Technieken voor verwerking Ogen geïmplanteerd met een Retina Prothese voor Gelokaliseerde histopathologisch Analysis

Summary

Technieken voor het visualiseren retinale cytoarchitecture direct aan individuele elektroden binnen een retinale stimulator.

Abstract

Met de recente ontwikkeling van retinale prothesen, is het belangrijk betrouwbare technieken te ontwikkelen om de veiligheid van deze apparaten in preklinische studies. De standaardtechniek fixatie, bereiding en histologie geautomatiseerde procedures zijn niet ideaal. Hier beschrijven we nieuwe procedures voor het evalueren van de gezondheid van het netvlies direct naast een implantaat. Retinale prothesen voorzien elektrodenseries in contact met oogweefsel. Vorige methoden zijn niet in staat om ruimtelijk lokaliseren het oogweefsel grenzend aan de afzonderlijke elektroden binnen de reeks geweest. Bovendien, standaard histologische verwerking resulteert vaak in bruto artefacten loslating van de retina lagen bij de beoordeling geïmplanteerd ogen. Bijgevolg is het moeilijk om gelokaliseerde schade, indien aanwezig, door implantatie en stimulering van een geïmplanteerde elektrode. Daarom hebben we een werkwijze voor het identificeren en lokaliseren van het oogweefsel naast geïmplanteerde e ontwikkeldlectrodes met behulp van een (kleurgecodeerde) kleurstof markering regeling, en we een oogfixatie techniek aangepast aan artefactuele netvliesloslating te minimaliseren. Deze werkwijze ook rendered de sclera doorschijnende, waardoor lokalisatie van individuele elektroden en specifieke delen van een implantaat. Tenslotte gebruikten we een controlegroep om de kracht van de histopathologische evaluatie verhogen. Samengevat, deze methode maakt betrouwbare en efficiënte discriminatie en beoordeling van het netvlies cytoarchitecture in een geïmplanteerde oog.

Introduction

Retinale prothesen kan binnenkort nuttige klinische interventies voor de behandeling van verschillende vormen van ernstige gezichtsverlies. Bepaalde omstandigheden, zoals retinitis pigmentosa (RP), resulteren in wijdverspreide degeneratie van fotoreceptoren in het oog, dit zijn de cellen die verantwoordelijk zijn voor het transduceren van licht in neurale signalen. Sommige cellen in andere lagen van de retina blijven en zijn potentiële doelwitten voor elektrische stimulatie met een netvliesprothese ^1. De eerste resultaten van klinische proeven zijn veelbelovend voor elektrodenseries geïmplanteerd in de epiretinale ^2,3, subretinal ^4,5 en intrasclerale ⁶ locaties. Deze apparaten zijn gemaakt van verschillende materialen met verschillende vormen, maar ze gebruiken elektrische pulsen om de resterende levensvatbare neuronen van de retina om visuele waarnemingen maken activeren.

Onze bredere groep (Bionic Vision Australia) heeft een retinale implantaat dat progressie heeft ontwikkeldsed om een klinische pilotstudie met 3 RP patiënten geïmplanteerd met suprachoroïdale elektrode arrays (Clinical Trial Number: NCT01603576). Figuur 1A toont dit suprachoroïdale prototype retinale prothese.

Veiligheid van de patiënt staat voorop in klinische studies en dus, alvorens met menselijke proeven, uitgevoerd we uitgebreide acute en chronische testen in preklinische modellen (Figuur 1B). Histopathologische beoordeling noodzakelijk waren om de chirurgische procedures te verfijnen, doorloopt elektrodeontwerp en uiteindelijk vaststellen van de veiligheid van het implantaat. Om een ​​efficiënte workflow afgestemd met standaard klinische pathologie praktijken te handhaven, werd een paraffine inbedding toegepaste techniek. Het is eveneens wenselijk kleuringen vergelijkbaar met klinische normen, zoals hematoxyline en eosine (H & E), die gemakkelijk door pathologen worden geïnterpreteerd gebruiken. We wilden een techniek die kan worden aangepast voor immunohistochemische analyse, inOm verdere cellulaire evaluatie van de weefsels te vergemakkelijken.

De biocompatibiliteit van het implantaat materialen, en de veiligheid van chronische elektrische stimulatie, moeten zorgvuldig worden geëvalueerd. Het is belangrijk om de histopathologie van het oogweefsel nabij de afzonderlijke stimulatie-elektroden in de array te onderzoeken. De arrays moest worden verwijderd vóór behandelen van monsters zodat ze kunnen worden getest, en omdat hun metaalcomponenten kon gemakkelijk doorgesneden. Bijgevolg heeft onze gevestigde weefselbereiding niet toe lokalisatie en kartering van weefsel ten opzichte van de geïmplanteerde elektroden ^7. Naast het ontbreken van een weefsellokalisatie methode, de standaard formaldehyde gebaseerde fixatie en verwerkingstechnieken geleid tot grootschalige artefacten en loslating van het netvlies als gevolg van de differentiële krimp van de verschillende lagen van het oog (figuur 2). Vanwege de niet-homogeniteit van tHij retina, het moeilijk zinvolle vergelijkingen met controleweefsel, met name voor kwantitatieve metingen. De combinatie van deze beperkingen gecompliceerd nauwkeurige evaluaties van de potentiële schade veroorzaakt door onze geïmplanteerde arrays.

Hier presenteren we nieuwe technieken voor het overwinnen van deze beperkingen. Wij hebben gespecialiseerde oogfixatie en verwerkingstechnieken aangepast ^8-10 om de compatibiliteit met paraffine-gebaseerde histologie behouden. We hebben standaard histologische en immunohistochemische vlekken aangepast om vergelijkbare resultaten te geven, gebaseerd op feedback van klinisch pathologen. Na waardoor de sclerale weefsel doorschijnend, werd een dye-gebaseerde kleur-code gebruikt om het oogweefsel grenzend aan elke afzonderlijke elektrode markeren, voordat u de array van de suprachoroïdale ruimte. Door het markeren van de elektrode-reeks en de individuele elektrodeplaatsen kan monsters nauwkeurig vanuit elektrode aangrenzende gebieden. Matched monsters kunnen worden verzameld van the controleoog om paarsgewijze vergelijkingen te vergemakkelijken.

Protocol

1. Enucleatie en Post-Fixation

Dit protocol gaat ervan uit dat het onderwerp is eenzijdig geïmplanteerd met een suprachoroïdale elektrode-array.

1. Bereid postfix oplossingen in glazen Schott flessen.
   1. Davidson's fixatief oplossing, 2x 100 ml
      • 2 ml formaline (37% formaldehyde)
      • 10 ml ijsazijn (99,7%)
      • 35 ml ethanol (98%)
      • 53 ml gedestilleerd water
   2. 50% ethanol, 2x 100 ml
   3. 70% ethanol, 2x 100 ml
2. Transcardiaal perfuseren onderwerp met warme (37 ° C) gehepariniseerde zoutoplossing gevolgd door koud (4 ° C) neutraal gebufferde formaline (10%).
3. Bind hechtingen aan de superieure limbus (of een locatie die op afstand van de suprachoroïdale array) van beide ogen - in lijn met een rectusspier, om te dienen als een mijlpaal.
4. Ophelderen ogen, behoud van alle externe kabels uit de geïmplanteerde oog.
5. Plaats each oog in 100 ml Davidson's fixatief oplossing en laat op een post-fix bij kamertemperatuur.
6. Na 18-36 uur in Davidson's fixatief, over te dragen aan 50% ethanol (kamertemperatuur) voor 6 - 8 uur, dan uiteindelijk tot 70% ethanol (kamertemperatuur).
7. Koel monsters bij 4 ° C en bewaar tot dissectie.

Intact en druk oog globes zijn opgeslagen op deze manier voor maximaal 3 maanden zonder schadelijke gevolgen voor de resulterende histologie.

2. Identificatie en Tissue Mapping

Bovenstaande fixatie protocol (stap 1) heeft de sclera doorzichtig gemaakt en de array nu zichtbaar - inclusief de individuele elektroden plaatsen (Figuur 3).

1. Verwijder de geïmplanteerde wereld uit ethanol en zorgvuldig weggesneden overtollige weefsel, waaronder bindvlies en oogkapsel. Trim oogzenuw naar een 2 - 3 mm lengte (Figuur 3A).
2. Met behulp van een histologische kleurstof marking regeling, etiket de elektroden met een vooraf gedefinieerde kleurcode, zorg ervoor dat u de kleurstof vlekken.

• We kozen voor een in de handel verkrijgbaar suite van gespecialiseerde histologische kleurstof (zie bijlage). Kleine hoeveelheden van de kleurstof werden zorgvuldig aangebracht met een fijne tip penseel (Roymac maat 00) aan het weefsel en aan de lucht gedroogd tot 5 minuten.
• Voor ons doel, hebben we gekozen: groen voor de actieve elektrode (s) die was (waren) gestimuleerd maximaal, op bovendrempelige niveaus, voor de duur van de studie, rood voor andere actieve elektroden, geel voor de grotere diameter terugkeer elektroden, en blauw voor extra gidsen en / of markeringen anatomische afstand (Figuren 3B en 3C).
• Wat trial and error kan worden verplicht om een ​​kleurstof die stabiel is gedurende de daarop volgende stappen vinden. Bijvoorbeeld, in figuur 4, kan worden gezien dat de groene kleurstof is veerkrachtiger dan de rode kleurstof. Verdunnen van de kleurstof in 70% ethanol verbetert lipide penetrantsoen en weefsel coating.
• Het is nuttig om te schetsen of fotograferen de geverfde wereld voor toekomstige referentie.

3. Keer terug naar 70% ethanol om de kleurstof te dehydrateren.
4. Herhaal stap 2.1 voor de niet-geïmplanteerde controle aardbol.
5. Met behulp van de hechtingen uit stap 1.3, lijn de controle oog en de geïmplanteerde oog als een gespiegeld paar.
6. Plaats een siliconen mal (met dezelfde afmetingen als de elektrode-reeks) in de gespiegelde locatie op de controle oog als het implantaat zich in geïmplanteerde oog (NB de doorschijnende sclera en de kleurstof noteringen van stap 2.2 kan direct visualisatie van de geïmplanteerde matrix positie ).
7. De stappen 2.2 en 2.3 het controle-oog, zodat elke geïmplanteerde elektrode heeft een controle-paar op een anatomisch vergelijkbaar (dwz mirror equivalent met) locatie.

3. Dissectie en Embedding

1. Verwijder het implantaat matrix van het oog en verwijder de voorkant van het oog(Met inbegrip van de cornea, iris en lens). Verwijder het glasvocht vloeistof uit de resterende oogschelp (achterste kamer).
2. Ontleden het oog geïmplanteerd in meerdere representatieve stroken (~ 2 mm dikte) die elk een deel van de kleurstof gemarkeerde gebieden (figuur 3D). Merk op dat de oriëntatie van de stroken worden gekozen om te helpen bij de beoordeling verschillende aspecten van de weefselreactie op het implantaat ^7.

Het is nuttig, voor toekomstig gebruik, tot een record van die kleurstof regio's aanwezig op elke strip en hun relatieve locaties (en kleuren) zijn te maken.

3. Plaats de strip aan de zijkant in een ondiepe plas vloeibaar agar (4%; 80 - 90 ° C) met de zijkant te snijden eerst naar beneden (figuur 3E).
4. Zodra de agar heeft ingesteld, snijd rond het monster en plaats in een weefsel cassette ondersteund door foam inserts (figuur 3F).
5. Herhaal stappen 3.1-3.3 ter bestrijding eye - taking zorg aan spiegel-geëvenaard strips ontleden.
6. Verwerk alle cassettes via standaard (geautomatiseerde overnight) paraffine verwerkingstechniek.
7. Insluiten verwerkt weefsel in paraffine met de zijkant te snijden eerst naar beneden.

4. Snijden en kleuring

1. Snijd paraffine blokken in 5 micrometer secties regelmatig verwijzen naar de toelichting van de stappen 2 en 3.
2. Verzamel gedeelten van elk van de gekleurde gebieden en monteren op objectglaasjes.

Het gebied direct naast elkaar geverfd plek van sclera kan nu worden beoordeeld met vertrouwen dat het dichtst in de nabijheid van de overeenkomstige elektrode in de array (figuur 4).

3. Beits of presteren immunofluorescentie zoals gewenst. Voorbeeld vlekken en immunohistochemie weergegeven in figuur 5 zijn: H &E; Luxol snel blauw (LFB); cresylviolet; Masson trichroom blauw; perjoodzuur Schiff (PAS); Perls 'Pruisisch blauw stain, anti-glutamine synthetase (GS), anti-neurofilament proteïne (NF), anti-glia fibrillair zuur eiwit (GFAP) en 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
4. Standaard en speciale vlekken waren zo gedetailleerd uitgevoerd:
   1. H & E kleuring werd uitgevoerd volgens het protocol geleverd door Leica Multistainer bad scala ST5020 (Leica Biosystems).
   2. LFB en cresylviolet (gewijzigd vanaf ^11):
      1. Dewax in 3 veranderingen van xyleen (3x 2 min) en 2 wijzigingen van ethanol (100%, 100%) (2 x 1 min) en spoelen met leidingwater (45 sec).
      2. Hydrateren secties tot 95% ethanol.
      3. Plaats in LFB oplossing ¹¹ bij 37-42 ° C ('s nachts).
      4. Afspoelen overtollige vlek met 70% ethanol.
      5. Spoelen in gedestilleerd water.
      6. In verdunde lithiumcarbonaat (8%) (enkele seconden).
      7. Onderscheid in 70% ethanol (enkele seconden).
      8. Spoelen in gedestilleerd water.
      9. Herhaal de stappen 4.4.2.6 tot 4.4.2.8, indien nodig, tot background is kleurloos.
      10. In cresylviolet acetaat werkoplossing bij 37 ° C (10 min).
      11. Niet wassen in water.
      12. Uitdrogen in 3 veranderingen van absolute alcohol (1x 30 sec, 2x 20 sec) en 3 veranderingen van xyleen (1x 1 min 30 sec, 2x 1 min.).
      13. Mount en dekglaasje met DPX.
   3. Masson trichroom blauw (gewijzigd vanaf ^11):
      1. Dewax volgens 4.4.2.1.
      2. Breng secties om water (2 min).
      3. Vlekken op de kernen met Weigert's ijzer hematoxyline (2 min).
      4. Spoelen met kraanwater afspoelen in gedestilleerd water.
      5. Vlek in Biebrich scharlaken-zuur fuchsine oplossing (5 min).
      6. Spoelen in gedestilleerd water.
      7. Differentiëren in fosfomolybdeenzuur-fosfowolfraamzuur tot collageen is lichtroze (6 min).
      8. Spoelen in gedestilleerd water.
      9. Achtergrondkleuring in aniline blauw (1 min).
      10. Goed wassen in 1% azijnzuur (1 min).
      11. Uitdrogen, mount en dekglaasje als pER 4.4.2.12 en 4.4.2.13.
   4. PAS (gewijzigd van ^11):
      1. Dewax volgens 4.4.2.1.
      2. Oxideren in 1% perjoodzuur (15 min).
      3. Wassen onder stromend water vervolgens gedestilleerd water.
      4. Vlek in Schiff's reagens (15 min).
      5. Wassen in water (5 min).
      6. Tegenkleuring met Harris hematoxyline (1 min).
      7. Kort in kraantjeswater.
      8. Differentiëren in 0,5% zuur alcohol (1 duik).
      9. Goed wassen in leidingwater.
      10. Blauw in Scott's kraanwater (1 min).
      11. Goed met water wassen.
      12. Uitdrogen, mount en dekglaasje als per 4.4.2.12 en 4.4.2.13.
   5. Perls 'Pruisisch blauwe vlek, zoals beschreven in ^11.
5. Immunofluorescentie kleuring werd uitgevoerd zoals gedetailleerd:
   1. Dewax volgens 4.4.2.1.
   2. Spoelen in gedestilleerd water (2x 5 min.).
   3. Voer antigenen met 0,01% citraatbuffer, pH 6 bij 75-80 ° C (20 min) eend laat afkoelen in 0,01% citraat bufferoplossing (20 min).
   4. Wassen secties in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) (2x 5 min).
   5. Permeabel de celmembraan wasbuffer oplossing (10 min).
   6. Incubeer in serum blokkeeroplossing (2 uur).
   7. Incubeer secties in een primair antilichaam verdund in antilichaamverdunner (10% normaal geit serum/0.1% Triton X-100/PBS) ('s nachts in de koelkast). De titer van elke primaire antilichaam dat wordt weergegeven in tabel 1.
   8. Na overnacht incubatie, wassen secties in wasbuffer oplossing (5x 3 min). Vanaf dit punt, houden secties in het donker.
   9. Incubeer secties in de corresponderende tweede antilichaam bij een titer van 1:500 voor een bepaalde duur (zie tabel 1 voor details).
   10. Wassen secties in wasbuffer oplossing (3 x 5 min).
   11. Incubeer secties in DAPI (1:25.000 / PBS) (30 min).
   12. Wassen secties in wasbuffer oplossing (3 x 5 min).
   13. Mount en dekglaasje met fluorescerennt montage media.

Proefmonsters en controlemonsters zijn klaar voor paarsgewijze vergelijking.

Representative Results

Figuur 4 toont een representatieve verkregen uit het snijden van het monster getoond in figuur 3. De sectie werd afgesneden op 5 urn dik en gekleurd met H & E volgens de hierboven beschreven protocollen. De bruto-vorm van het monster strip wordt geconserveerd met minimale gedifferentieerde weefsel artefacten (Figuur 4A). Kleurstof-markeringen zichtbaar waren op de sclera, hoewel de groene kleurstof is veerkrachtiger dan de rode (figuur 4B). De retinale lagen werden niet artifactually losgemaakt en het netvlies morfologie behouden blijft (Figuur 4C). De retinale weefsel naast de kleurstof markeringen, die overeenkomt met de locatie van de elektroden in de array, kan gemakkelijk worden geïdentificeerd.

Figuur 5 toont representatieve speciale kleuring en immunohistochemie van weefselcoupes bereid volgens de huidige protocol. Raadpleeg 5 Captio figuurn en aanvullende materialen voor meer informatie over de specifieke vlekken en de wijzigingen in het gebruik ervan. Post-modificatie, deze vlekken en immunohistochemie waren gelijkwaardig aan vastgestelde normen - zoals geverifieerd door pathologen.

Soort primaire antilichaam en titer (tussen haakjes)	GFAP (1:1500)	NF200 (1:100)	GS (1:100)
Type secundaire antilichaam en titer (tussen haakjes)	Alexa Fluor 594	Alexa Fluor 488	Alexa Fluor 488
Duur van de incubatie van secundair antilichaam	1 hr	2 hr	45 min

Tabel 1. Antilichaam Type, Titre en Duur van Labeling.

Figuur 1. Suprachoroidal Prototype Electrode Array. A) Macro foto van een klinische kwaliteit gegoten array. B) Photomicrograph van een handgemaakte preklinische array.

Figuur 2. Voormalig Netvlies Histologie. Standaard histologische methoden werden gebruikt om deze te bereiden, H & E gekleurde, secties van een oog geïmplanteerd met een suprachoroïdale elektrode-array. A) Een orthogonaal doorsnede door het elektrode-array holte (afgebeeld door een ster). Het netvlies wordt losgemaakt van het buitenste oogweefsel. Dit is vooral duidelijk onder het geïmplanteerde gebied (pijl). Het is onmogelijk te bepalen welk deel van de retina naast elke afzonderlijke elektrode van de array was. Scalebar = 1 mm. B) Een hogere vergroting van de boxed regio Panel A. Er zijn een aantal op regelmatige afstand, artefacten in de retinale Layers (pijlen), evenals grote onthechting van het tapetum laag (de reflecterende laag in kattenogen). Scalebar = 100 micrometer. C) Een hogere vergroting van de boxed regio in panel B. Pijl aangegeven buitensegmenten van de fotoreceptoren de pigmental epitheel, dat intact blijft, suggereert dat het losmaken werd een kunstmatig neveneffect van de verwerking, in tegenstelling tot zijn veroorzaakt door een in vivo trauma of pathologie. Scalebar = 20 urn.

Figuur 3. Lokalisatie en Dissectie van elektrode-weefsel Adjacent. AD) hoog dynamisch bereik macro foto van een enucleated oog, met een suprachoroïdale elektrode array in situ. A) Wens gefixeerd met Davidson's fixatief en vóór matrix verwijderd, de doorschijnende sclera maakt visualisatie vande afzonderlijke elektroden in de array (enkel voorbeeld aangeduid met pijl). B) De elektroden zijn aangeduid met een vooraf bepaalde stof kleur. C) Dye markeringen op regelmatige afstand van anatomische oriëntatiepunten gebruikt om consistentie in experimenten. D) Na verwijdering van de array, wordt het oog ontleed met de hand in monster reepjes. Gekleurde pijlen geven twee van de elektrode aansluitende gebieden van de sclera. Gele gestippelde lijn geeft vlak van snijden. E) Macro-foto van sample strip ingebed in een agar blok. F) Macro foto van de agar-embed steekproef strook van Panel E, uitknippen en in een inbedding cassette ondersteund door schuim biopsie pads om beweging van het minimaliseren tijdens verwerking.

Figuur 4. Nieuwe Retina Histologie. trong> Het bovenstaande voorbeeld strip (uit figuur 3D), met daarin de elektrode zak, was paraffine ingebed, coupes op 5 micrometer en gekleurd met H & E. A) Groen en rood geverfde gebieden (aangegeven met pijlen, hetzelfde als figuur 3D) zijn zichtbaar in een doorsnede ter hoogte van de gele stippellijn in figuur 3D. Schaal bar = 1000 micrometer. Het netvlies is niet los, ook niet onder de array pocket noch op afstand. B) De boxed gebied van Panel A met zichtbare rode en groene kleurstof aangegeven met pijlen, en intacte retina overal. Schaal bar = 500 urn. C) De boxed gebied van paneel B, die het intacte, in bijlage, retina nabij de groene kleurstof. Schaal bar = 50 micrometer. Wetende dat de plaats van de kleurstof geeft de positie van een elektrode, kunnen we met vertrouwen beoordeelt de aangrenzende retinale weefsel voor eventuele beschadiging, veroorzaakt door elektrische stimulatie.

ve_content "fo: keep-together.within-page =" altijd ">
Figuur 5. Voorbeelden van gemodificeerde retinale cytohistochemistry met speciale vlekken en immunofluorescentie. Het gebruik van Davidson's fixatief, in tegenstelling tot standaard formaline fixatie technieken vereist veranderingen aan de gebruikelijke kleuringsprotocollen, zoals uiteengezet in de voornaamste protocol tekst. Pathologen hebben bevestigd dat deze wijzigingen resulteerden in gelijkwaardige kleuring. A) H &E; haematoxyline vlekken celkernen paars terwijl eosine vlekken cel cytoplasma, collageen en steunweefsel verschillende tinten roze. B) LFB vlekken myeline blauw terwijl de cresylviolet tegenkleuring kan worden gebruikt om . identificeren ganglioncellen door kleuring Nissl instanties binnen het perikaryon blauwe en het benadrukken van de satelliet cellen rondom de cellen C) Masson trichroom blauw, de Biebrich scharlaken-zuur fuchsine oplossing vlekken spier fimers rood, terwijl de aniline blauwe vlekken het collageen, in casu sclera, blauw D) PAS;. glycoproteïne componenten basaalmembraan en bindweefsel componenten paars gekleurd, terwijl celkernen hematoxyline counterstains paars E) Perls Pruisisch blauw.; op de plaats van bloeding, de vorming van haemosiderine in gedegradeerde rode bloedcellen en de afgifte van ijzer complexen veroorzaakt een paarse kleur, terwijl de toevoeging van neutrale rode beits lysosomen rood F) GS;. deze neurotransmitter afbrekend enzym in Müllercellen ¹³ (groen ), blijkt zich in beide richtingen met Müller cellichamen in de inwendige kernlaag en Müller eindvoetjes cel die het binnenste beperkende membraan G) NF-200,. deze zware keten cytoskelet eiwit (groen) in de cel soma en processen gecrosslinkt met andere zenuwvezels de structuur van neuronen ^14,15 handhaven. Ganglioncellen en hun axonen te zien in de ganglion cellaag en zenuwvezellaag, terwijl axonen van horizontale cellen die zich aan de buitenste grens van de binnenste kernlaag in de katachtige retina worden benadrukt. Tegenkleuring met DAPI (blauw) maakt visualisatie van retinale lagen H) GFAP;. Deze cytoskelet eiwit (rood) vermeerderd in Müller cellen en astrocyten in gliosis ^16, zichtbaar langs de zenuwvezellaag met Müllercellen vormen dunne uitbreidingen door binnen naar buitenste retinale lagen. Tegenkleuring met DAPI (blauw) maakt visualisatie van de retinale lagen. Schaal bar = 50 micrometer in alle panelen. De binnenste retina wordt bovenaan elk beeld, de buitenste retina wordt onderin elke afbeelding, exclusief Panel E die subscleral reactie toont.

Discussion

Beoordeling van de veiligheid van het implantaat is een primaire overweging voor preklinische studies. Voordat een netvliesprothese kan worden geïmplanteerd bij mensen is het essentieel om te verifiëren dat het geen schade toebrengen. Dit vereist een beoordeling van zowel het implantaat biocompatibiliteit ^17-23 alsmede eventuele schade die kan worden veroorzaakt door chronische elektrische stimulatie ^24-26. Ervaring met soortgelijke neurale prothesen, zoals het cochleair implantaat, geeft inzicht in de brede waaier van de stimulatie, en fysische, parameters die niet weefselschade ²⁷ veroorzaken. Echter, het netvlies heeft verschillende kenmerken naar andere implantatieplaatsen en dus nauwkeuriger veiligheidsfactor grenzen (zoals de maximale ladingsdichtheid) kan niet worden uitgegaan van eerdere studies in andere systemen. Ladingsdichtheden zijn het hoogst bij de actieve elektrode plaatsen en dit komt overeen met het grootste potentieel voor de schade. Derhalve een werkwijze voor het lokaliseren van het weefsel direct naastde afzonderlijke actieve elektroden zou verhogen de bruikbaarheid van deze studies. Het weefsel grenzend aan specifieke gebieden van het implantaat kan ook worden uitgelicht nadere inspectie. Deze doelgerichte aanpak het mogelijk om minder secties te analyseren, met behoud van het vertrouwen dat het "worst case scenario" werd onderzocht.

De sclerale kleurstof lokalisatie hier beschreven methode is uitgebreid getest met de hand gevormd en gegoten siliconen / Pt-elektrode arrays ^28-30. Het is gebruikt bij dunne-film polyamide ^7,31 arrays ook dunne-film silicone / Pt arrays ^32. Sommige retinale prothese studies tewerkgesteld "kogelvormige" elektroden met intrasclerale implantaties ^33. De huidige techniek moet effectief zijn voor de beoordeling van dit type elektrode arrays zijn. Feline ogen met dunne sclera (dikte bij achterpool 90-200 urn) toegestaan ​​visualisatie van afzonderlijke elektroden in een matrix. Echter, zelfs als individuele electrodes niet zichtbaar waren, hun posities gemakkelijk kunnen worden afgeleid met behulp van een siliconen mal als het kader van de array kan worden gezien (vergelijkbaar met die in stap 2.6).

De kleurstof mapping beperkt de noodzaak om niet-relevante weefselsecties verkrijgen over gedeelten met kleurstofheden verkregen. De mogelijkheid om elektrode positie nauwkeurig afleiden laat niet alleen relevant histopathologische analyse en een groter statistisch onderscheidingsvermogen, maar heeft een grote impact op tijd en kosten beheer door het verminderen van de hoeveelheid dia's en bladen evenals gebruikt als de kosten van arbeid. Het gebruik van de kleurstof die is aanhangend en kan weefselverwerking weerstaan ​​terwijl ook zichtbaar in ongekleurde coupes is een belangrijke eerste overweging. Kennis van de locatie van de kleurstof en de oriëntatie van het weefsel wordt bij de ontleding en tijdens inbedden ondersteunt het snijproces. Dit omvat correct oriënteren het blok naar een gedeelte dat niet schuin is afgesneden te bereiken en geeft een volledige vertegenwooreen van het weefsel. Het is daarom belangrijk dat de persoon die de snij die ten tijde van kleurstof aanvraag dissectie en inbedding.

De totale protocol is robuust om minder belangrijke wijzigingen, met name fixatie timings. Echter, het oog dissectie en kleurstof markering stappen zijn complexe handelingen die profiteren van een goede handvaardigheid om beschadiging van het monster te voorkomen. Terwijl Davidson fixatief is effectief voor het verminderen van artefacten loslating van het netvlies bij een implantaat bleek, is het niet tijdens dissectie effectief directe mechanische beschadiging. Davidson's fixatief was moeilijk te verenigen met een aantal speciale histologische en immunohistochemische procedures. Daarom was er behoefte aan deze stappen te wijzigen / optimaliseren zoals hierboven beschreven. Incrementele veranderingen in kleuring tijden en concentraties werden gemaakt tot het optimale resultaat werd bereikt - voor meer details, zie de aanvullende materialen.

Kwantificering van retinalehistologie blijft problematisch. Het netvlies is niet homogeen en zowel de dikte en de celdichtheid veranderen met toenemende afstand van de lokale centralis ^34,35. Daarom kan naburige weefsel in het oog geïmplanteerde niet worden gebruikt voor vergelijkingen en controleoog plaats daarvan toegepast. Paarsgewijs matching van elke sectie met de controle-oog geeft ons een meer krachtige statistische vergelijking van de pathologische veranderingen; werkzaamheid en veiligheid resultaten met retinale prothesen worden beter beoordeeld bij het ​​vergelijken van de collega-ogen in een subject ^36. Speciale zorg moet worden genomen om schuin snijden te minimaliseren, omdat dit zou kwantificering beïnvloeden.

Kortom, de hierboven beschreven werkwijzen aanzienlijk verbeterd onze histopathologische analyse, die op zijn beurt geleid tot een efficiëntere preklinische workflow. De resultaten van preklinische studies met behulp van deze methoden direct geleid tot een klinische proef waarbij 3 RP patiënten zijn veilig geïmplanteerd met suprachoroidal retinale prothesen. Deze methoden zijn relevant zowel retinale stimulatoren en andere oculaire implantaten waarbij de pathologische respons op lange termijn implantatie moeten worden onderworpen. Deze methode verstrekt waardevolle voordelen voor het behoud van de cytoarchitecture en registratie van de pathologie aan de regio's van de rente op het implantaat. Hoewel niet specifiek onderzocht kan een modificatie van deze procedures worden gebruikt in andere soorten en andere anatomische locaties, met name wanneer een array oppervlakkig wordt geïmplanteerd.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
The Davidson marking system	Bradley Products	1163-4 - red 1163-5 - blue 1163-2 - yellow 1163-1- green
Rabbit Polyclonal Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody	Millipore	AB5804	1:1500, overnight incubation
Mouse Monoclonal Anti-Glutamine Synthetase Antibody	Millipore	MAB302	1:100 overnight incubation
Monoclonal Mouse Anti-Neurofilament 200 Antibody	Sigma-Aldrich	N0142	1:100 overnight incubation
4',6-diamindino-2-phenylindole, dilactate (dilactate)	Life Technologies	D3571	1:25,000 30 min incubation
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG	Life Technologies	A11029	1:500
Superfrost 90° yellow	Grale Scientific	SF41299
FLEX IHC Microscope Slides	DAKO	K802021-2
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG	Life Technologies	A11037	1:500
Normal goat serum	Life Technologies	PCN5000	10% serum/0.1% Triton X-100/PBS
Non-Standard Solution Preparation for Special Stains 1% Aqueous Cresyl Violet Stock Solution Cresyl violet 1 g Distilled water 100 ml Cresyl Violet Acetate Working Solution 1% aqueous cresyl violet stock solution 9 ml Distilled water 51 ml 10% acetic acid 0.5 ml Biebrich Scarlet-Acid Fuchsin Solution 1% Beihrich scarlet 90 ml 1% acid fuchsin 10 ml Glacial acetic acid 1 ml Phosphomolybdic-Phosphtungstic Acid Solution Phosphomolybdic acid 2.5 g Phosphotungstic acid 2.5 g Distilled water 100 ml Aniline Blue Solution Aniline blue 2.5 g Glacial acetic acid 2 g Distilled water 100 ml Solutions for Immunohistochemistry Wash Buffer Solution 0.1% Triton X-100 in Phosphate buffered saline (PBS) Serum Block Solution 10% normal goat serum/0.1% Triton X-100 in PBS SUPPLEMENTARY MATERIAL Luxol Fast Blue The purpose of performing a Luxol Fast Blue (LFB) stain was to identify the ganglion cells in the ganglion cell layer through the counterstain of cresyl violet. While LFB stains myelin, the cresyl violet stain binds to the Nissl substances in neurons, composed of rough endoplasmic reticulum and ribosomes. Numerous cells in the retina contain Nissl substance including amacrine cells. These cells usually are located in the inner boundary layer of the inner nuclear layer, but displaced amacrine cells can be found in the ganglion cell layer. The staining of Nissl substance is helpful in differentiating large, heavily stained ganglion cells from smaller displaced amacrine cells. To aid visualisation of these cells, we modified the cresyl violet working solution protocol by increasing the volume of the cresyl violet stock solution in the working solution. We increased the volume in 1.0 ml increments from 6.0 ml to 9.0 ml, in turn reducing the volume of distilled water. Assessing the ease of visualising and identifying the ganglion cells, optimal staining was achieved with 9 ml of additional cresyl violet stock solution and 51 ml of distilled water. Cresyl violet is a basic dye, though to dye the Nissl substance, it is required to be used in an acidic solution, and therefore the volume of acetic acid remained unchanged at 0.5 ml. Periodic Acid Schiff The Periodic Acid Schiff (PAS) stain was performed to highlight polysaccharides especially glycogen, found in basement membranes and fungal cell walls, indicating a fungal infection. The process of the PAS stain is to oxidise the hydroxyl groups in polysaccharides using periodic acid, producing aldehyde groups. The application of the Schiff reagent, binds to the aldehyde groups producing a magenta color with haematoxylin counterstaining producing purple cell nuclei. Our slides showed weak staining at the inner limiting membrane. This may be due to the polysaccharides present, as not all polysaccharides can be oxidised with a standard time frame, especially those containing anionic polysaccharides. We therefore increased the duration of the oxidation step from 10 min to 12, 15, and 20 min. We found that a 15 min oxidation step was most effective in PAS staining. Masson’s Trichrome Blue The principle of the Masson's trichrome blue stain is to stain collagen and muscle, which in our retinal slides can be used to indicate an increase in collagen tissue which may indicate fibrosis due to injury. This stain is sensitive to fixation techniques, so alterations were needed to obtain optimal staining. The process of this stain is to initially stain cytoplasm and muscle fibres red using the acidic Biebrich scarlet-acid fuchsin red dye. Differentiation with phosphomolybdic/phosphotungstic acid competes with the red dye in the collagen fibres. In the sclera, the large phosphomolybdic/phosphotungstic acid molecules are able to penetrate the loose connective tissue, as opposed to the dense muscle fibres which are penetrable to small molecules only. Aniline blue dye is then applied to replace the acid in the collagen fibres producing blue dyed sclera. To optimise this stain in retinal sections, the duration of staining with Biebrich scarlet-acid fuchsin dye was reduced to create a balance between the blue and the red dye. The use of Davidson's fixative also required an extended differentiation time to remove the red dye from the collagen. We trialled differentiation at 5, 6, 8, and 10 min, with optimal results occurring at 6 min. Differentiation also varies on the thickness and cutting of smooth sections, with greater than 6 min differentiation possibly being required. Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Antibody Polyclonal, host species is rabbit, has a molecular weight of 50 kDa. GFAP antigen is an intermediate filament found in the cytoplasm (the cytoplasm of astrocytes and Müller cells in the retina), the antigen is made form 428 amino acids and has a molecular weight of 49512 Da. Neurofilament-200 antibody Monoclonal, host species is mouse, clone N52, isotype IgG1, it recognises phosphorylated and non-phosphorylated forms of the heavy neurofilaments which have a molecular weight of 200 kDa. The antibody will bind to an epitope in the tail domain of the neurofilament. The antibody will stain neurofilaments in the neuronal perikarya, dendrites and axons. Glutamine Synthetase (GS) antibody Monoclonal, clone GS-6, host species is mouse, has a molecular weight of 45 kDa and antibody isotype IgG2a. The GS antigen is found in the cell cytoplasm (cytoplasm of Müller cells in the retina), the antigen has 373 amino acids and a molecular weight of 42,064 Da.