurofilaments att upprätthålla strukturen av nervceller ^14,15. Ganglionceller och deras axoner kan ses i ganglion cellager och nervfiberlagret, medan axoner av horisontella celler belägna vid den yttre gränsen för det inre nukleära lagret i kattdjur näthinnan, lyfts också fram. Motfärgning med DAPI (blå) möjliggör visualisering av retinaskikt H) GFAP;. Detta cytoskelettprotein (röd) frodats i Müller-celler och astrocyter under glios ^16, kan ses kantar lagret nervfibern med Müller celler som bildar tunna förlängningar genom det inre av yttre retinaskikt. Motfärgning med DAPI (blå) möjliggör visualisering av retinaskikt. Skala bar = 50 mikrometer i alla paneler. Den inre näthinnan visas överst i varje bild; den yttre näthinnan visas längst ned i varje bild, med undantag av Panel E, som visar subscleral reaktion.

Discussion

Säkerhetsbedömning av implantatet är en primär fråga för prekliniska studier. Innan en retinal protes kan implanteras i människor är det viktigt att kontrollera att det inte kommer att orsaka någon skada. Detta kräver en bedömning av både implantatets biokompatibilitet ^17-23 samt eventuella skador som kan orsakas av kronisk elektrisk stimulering ^24-26. Erfarenheter av liknande neurala proteser, till exempel cochleaimplantat, ger en inblick i det breda utbudet av stimulans, och fysiska, parametrar som inte orsakar vävnadsskada ^27. Dock har näthinnan olika egenskaper till andra implantationsställen och därför exakta gränser säkerhet (t.ex. maxtaxan densitet) kan inte utgå från tidigare studier i andra system. Laddningstätheter är högst vid den aktiva elektroden platser och detta motsvarar den största risken för skador. Därför är en metod för lokalisering av vävnaden direkt anslutningtill de enskilda aktiva elektroderna skulle kraftigt öka användbarheten av dessa studier. Vävnaden intill specifika regioner av implantatet kan också lyftas fram för närmare granskning. Denna målinriktade metod tillåter färre sektioner som skall analyseras, samtidigt som de behåller förtroendet att "worst case scenario" undersöktes.

Den sklerala färgämne lokalisering här beskrivna metoden har testats med hand-formad och gjuten silikon / Pt arrayer elektrod ^28-30. Det har använts med tunnfilms-polyamid arrayer ^7,31 och även tunnfilms-silikon / Pt arrayer ^32. Vissa retinal protes studier anställd "bullet formade" elektroder med intrascleral inplantera ^33. Föreliggande teknik bör vara effektiva för att bedöma denna typ av elektrodgrupperna. Feline ögon med tunna sklera (tjocklek vid bakre stolpen 90 - 200 um) tillät visualisering av enskilda elektroder i en array. Men, även om enskilda elektrodes inte syntes, deras positioner lätt kan utläsas med hjälp av en silikon mall när konturen av arrayen kan ses (liknande den som användes i steg 2.6).

Färgämnet kartläggning begränsar behovet att få icke-relevanta vävnadssnitt som endast delar med dyegåvan erhålles. Förmågan att exakt härleda elektrod ställning inte bara tillåter relevanta histopatologisk analys och större statistisk, men har en stor inverkan på tid och kostnadskontroll genom att minska mängden av diabilder och blad används samt kostnaden för arbetskraft. Användningen av färgämne som är vidhäftande och tål vävnadsbehandling samtidigt också vara synlig i ofärgade vävnadssnitt är ett viktigt första övervägande. Kännedom om placering av färgämnet och orienteringen av vävnaden vid dissekering och under inbäddning bistår styckningen. Detta inkluderar korrekt orientering av blocket för att uppnå ett avsnitt som inte är snett skuren och ger en fullständig representatipå av vävnaden. Det är därför viktigt att den person som utför styckning är närvarande vid tidpunkten för färgämnet ansökan, dissektion och inbäddning.

Det övergripande protokollet är robust mot mindre ändringar, särskilt med fixering timings. Men ögat dissektion och färgämnet märkning stegen är komplicerade förfaranden som gynnas av god fingerfärdighet för att undvika skador på provet. Medan Davidsons fixativ har visat sig vara effektiv för att minska artefaktuella avlossning av näthinnan nära ett implantat, hindrar det inte direkta mekaniska skador under dissekering. Davidsons fixativ var inte lätt kan förenas med vissa särskilda histologiska och immunohistokemiska procedurer. Därför fanns det ett behov av att ändra / optimera dessa steg enligt ovan. Stegvisa förändringar i färgning tider och koncentrationer gjordes förrän den optimala resultatet uppnåddes - för mer information, hänvisas till kompletterande material.

Kvantifiering av retinalhistologi fortfarande problematiskt. Näthinnan är icke-homogen och både tjocklek och celltätheten förändras med ökande avstånd från området centralis ^34,35. Därför kan angränsande vävnad inom den implanterade ögat inte användas för jämförelser och en kontroll öga används i stället. Parvis matchning av varje avsnitt med kontroll ögat ger oss en mer kraftfull statistisk jämförelse av patologiska förändringar, effekt och säkerhet utfall med retinal protetik är bättre bedömas när man jämför de andra ögon i ett ämne ^36. Särskild försiktighet måste vidtas för att minimera sned skärning, eftersom detta skulle påverka kvantifiering.

Sammanfattningsvis beskrivs metoderna ovan har avsevärt förbättrat vår histopatologisk analys, vilket i sin tur har lett till en mer effektiv preklinisk arbetsflöde. Resultat från prekliniska studier med dessa metoder ledde direkt till en klinisk prövning i vilken 3 RP patienter har säkert implanteras med suprachoroidal retinala proteser. Dessa metoder är relevanta både för retinal stimulatorer och andra implantat okulära där det patologiska svaret på lång sikt implantation måste utvärderas. Denna metod som värdefulla fördelar för att upprätthålla cytoarchitecture och registrering av patologin till områden av intresse på implantatet. Även om inte specifikt testat, kan en ändring av dessa förfaranden användas i andra arter och andra anatomiska platser, särskilt när en matris implanteras ytligt.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
The Davidson marking system	Bradley Products	1163-4 - red 1163-5 - blue 1163-2 - yellow 1163-1- green
Rabbit Polyclonal Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody	Millipore	AB5804	1:1500, overnight incubation
Mouse Monoclonal Anti-Glutamine Synthetase Antibody	Millipore	MAB302	1:100 overnight incubation
Monoclonal Mouse Anti-Neurofilament 200 Antibody	Sigma-Aldrich	N0142	1:100 overnight incubation
4',6-diamindino-2-phenylindole, dilactate (dilactate)	Life Technologies	D3571	1:25,000 30 min incubation
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG	Life Technologies	A11029	1:500
Superfrost 90° yellow	Grale Scientific	SF41299
FLEX IHC Microscope Slides	DAKO	K802021-2
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG	Life Technologies	A11037	1:500
Normal goat serum	Life Technologies	PCN5000	10% serum/0.1% Triton X-100/PBS
Non-Standard Solution Preparation for Special Stains 1% Aqueous Cresyl Violet Stock Solution Cresyl violet 1 g Distilled water 100 ml Cresyl Violet Acetate Working Solution 1% aqueous cresyl violet stock solution 9 ml Distilled water 51 ml 10% acetic acid 0.5 ml Biebrich Scarlet-Acid Fuchsin Solution 1% Beihrich scarlet 90 ml 1% acid fuchsin 10 ml Glacial acetic acid 1 ml Phosphomolybdic-Phosphtungstic Acid Solution Phosphomolybdic acid 2.5 g Phosphotungstic acid 2.5 g Distilled water 100 ml Aniline Blue Solution Aniline blue 2.5 g Glacial acetic acid 2 g Distilled water 100 ml Solutions for Immunohistochemistry Wash Buffer Solution 0.1% Triton X-100 in Phosphate buffered saline (PBS) Serum Block Solution 10% normal goat serum/0.1% Triton X-100 in PBS SUPPLEMENTARY MATERIAL Luxol Fast Blue The purpose of performing a Luxol Fast Blue (LFB) stain was to identify the ganglion cells in the ganglion cell layer through the counterstain of cresyl violet. While LFB stains myelin, the cresyl violet stain binds to the Nissl substances in neurons, composed of rough endoplasmic reticulum and ribosomes. Numerous cells in the retina contain Nissl substance including amacrine cells. These cells usually are located in the inner boundary layer of the inner nuclear layer, but displaced amacrine cells can be found in the ganglion cell layer. The staining of Nissl substance is helpful in differentiating large, heavily stained ganglion cells from smaller displaced amacrine cells. To aid visualisation of these cells, we modified the cresyl violet working solution protocol by increasing the volume of the cresyl violet stock solution in the working solution. We increased the volume in 1.0 ml increments from 6.0 ml to 9.0 ml, in turn reducing the volume of distilled water. Assessing the ease of visualising and identifying the ganglion cells, optimal staining was achieved with 9 ml of additional cresyl violet stock solution and 51 ml of distilled water. Cresyl violet is a basic dye, though to dye the Nissl substance, it is required to be used in an acidic solution, and therefore the volume of acetic acid remained unchanged at 0.5 ml. Periodic Acid Schiff The Periodic Acid Schiff (PAS) stain was performed to highlight polysaccharides especially glycogen, found in basement membranes and fungal cell walls, indicating a fungal infection. The process of the PAS stain is to oxidise the hydroxyl groups in polysaccharides using periodic acid, producing aldehyde groups. The application of the Schiff reagent, binds to the aldehyde groups producing a magenta color with haematoxylin counterstaining producing purple cell nuclei. Our slides showed weak staining at the inner limiting membrane. This may be due to the polysaccharides present, as not all polysaccharides can be oxidised with a standard time frame, especially those containing anionic polysaccharides. We therefore increased the duration of the oxidation step from 10 min to 12, 15, and 20 min. We found that a 15 min oxidation step was most effective in PAS staining. Masson’s Trichrome Blue The principle of the Masson's trichrome blue stain is to stain collagen and muscle, which in our retinal slides can be used to indicate an increase in collagen tissue which may indicate fibrosis due to injury. This stain is sensitive to fixation techniques, so alterations were needed to obtain optimal staining. The process of this stain is to initially stain cytoplasm and muscle fibres red using the acidic Biebrich scarlet-acid fuchsin red dye. Differentiation with phosphomolybdic/phosphotungstic acid competes with the red dye in the collagen fibres. In the sclera, the large phosphomolybdic/phosphotungstic acid molecules are able to penetrate the loose connective tissue, as opposed to the dense muscle fibres which are penetrable to small molecules only. Aniline blue dye is then applied to replace the acid in the collagen fibres producing blue dyed sclera. To optimise this stain in retinal sections, the duration of staining with Biebrich scarlet-acid fuchsin dye was reduced to create a balance between the blue and the red dye. The use of Davidson's fixative also required an extended differentiation time to remove the red dye from the collagen. We trialled differentiation at 5, 6, 8, and 10 min, with optimal results occurring at 6 min. Differentiation also varies on the thickness and cutting of smooth sections, with greater than 6 min differentiation possibly being required. Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Antibody Polyclonal, host species is rabbit, has a molecular weight of 50 kDa. GFAP antigen is an intermediate filament found in the cytoplasm (the cytoplasm of astrocytes and Müller cells in the retina), the antigen is made form 428 amino acids and has a molecular weight of 49512 Da. Neurofilament-200 antibody Monoclonal, host species is mouse, clone N52, isotype IgG1, it recognises phosphorylated and non-phosphorylated forms of the heavy neurofilaments which have a molecular weight of 200 kDa. The antibody will bind to an epitope in the tail domain of the neurofilament. The antibody will stain neurofilaments in the neuronal perikarya, dendrites and axons. Glutamine Synthetase (GS) antibody Monoclonal, clone GS-6, host species is mouse, has a molecular weight of 45 kDa and antibody isotype IgG2a. The GS antigen is found in the cell cytoplasm (cytoplasm of Müller cells in the retina), the antigen has 373 amino acids and a molecular weight of 42,064 Da.