Técnicas de Processamento de Olhos implantados com uma prótese de retina para análise histopatológica localizada

Summary

Técnicas de visualização da retina citoarquitetura diretamente adjacente a eletrodos individuais dentro de um estimulador da retina.

Abstract

Com o recente desenvolvimento das próteses da retina, é importante desenvolver técnicas fiáveis ​​para avaliar a segurança destes dispositivos em estudos pré-clínicos. No entanto, a fixação padrão, para preparação, e os procedimentos automatizados histologia não são ideais. Aqui descrevemos novos procedimentos para avaliar a saúde da retina directamente adjacente a um implante. Próteses de retina possuem matrizes de eletrodos em contato com o tecido ocular. Os métodos anteriores não têm sido capazes de localizar espacialmente o tecido ocular adjacente aos eléctrodos individuais dentro da matriz. Além disso, o processamento histológico padrão muitas vezes resulta em desapego artifactual bruto das camadas da retina quando avaliam os olhos implantados. Consequentemente, tem sido difícil de avaliar os danos localizados, se presente, causado pela implantação e estimulação de uma conjunto de eléctrodos implantados. Por isso, foi desenvolvido um método para a identificação e localização do tecido ocular adjacente ao implante electrodes usando um esquema de marcação corante (código de cores), e modificada uma técnica de fixação dos olhos para minimizar o descolamento de retina artificial. Este método também tornaram a esclera translúcida, permitindo a localização de eletrodos individuais e partes específicas de um implante. Finalmente, foi utilizado um controle pareado para aumentar o poder das avaliações histopatológicas. Em resumo, este método permite a discriminação confiável e eficiente e avaliação da citoarquitetura da retina em um olho implantado.

Introduction

Próteses de retina pode em breve tornar-se intervenções clínicas úteis para o tratamento de várias formas de severa perda de visão. Certas condições, tais como retinite pigmentosa (RP), resultam na degeneração generalizada dos fotorreceptores no olho, que são as células responsáveis ​​pela transdução de luz em sinais neurais. No entanto, algumas células de outras camadas da retina, permanecem e são potenciais alvos para a estimulação eléctrica com uma prótese de retina ^1. Os primeiros resultados de testes clínicos em humanos têm sido promissores para matrizes de eletrodos implantados no epirretiniana ^{2,3, 4,5,} e sub-retiniana intrascleral ^seis localidades. Estes dispositivos são feitos de materiais diferentes, com diferentes formas, mas todos eles usam impulsos eléctricos para activar os neurónios viáveis ​​remanescentes da retina, a fim de criar percepções visuais.

Nosso grupo mais vasto (Bionic Vision Australia) desenvolveu um implante de retina que tem progressed para um estudo clínico piloto com três pacientes RP implantados com matrizes de eletrodos supracoroidal (Número ensaio clínico: NCT01603576). Figura 1A mostra este protótipo suprachoroidal prótese de retina.

A segurança do paciente é fundamental em estudos clínicos e, portanto, antes de iniciar os testes em humanos, foram realizados testes de aguda e crônica extensa em modelos pré-clínicos (Figura 1B). Avaliações histopatológicas foram essenciais para refinar os procedimentos cirúrgicos, percorrer projeto eletrodo e, finalmente, estabelecer a segurança do implante. Para manter um fluxo de trabalho eficiente articulados com as práticas de patologia clínica padrão, uma técnica de inclusão em parafina foi empregado. Também era desejável utilizar procedimentos de coloração comparáveis ​​com os parâmetros clínicos, tais como hematoxilina e eosina (H & E), que são facilmente interpretada pelos patologistas. Nós também queríamos uma técnica que poderia ser adaptado para imunohistoquímica, ema fim de facilitar ainda mais a avaliação celular dos tecidos.

A biocompatibilidade dos materiais de implante, bem como a segurança da estimulação elétrica crônica, precisa ser cuidadosamente avaliada. É importante ser capaz de examinar a histopatologia do tecido ocular adjacente aos eléctrodos estimulantes individuais dentro da matriz. No entanto, as matrizes necessário para ser removida antes do processamento das amostras de modo que podem ser testadas, e porque os seus componentes metálicos não poderia ser facilmente seccionada. Por conseguinte, a preparação de tecido estabelecida não permitem a localização e o mapeamento do tecido em relação aos eléctrodos implantados ^7. Além da falta de um método de localização de tecidos, a fixação à base de formaldeído padrão e técnicas de processamento resultou em artefactos generalizados e descolamento da retina devido à contracção diferencial das diferentes camadas do olho (Figura 2). Devido à não homogeneidade de tele retina, era difícil fazer comparações válidas com o tecido de controle, especialmente para medições quantitativas. Estas limitações combinados complicado avaliações precisas do potencial de danos causados ​​por nossas matrizes implantadas.

Aqui vamos apresentar novas técnicas para superar essas limitações. Temos modificado técnicas de fixação e de processamento especializado olho ^8-10 para manter a compatibilidade com a histologia baseada em parafina. Nós modificamos manchas histológica e imunohistoquímica padrão para dar resultados comparáveis, com base no feedback dos patologistas clínicos. Depois de processar o tecido translúcido escleral, um código de cor à base de corantes foi utilizada para marcar o tecido ocular adjacente a cada um dos eléctrodos individuais, antes de remover a matriz do espaço supracoroidal. Ao marcar o conjunto de eletrodos e os locais de eletrodos individuais, as amostras podem ser coletadas com precisão a partir de regiões adjacentes eletrodos. Amostras pareadas poderiam ser reunidos a partir de diaolho de controlo e, a fim de facilitar as comparações emparelhadas.

Protocol

1. Enucleação e pós-fixação

Este protocolo assume que o assunto foi implantado unilateralmente com um conjunto de eletrodos suprachoroidal.

1. Preparar soluções postfix em garrafas de vidro Schott.
   1. Solução fixadora de Davidson, 2x 100 ml
      • 2 ml de formalina (37% de formaldeído)
      • 10 ml de ácido acético glacial (99,7%)
      • 35 ml de etanol (98%)
      • 53 ml de água destilada
   2. Etanol a 50%, 2x 100 ml
   3. Etanol a 70%, 2x 100 ml
2. Transcardially perfundir sujeito com água morna (37 ° C), seguido por solução salina heparinizada a frio (4 ° C) formalina tamponada neutra (10%).
3. Tie suturas no limbo superior (ou numa localização que é afastada da matriz supracoroídeo) de ambos os olhos - de acordo com um músculo recto, para servir como um ponto de referência.
4. Olhos enuclear, mantendo todas as ligações externas do olho implantado.
5. Coloque each olho em 100 ml de solução de fixador de Davidson e deixar a pós-fixar em temperatura ambiente.
6. Após 18 - 36 h em fixador de Davidson, transferir para etanol a 50% (temperatura ambiente) durante 6-8 horas, em seguida, finalmente, etanol a 70% (temperatura ambiente).
7. Refrigerar as amostras a 4 ° C e armazenar até dissecção.

Globos oculares intactos e pressurizada foram guardados dessa maneira por até 3 meses sem afetar adversamente a histologia resultante.

2. Identificação e Mapeamento de Tissue

O protocolo de fixação acima (passo 1) rendeu o translúcida esclera e da matriz é agora visível - incluindo os locais de eléctrodos individuais (Figura 3).

1. Retire o globo implantado a partir do etanol e aparar cuidadosamente afastado o excesso de tecido, incluindo conjuntiva e cápsula de Tenon. Apare nervo óptico a uma 2-3 mm de comprimento (Figura 3A).
2. Usando um corante histológico marcg esquema, etiqueta dos eletrodos com um código de cor pré-definida, tomando cuidado para não sujar o corante.

• Nós escolhemos uma suíte disponível comercialmente de corante histológico especializado (veja o apêndice). Pequenas quantidades do corante foram cuidadosamente aplicada com um pincel de ponta fina (Roymac tamanho 00) para os tecidos e deixou-se secar ao ar durante até 5 minutos.
• Para os nossos propósitos, nós escolhemos: verde para o eletrodo ativo (s) que foi (foram) estimulado ao máximo, em níveis supralimiares, para a duração do estudo, vermelho para outros eletrodos ativos; amarelo para os eletrodos de retorno de maior diâmetro, e azul para guias adicionais e / ou marcas de distância anatômicas (Figuras 3B e 3C).
• Alguns tentativa e erro poderá ser necessário encontrar um corante que é estável durante os passos subsequentes. Por exemplo, na Figura 4, pode ser visto que o corante verde era mais resistente do que o corante vermelho. A diluição do corante em etanol a 70% ajuda a melhorar penet lípidoração e revestimento de tecido.
• É útil para desenho ou fotografia do mundo tingido para referência futura.

3. Retornar ao etanol a 70% para desidratar o corante.
4. Repita o passo 2.1 para o mundo o controle não implantados.
5. Usando as suturas do passo 1.3, alinhar o olho controle eo olho implantado como um par espelhado.
6. Coloque um molde de silicone (com as mesmas dimensões que a matriz de eléctrodo) na localização espelhado no olho de controlo medida que o implante está localizado no olho implantado (NB a esclera translúcida e as marcações de corantes a partir do passo 2.2 permitir a visualização imediata da posição matriz implantada ).
7. Executar os passos 2.2 e 2.3 para o olho de controlo, de modo que cada local do eléctrodo implantado tem um par de controlo num local anatomicamente comparável (isto é, combinados espelho equivalente).

3. Dissecção e Incorporação

1. Remover o conjunto do implante no olho e remover a parte frontal do olho(Incluindo a córnea, íris e cristalino). Retire o líquido vítreo do olho copo restante (câmara posterior).
2. Dissecar a olho implantado em várias tiras representativas (~ 2 mm de espessura), cada uma contendo um subconjunto das regiões marcadas corante (Figura 3D). Note-se que a orientação das tiras devem ser seleccionadas para ajudar a avaliar os vários aspectos da resposta do tecido ao implante de ^7.

É útil, para referência futura, para fazer um registro de quais regiões corantes estão presentes em cada faixa e as suas posições relativas (e cores).

3. Colocar a tira no seu lado numa piscina rasa de agar liquefeito (4%, 80 - 90 ° C), com o lado a ser cortada primeiro virado para baixo (Figura 3E).
4. Uma vez que o agar estabeleceu, corte ao redor da amostra e colocar em uma fita de tecido suportada por inserções de espuma (Figura 3F).
5. Repita os passos de 3,1-3,3 para o olho controle - takcuidado ing para dissecar espelho pareados tiras.
6. Processar todas as cassetes através de norma técnica (automatizado overnight) o tratamento de parafina.
7. Incorporar tecido processado em parafina com o lado a ser cortado primeiro virado para baixo.

4. Corte e Coloração

1. Cortar blocos de parafina com 5 mm referentes regularmente as notas dos passos 2 e 3.
2. Recolhe secções de cada uma das regiões tingidos e montar em lâminas.

A região imediatamente adjacente a cada ponto tingido de esclerótica podem ser avaliados com a confiança de que era em maior proximidade do eléctrodo correspondente na matriz (Figura 4).

3. Mancha ou executar imunofluorescência como desejado. Exemplo manchas e imunohistoquímica mostrados na Figura 5 são: H &E; Luxol rápido azul (LFB), violeta cresil; tricrômico de Masson azul; ácido periódico de Schiff (PAS); Perls azul da Prússia stana; anti-glutamina sintetase (GS), proteína anti-neurofilamento (NF), anti-proteína acídica fibrilar glial (GFAP) e 4 ',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI).
4. Manchas padrão e especiais foram realizadas conforme detalhado:
   1. H & E coloração foi realizada de acordo com o protocolo fornecido pela Leica Multistainer banho conjunto ST5020 (Leica Biosystems).
   2. LFB e violeta de cresilo (modificado a partir de ^11):
      1. Dewax em 3 mudanças de xileno (3 x 2 minutos) e duas mudanças de etanol (100%, 100%) (2x 1 min) e enxaguados em água da torneira (45 seg.)
      2. Seções hidratar a 95% de etanol.
      3. Coloque em solução LFB ¹¹ a 37-42 ° C (overnight).
      4. Lavar o excesso mancha com etanol 70%.
      5. Enxágüe em água destilada.
      6. Ponto diluído em carbonato de lítio (8%) (alguns segundos).
      7. Diferenciar em etanol a 70% (alguns segundos).
      8. Enxágüe em água destilada.
      9. Repetir os passos para 4.4.2.6 4.4.2.8, se necessário, até background é incolor.
      10. Coloque em solução de acetato de violeta de cresilo a trabalhar a 37 ° C (10 min.)
      11. Não lave em água.
      12. Desidratam em 3 mudanças de álcool absoluto (1 x 30 seg, 20 seg 2x) ​​e 3 mudanças de xileno (1x 1 min 30 seg, 2x 1 min).
      13. Monte e lamela com DPX.
   3. Tricrômico de Masson azul (modificado a partir do ^11):
      1. Dewax conforme 4.4.2.1.
      2. Traga seções para água (2 min).
      3. Stain os núcleos utilizando hematoxilina de ferro de Weigert (2 min.)
      4. Lavar em água corrente, lavar em água destilada.
      5. Mancha em solução de fucsina escarlate ácido Biebrich (5 min).
      6. Enxágüe em água destilada.
      7. Diferenciar em ácido fosfomolíbdico-fosfotungstico até o colágeno é rosa pálido (6 min).
      8. Enxágüe em água destilada.
      9. Contracoloração em azul de anilina (1 min.)
      10. Lavar bem em ácido acético a 1% (1 min.)
      11. Desidratar, montagem e lamela como per 4.4.2.12 e 4.4.2.13.
   4. PAS (modificado a partir de ^11):
      1. Dewax conforme 4.4.2.1.
      2. Oxidar em 1% de ácido periódico (15 min.)
      3. Lavar com água destilada, em seguida.
      4. Mancha em reagente de Schiff (15 min.)
      5. Lavar em água (5 min).
      6. Contracoloração com hematoxilina Harris (1 min.)
      7. Lavar rapidamente em água corrente.
      8. Diferenciar em 0,5% de álcool ácido (1 dip).
      9. Lavar bem em água da torneira.
      10. Azul na água da torneira de Scott (1 min.)
      11. Lavar bem em água.
      12. Desidratar, montagem e lamela conforme 4.4.2.12 e 4.4.2.13.
   5. Perls prussiano mancha azul, tal como descrito em ^11.
5. Imunofluorescência foi realizada como detalhado:
   1. Dewax conforme 4.4.2.1.
   2. Lavar em água destilada (2 x 5 min.)
   3. Executar a recuperação de antigénio utilizando tampão de citrato de 0,01%, um pH de 6 a 75 - 80 ° C (20 min), umad deixar arrefecer em solução tampão de citrato de 0,01% (20 min.)
   4. Lave os cortes em tampão fosfato salino (PBS) (2x 5 min).
   5. Permeabilizar a membrana da célula na solução tampão de lavagem (10 min.)
   6. Incubar em solução de bloqueio de soro (2 h).
   7. Incubar as secções de um único anticorpo primário diluído em diluente de anticorpo (10% de cabra normal serum/0.1% de Triton X-100/PBS) (durante a noite no frigorifico). O título de cada anticorpo primário utilizada é mostrada na Tabela 1.
   8. Após incubação durante a noite, lava secções em solução tampão de lavagem (5x 3 min.) Deste ponto em diante, manter seções no escuro.
   9. Incubar seções do anticorpo secundário correspondente a um título de 1:500 para uma duração específica (ver Tabela 1 para detalhes).
   10. Lavar as secções em solução tampão de lavagem (3 x 5 min).
   11. Incubar as secções em DAPI (1:25.000 / PBS) (30 min.)
   12. Lavar as secções em solução tampão de lavagem (3 x 5 min).
   13. Monte e lamela usando fluorescênciameios de montagem NT.

As amostras de teste e amostras de controle estão prontos para a comparação pareada.

Representative Results

A Figura 4 mostra uma secção representativa proveniente do corte da amostra representada na Figura 3. A secção foi cortado em 5 m de espessura e corados com H & E de acordo com os protocolos descritos acima. A forma grave da tira de amostra é preservada com artefactos do tecido diferenciais mínimas (Figura 4A). Ambas as marcações corante foram visíveis na esclera, embora o corante verde foi mais resiliente do que o vermelho (Figura 4B). As camadas da retina não foram artificialmente destacado e a morfologia da retina é preservado (Figura 4C). O tecido da retina adjacente às marcações de corante, o que corresponde à localização dos eléctrodos na matriz, podem ser prontamente identificados.

A Figura 5 apresenta coloração especial representativo e imuno-histoquímica de secções de tecido preparadas de acordo com o protocolo vigente. Consulte a Figura 5 caption e materiais complementares para obter mais detalhes sobre as manchas específicas e as modificações feitas para o seu uso. Pós-modificação, essas manchas e imunohistoquímica foram equivalentes às normas estabelecidas - como verificado por patologistas.

Tipo de anticorpo primário e título (em parênteses)	GFAP (1:1500)	NF200 (1:100)	GS (1:100)
Tipo de anticorpo secundário e título (em parênteses)	Alexa Fluor 594	Alexa Fluor 488	Alexa Fluor 488
Duração da incubação do anticorpo secundário	1 hr	2 hr	45 min

Tabela 1. Tipo de anticorpos, Titre e duração da rotulagem.

Figura 1. SuprachoroIdal conjunto de eletrodos Prototype. A) fotografia macro de uma matriz moldada grau clínico. B) Fotomicrografia de uma matriz pré-clínicos feitos à mão.

Figura 2. O ex-Histologia da retina. Métodos histológicos padrão foram usadas para preparar estes, H & E manchado, seções de um olho implantado com um conjunto de eletrodos suprachoroidal. A) Uma seção ortogonal através da cavidade conjunto de eletrodos (representado por uma estrela). A retina é separada do tecido ocular externa. Isto é particularmente evidente abaixo da região do implante (seta). É impossível determinar que porção da retina estava adjacente a cada um dos eléctrodos individuais da matriz. Barra de escala = 1 mm. B) A maior ampliação da região em caixa no painel A. Existem vários, regularmente espaçados, artefatos no Laye retinars (setas), assim como um maior distanciamento da camada do tapete (a camada reflectora em olhos felinos). Barra de escala = 100 mm. C) A maior ampliação da região em caixa no painel B. Seta indicou os segmentos exteriores dos fotorreceptores, assim como o epitélio pigmentar, que permanecem intactos, indicando que a separação foi um artefacto efeito colateral do tratamento, em vez de ser causada por um trauma ou in vivo de patologia. Barra de escala = 20 uM.

Figura 3. Localização e dissecção de eletrodo-tecido adjacente. AD) macro fotografias High Dynamic Range de um olho enucleado, com um conjunto de eletrodos suprachoroidal in situ. A) pós-fixados com fixador de Davidson, e antes da remoção da matriz, a esclera translúcido permite a visualização deos eletrodos individuais na matriz (exemplo único indicado com seta). B) Os eletrodos são marcados com uma cor de corante pré-definidos. c) Sinalização de corante em espaçamento regular de marcos anatômicos são usados ​​para manter a consistência entre experimentos. D) Após a remoção do array, o olho é dissecada por mão em tiras de amostra. Setas coloridas indicam dois dos locais adjacentes de eletrodos sobre a esclera. Linha tracejada amarela indica plano de corte. E) Macro-fotografia de faixa de amostra incorporado dentro de um bloco de ágar. F) fotografia Macro da tira amostra agar-embed do Painel E, cortada e colocada em um cassete de incorporação apoiado por almofadas de espuma de biópsia para minimizar o movimento da secção durante o processamento.

Figura 4. Nova Histologia da retina. trong> A tira de amostra de cima (a partir da Figura 3D), contendo o bolso eléctrodo, foi embebido em parafina, seccionados a 5 um e coradas com H & E. A), verde e regiões tintos vermelhos (indicado pelas setas, o mesmo que a Figura 3D) são visíveis nas um corte feito ao nível da linha a tracejado na Figura 3D amarelo. Barra de escala = 1,000 mM. A retina não é individual, nem debaixo do bolso conjunto nem remotamente. B) A região em caixa a partir do Painel A com corante vermelho e verde visível indicado por setas, e retina intacta por toda parte. Barra de escala = 500 mm. C) A região em caixa a partir do Painel B, mostrando a intacto, anexo, retina adjacente ao corante verde. Barra de escala = 50 mm. Sabendo-se que a localização do corante indica a posição de um eléctrodo, que pode avaliar com confiança o tecido da retina adjacente para o dano, caso existam, causada por estimulação eléctrica.

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Figura 5. Exemplos de cytohistochemistry retina modificada utilizando colorações e imunofluorescência. O uso de fixador de Davidson, em oposição a técnicas convencionais de fixação com formalina, necessárias alterações nos protocolos usuais de coloração, tal como descrito no texto principal protocolo. Patologistas confirmaram que estas modificações resultaram na coloração equivalente. D) &E; H hematoxilina manchas púrpura, enquanto os núcleos das células eosina manchas no citoplasma das células, dos tecidos de colagénio e de suporte vários tons de rosa. B) LFB mielina manchas azuis, enquanto a contracorante violeta cresil pode ser usado para . identificar células ganglionares através da coloração corpos de Nissl dentro do azul pericário e destacando as células satélites ao redor das células C) azul tricrômico de Masson, o Biebrich escarlate-fucsina ácida solução manchas muscular fibros vermelha, enquanto as manchas azuis da anilina do colagénio, neste caso, esclera, azul D) de PAS,. componentes da glicoproteína de membrana de base e os componentes do tecido conjuntivo são coradas púrpura, enquanto que a célula de hematoxilina counterstains núcleos roxo E) Perls azul da Prússia.; no local da hemorragia, a formação de hemosiderina degradadas a partir de células vermelhas do sangue e de libertação de complexos de ferro produz uma cor púrpura, enquanto a adição de manchas de cores de vermelho neutro lisossomos vermelho F) GS,. deste neurotransmissor enzima degradante encontrado em células de Müller ¹³ (verde ), pode ser visto que se estende em ambas as direcções, com os corpos celulares Muller, na camada nuclear interna e Müller endfeet celular, formando a membrana limitante interna G) NF-200,. esta cadeia pesada de proteínas do citoesqueleto (verde) encontrada na soma e processos de células , ligações cruzadas com outros neurofilamentos para manter a estrutura de neurónios ^14,15. GânglioAs células e os seus axónios podem ser vistos na camada de células ganglionares e camada de fibras nervosas, enquanto axónios de células horizontais localizadas na fronteira exterior da camada nuclear interna da retina felino, são também realçadas. Contracoloração com DAPI (azul) permite a visualização de camadas da retina H) GFAP,. Esta proteína do citoesqueleto (vermelho) proliferaram em células de Muller e astrócitos durante gliose ^16, pode ser visto que reveste a camada de fibras nervosas com células de Müller formando extensões finas através do interior para camadas externas da retina. Contracoloração com DAPI (azul) permite a visualização das camadas da retina. Barra de escala = 50 mm em todos os painéis. A retina interna é mostrada na parte superior de cada imagem; retina externa é mostrado na parte inferior de cada imagem, excluindo Painel E, que mostra reacção subscleral.

Discussion

Avaliar a segurança do implante é uma consideração primária para estudos pré-clínicos. Antes de uma prótese da retina pode ser implantado em seres humanos, é essencial para verificar que não irá provocar nenhum dano. Isto requer uma avaliação tanto da biocompatibilidade implante ^17-23, bem como os danos potenciais que poderiam ser causados ​​por estimulação eléctrica crónica ^24-26. Experiência com próteses neurais semelhantes, como o implante coclear, fornece insights sobre a ampla gama de estimulação, e, parâmetros físicos que não causam dano tecidual ^27. No entanto, a retina tem características diferentes de outros locais de implantação e os limites de segurança, portanto, precisas (como a densidade de carga máxima) não podem ser assumidos a partir de estudos anteriores em outros sistemas. Densidades de carga são maiores nos locais eletrodo ativo e isso corresponde com o maior potencial de dano. Por conseguinte, um método para localizar o tecido directamente adjacenteaos eléctrodos activos individuais iria aumentar grandemente a utilidade destes estudos. O tecido adjacente a regiões específicas do implante também pode ser destacado para inspecção mais próximo. Esta abordagem orientada permite menos seções a serem analisadas, enquanto a confiança reter que o "pior cenário" foi examinada.

O método de localização corante escleral descrito aqui foi testado extensivamente com a mão em forma de silicone moldado e / PT matrizes de eletrodos ^28-30. Ele tem sido usado com película fina de poliamida matrizes ^{de 7,31} e também de película fina de silicone / PT ³² matrizes. Alguns estudos prótese de retina empregada "bala" em forma de eletrodos com implantes intrascleral ^33. A presente técnica deve ser eficaz para avaliar este tipo de matrizes de eletrodos. Olhos felinos com esclera fino (espessura no pólo posterior 90-200 mm) permitiu a visualização de eletrodos individuais em uma matriz. No entanto, mesmo se electro indivíduodes não eram visíveis, as posições podem ser facilmente inferida usando um molde de silicone quando o contorno da matriz pode ser visto (semelhante ao usado no passo 2.6).

O mapeamento corante limita a necessidade de obtenção de cortes de tecido não-relevantes, apenas seções com o corante presente são obtidos. A capacidade de inferir com precisão a posição do eletrodo não só permite a análise histopatológica relevante e de maior poder estatístico, mas tem um grande impacto no tempo e gestão de custos através da redução da quantidade de lâminas e lâminas utilizados, bem como o custo de mão de obra. O uso do corante que é aderente e podem suportar o processamento do tecido, embora sejam também visível nas secções de tecido não coradas é uma importante consideração inicial. O conhecimento da localização do corante e a orientação do tecido na dissecção e durante a incorporação auxilia o processo de corte. Isto inclui orientar correctamente o bloco para alcançar uma secção que não seja cortada obliquamente e dá um total representatino do tecido. Por conseguinte, é importante que a pessoa que executa o corte está presente no momento da aplicação de corante, a dissecção e a incorporação.

O protocolo geral é robusta para alteração menor, especialmente com tempos de fixação. No entanto, a dissecação do olho e corante passos de marcação são procedimentos delicados que se beneficiam da boa destreza manual para evitar danificar a amostra. Enquanto fixador de Davidson revelou-se eficaz para reduzir desapego artifactual da retina perto de um implante, mas não impede dano mecânico direto, durante a dissecção. Fixador de Davidson não foi prontamente compatível com alguns procedimentos histológicos e imuno-histoquímico especiais. Portanto, houve a necessidade de modificar / otimizar essas etapas, conforme detalhado acima. Mudanças incrementais nos tempos de coloração e as concentrações foram feitas até que o melhor resultado foi alcançado - para mais detalhes, consulte os materiais complementares.

Quantificação da retinahistologia continua a ser problemática. A retina é não homogénea e tanto a espessura e a alteração da densidade de célula com o aumento da distância a partir da área centralis ^34,35. Portanto, o tecido vizinho implantado no interior do olho não pode ser utilizada para comparações e um olho de controlo é empregue em vez disso. Pares correspondentes de cada seção com o olho controle nos dá uma comparação estatística mais poderoso de alterações patológicas, os resultados de eficácia e segurança com próteses de retina são mais bem avaliado quando se comparam os olhos do companheiro em um assunto ^36. Cuidados especiais devem ser tomados para minimizar corte oblíquo como isso afetaria a quantificação.

Em resumo, os métodos descritos acima têm melhorado significativamente a análise histopatológica, que por sua vez conduziu a um fluxo de trabalho pré-clínico mais eficiente. Os resultados dos estudos pré-clínicos utilizando estes métodos conduzido directamente a um ensaio clínico no qual três pacientes de RP foram implantadas de forma segura com suprachoroidal próteses da retina. Estes métodos são relevantes tanto para estimuladores da retina e outros implantes oculares onde a resposta patológica à implantação de longo prazo precisa ser avaliado. Este método forneceu vantagens que valem a pena para a manutenção da citoarquitetura e registro da patologia para regiões de interesse sobre o implante. Embora não seja especificamente ensaiado, uma modificação destes procedimentos podem ser utilizados em outras espécies e outros locais anatómicos, em especial quando uma matriz é implantado superficialmente.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
The Davidson marking system	Bradley Products	1163-4 - red 1163-5 - blue 1163-2 - yellow 1163-1- green
Rabbit Polyclonal Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody	Millipore	AB5804	1:1500, overnight incubation
Mouse Monoclonal Anti-Glutamine Synthetase Antibody	Millipore	MAB302	1:100 overnight incubation
Monoclonal Mouse Anti-Neurofilament 200 Antibody	Sigma-Aldrich	N0142	1:100 overnight incubation
4',6-diamindino-2-phenylindole, dilactate (dilactate)	Life Technologies	D3571	1:25,000 30 min incubation
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG	Life Technologies	A11029	1:500
Superfrost 90° yellow	Grale Scientific	SF41299
FLEX IHC Microscope Slides	DAKO	K802021-2
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG	Life Technologies	A11037	1:500
Normal goat serum	Life Technologies	PCN5000	10% serum/0.1% Triton X-100/PBS
Non-Standard Solution Preparation for Special Stains 1% Aqueous Cresyl Violet Stock Solution Cresyl violet 1 g Distilled water 100 ml Cresyl Violet Acetate Working Solution 1% aqueous cresyl violet stock solution 9 ml Distilled water 51 ml 10% acetic acid 0.5 ml Biebrich Scarlet-Acid Fuchsin Solution 1% Beihrich scarlet 90 ml 1% acid fuchsin 10 ml Glacial acetic acid 1 ml Phosphomolybdic-Phosphtungstic Acid Solution Phosphomolybdic acid 2.5 g Phosphotungstic acid 2.5 g Distilled water 100 ml Aniline Blue Solution Aniline blue 2.5 g Glacial acetic acid 2 g Distilled water 100 ml Solutions for Immunohistochemistry Wash Buffer Solution 0.1% Triton X-100 in Phosphate buffered saline (PBS) Serum Block Solution 10% normal goat serum/0.1% Triton X-100 in PBS SUPPLEMENTARY MATERIAL Luxol Fast Blue The purpose of performing a Luxol Fast Blue (LFB) stain was to identify the ganglion cells in the ganglion cell layer through the counterstain of cresyl violet. While LFB stains myelin, the cresyl violet stain binds to the Nissl substances in neurons, composed of rough endoplasmic reticulum and ribosomes. Numerous cells in the retina contain Nissl substance including amacrine cells. These cells usually are located in the inner boundary layer of the inner nuclear layer, but displaced amacrine cells can be found in the ganglion cell layer. The staining of Nissl substance is helpful in differentiating large, heavily stained ganglion cells from smaller displaced amacrine cells. To aid visualisation of these cells, we modified the cresyl violet working solution protocol by increasing the volume of the cresyl violet stock solution in the working solution. We increased the volume in 1.0 ml increments from 6.0 ml to 9.0 ml, in turn reducing the volume of distilled water. Assessing the ease of visualising and identifying the ganglion cells, optimal staining was achieved with 9 ml of additional cresyl violet stock solution and 51 ml of distilled water. Cresyl violet is a basic dye, though to dye the Nissl substance, it is required to be used in an acidic solution, and therefore the volume of acetic acid remained unchanged at 0.5 ml. Periodic Acid Schiff The Periodic Acid Schiff (PAS) stain was performed to highlight polysaccharides especially glycogen, found in basement membranes and fungal cell walls, indicating a fungal infection. The process of the PAS stain is to oxidise the hydroxyl groups in polysaccharides using periodic acid, producing aldehyde groups. The application of the Schiff reagent, binds to the aldehyde groups producing a magenta color with haematoxylin counterstaining producing purple cell nuclei. Our slides showed weak staining at the inner limiting membrane. This may be due to the polysaccharides present, as not all polysaccharides can be oxidised with a standard time frame, especially those containing anionic polysaccharides. We therefore increased the duration of the oxidation step from 10 min to 12, 15, and 20 min. We found that a 15 min oxidation step was most effective in PAS staining. Masson’s Trichrome Blue The principle of the Masson's trichrome blue stain is to stain collagen and muscle, which in our retinal slides can be used to indicate an increase in collagen tissue which may indicate fibrosis due to injury. This stain is sensitive to fixation techniques, so alterations were needed to obtain optimal staining. The process of this stain is to initially stain cytoplasm and muscle fibres red using the acidic Biebrich scarlet-acid fuchsin red dye. Differentiation with phosphomolybdic/phosphotungstic acid competes with the red dye in the collagen fibres. In the sclera, the large phosphomolybdic/phosphotungstic acid molecules are able to penetrate the loose connective tissue, as opposed to the dense muscle fibres which are penetrable to small molecules only. Aniline blue dye is then applied to replace the acid in the collagen fibres producing blue dyed sclera. To optimise this stain in retinal sections, the duration of staining with Biebrich scarlet-acid fuchsin dye was reduced to create a balance between the blue and the red dye. The use of Davidson's fixative also required an extended differentiation time to remove the red dye from the collagen. We trialled differentiation at 5, 6, 8, and 10 min, with optimal results occurring at 6 min. Differentiation also varies on the thickness and cutting of smooth sections, with greater than 6 min differentiation possibly being required. Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Antibody Polyclonal, host species is rabbit, has a molecular weight of 50 kDa. GFAP antigen is an intermediate filament found in the cytoplasm (the cytoplasm of astrocytes and Müller cells in the retina), the antigen is made form 428 amino acids and has a molecular weight of 49512 Da. Neurofilament-200 antibody Monoclonal, host species is mouse, clone N52, isotype IgG1, it recognises phosphorylated and non-phosphorylated forms of the heavy neurofilaments which have a molecular weight of 200 kDa. The antibody will bind to an epitope in the tail domain of the neurofilament. The antibody will stain neurofilaments in the neuronal perikarya, dendrites and axons. Glutamine Synthetase (GS) antibody Monoclonal, clone GS-6, host species is mouse, has a molecular weight of 45 kDa and antibody isotype IgG2a. The GS antigen is found in the cell cytoplasm (cytoplasm of Müller cells in the retina), the antigen has 373 amino acids and a molecular weight of 42,064 Da.