Teknikker til behandling Eyes implanteret med en retinal protese til Lokaliseret Histopatologisk analyse

Summary

Teknikker til visualisering retinal cytoarchitecture støder direkte op til de enkelte elektroder i en retinal stimulator.

Abstract

Med den seneste udvikling af retinale proteser, er det vigtigt at udvikle pålidelige metoder til vurdering af sikkerheden af ​​disse enheder i prækliniske studier. Men den standard fiksering, forberedelse, og automatiserede histologi procedurer er ikke ideel. Her beskriver vi nye procedurer for evaluering sundheden af ​​nethinden støder direkte op til et implantat. Retinal proteser har elektrode arrays i kontakt med øjet. Tidligere metoder har ikke været i stand til rumligt lokalisere det okulære væv støder op til de enkelte elektroder i sættet. Hertil kommer, ofte standard histologiske behandling resulterer i grov kunstig frigørelse af retinale lag, når vurderer implanterede øjne. Derfor har det været vanskeligt at vurdere lokal skade, hvis til stede, forårsaget af implantation og stimulering af en implanteret elektrode array. Derfor har vi udviklet en metode til at identificere og lokalisere det okulære væv i nærheden implanteret electrodes ved hjælp af en (farve-kodet) farvestof mærkningsordning, og vi ændrede et øje fiksering teknik til at minimere kunstig nethindeløsning. Denne metode gengives også sclera gennemskinnelig, så lokalisering af individuelle elektroder og specifikke dele af et implantat. Endelig brugte vi et matchet kontrol for at øge styrken af ​​de histopatologiske vurderinger. Sammenfattende giver denne metode pålidelig og effektiv diskrimination og vurdering af nethinden cytoarchitecture i en implanteret øje.

Introduction

Retinale proteser kan snart blive nyttige kliniske tiltag til behandling af forskellige former for alvorlig synstab. Visse betingelser, såsom retinitis pigmentosa (RP), resulterer i den udbredte degenerering af fotoreceptorer i øjet, som er de celler, der er ansvarlige for at transducere lys i neurale signaler. Men nogle celler i andre lag af nethinden forblive og er potentielle mål for elektrisk stimulation med en retinal protese ^1.. Tidlige resultater fra kliniske forsøg på mennesker har været lovende for elektrode arrays implanteret i Epiretinal ^2,3, subretinal ^4,5 og intrascleral ⁶ steder. Disse enheder er fremstillet af forskellige materialer med forskellige former, men de anvender alle elektriske impulser til at aktivere de resterende levedygtige neuroner i nethinden for at skabe visuelle perceptioner.

Vores bredere gruppe (Bionic Vision Australia) har udviklet en retinal implantat, der har gradvissed en klinisk pilotundersøgelse med 3 RP patienter implanteret med suprachoroidal elektrode arrays (Clinical Trial Nummer: NCT01603576). Figur 1A viser denne suprachoroidal prototype retinal protese.

Patientsikkerhed er altafgørende i kliniske studier, og dermed før de påbegynder menneskelige forsøg udførte vi en omfattende akut og kronisk test i prækliniske modeller (figur 1B). Histopatologiske vurderinger var afgørende at forfine de kirurgiske procedurer, gentage gennem elektrode design, og i sidste ende etablere sikkerheden af ​​implantatet. For at opretholde en effektiv arbejdsgang afstemmes med standard klinisk patologi praksis blev en paraffinfiksering teknik anvendes. Det var også ønskeligt at anvende farvningsprocedurer sammenlignelige med kliniske standarder, såsom hæmatoxylin og eosin (H & E), som let fortolket af patologer. Vi ønskede også en teknik, der kan tilpasses til immunohistokemiske analyser, iFor at lette yderligere cellulær evaluering af væv.

Biokompatibilitet af implantat materialer, og sikkerheden for kronisk elektrisk stimulation, skal vurderes nøje. Det er vigtigt at være i stand til at undersøge histopatologi det okulære væv støder op til de enkelte stimulerende elektroder i sættet. Imidlertid opstillingerne skulle fjernes før behandling af prøverne, så de kan testes, og fordi deres metalliske komponenter ikke kunne være let snit. Følgelig har vores etablerede væv forberedelse ikke tillade lokalisering og kortlægning af væv med hensyn til de implanterede elektroder ^7. Ud over manglen på en vævslokalisering metode resulterede standard formaldehyd-baserede fiksering og forarbejdningsteknikker i udbredte artefakter og frigørelse af den retinale grund af den forskellige krympning af de forskellige lag i øjet (fig. 2). På grund af manglende homogenitet af than nethinden, var det vanskeligt at foretage valide sammenligninger med styring væv, især for kvantitative målinger. Disse kombinerede begrænsninger komplicerede præcise vurderinger af den potentielle skade forårsaget af vores implanterede arrays.

Her præsenterer vi nye teknikker til at overvinde disse begrænsninger. Vi har ændret specialiserede øje fiksering og behandling teknikker ^8-10 for at opretholde kompatibilitet med paraffin-baserede histologi. Vi har ændret standard histologiske og immunhistokemiske pletter til at give sammenlignelige resultater, baseret på feedback fra kliniske patologer. Efter gøre den sclerale væv gennemskinnelige blev en farvestofbaseret farvekode ansat til at markere øjenvævet støder op til hver enkelt elektrode, før du fjerner array fra suprachoroidal rum. Ved at markere elektrode array og de individuelle elektrodesteder kunne prøverne præcist indsamles fra elektrode tilstødende regioner. Matchede prøver kunne indhentes fra the kontrol øje for at lette parvise sammenligninger.

Protocol

1.. Enucleation og efter fiksering

Denne protokol antager, at emnet er blevet implanteret ensidigt med en suprachoroidal elektrode array.

1. Forbered postfix løsninger glas Schott flasker.
   1. Davidson fikseringsopløsning, 2x 100 ml
      • 2 ml formalin (37% formaldehyd)
      • 10 ml iseddike (99,7%)
      • 35 ml ethanol (98%)
      • 53 ml destilleret vand
   2. 50% ethanol, 2x 100 ml
   3. 70% ethanol, 2x 100 ml
2. Transcardialt perfundere emne med varmt (37 ° C) hepariniseret saltvand efterfulgt af kold (4 ° C) en neutral pufret formalin (10%).
3. Binde suturer på den overlegne limbus (eller en placering, der er fjernt fra suprachoroidal array) af begge øjne - i overensstemmelse med en rectusmusklen, at tjene som en milepæl.
4. Enucleate øjne, opretholdelse eventuelle eksterne fører fra den implanterede øje.
5. Placer ØKh øje i 100 ml Davidson fikseringsopløsning og overlade til post-fix ved stuetemperatur.
6. Efter 18-36 timers i Davidson fiksativ, overførsel til 50% ethanol (stuetemperatur) i 6 - 8 timer, så endelig til 70% ethanol (stuetemperatur).
7. Afkøl prøver ved 4 ° C og opbevares indtil dissektion.

Intakt og tryk øjet glober er blevet gemt på denne måde i op til 3 måneder uden at påvirke den resulterende histologi.

2.. Identifikation og Tissue Mapping

Ovenstående fiksering protokollen (trin 1) har gjort sclera gennemskinnelige og matrix er nu synlig - herunder enkelte elektrodesteder (figur 3).

1. Fjern den implanterede kloden fra ethanol og omhyggeligt trimme væk overskydende væv, herunder bindehinden og Tenons kapsel. Trim synsnerven til et 2 - 3 mm længde (figur 3A).
2. Ved hjælp af en histologisk farvestof Marking-ordningen, label elektroderne med en foruddefineret farvekode, pas på ikke at plette farvestoffet.

• Vi valgte en kommercielt tilgængelig suite af specialiserede histologiske farvestof (se tillægget). Små mængder af farvestoffet blev omhyggeligt anvendt med en fin spids pensel (Roymac str. 00) til vævet og fik lov at lufttørre i op til 5 min.
• Til vores formål, har vi valgt: grøn for den aktive elektrode (r), der var (var) stimuleres maksimalt på suprathreshold niveauer for varigheden af ​​undersøgelsen, rød for andre aktive elektroder, gul for de større diameter returelektroder, og blå for yderligere vejledninger og / eller anatomiske distance markeringer (figur 3B og 3C).
• Nogle trial and error kan være nødvendigt at finde et farvestof, der er stabil i de efterfølgende trin. For eksempel, i figur 4 kan det ses, at den grønne farvestof var mere modstandsdygtig end det røde farvestof. Fortynding af farvestoffet i 70% ethanol hjælper med at forbedre lipid Penetration og væv belægning.
• Det er nyttigt at skitsere eller fotografere farvet kloden for fremtidig reference.

3. Tilbage til 70% ethanol for at dehydrere farvestoffet.
4. Gentag trin 2.1 til forekomsten blandt kontrol kloden.
5. Brug af suturerne fra trin 1.3, justere kontrol øjet og den implanterede øjet som en spejlet par.
6. Placer en silicone skabelon (med samme dimensioner som elektroden array) i spejlet placering på kontrol øjet som implantatet er placeret på implanteret øjet (NB det gennemskinnelige sclera og farvestof markeringer fra trin 2.2 tillader klar visualisering af den implanterede matrix position ).
7. Udfør trin 2.2 og 2.3 for kontrol øjet, således at hver implanteret elektrode site har en kontrol par i en anatomisk sammenlignelige (dvs. spejl matchede tilsvarende) placering.

3.. Dissektion og Embedding

1. Fjerne implantatet matrix fra øjet og fjerne den forreste del af øjet(Herunder hornhinde, iris og linse). Fjern den glasagtige væske fra den resterende øjenbægeret (bageste kammer).
2. Dissekere implanterede øje i flere repræsentative strimler (~ 2 mm tykkelse), som hver indeholder en delmængde af farvestoffet markeret regioner (fig. 3D). Bemærk, at orienteringen af strimlerne skal vælges til at bistå med at vurdere forskellige aspekter af vævsreaktion til implantatet ^7..

Det er nyttigt, for fremtidig reference, for at lave en plade, som farvestof regioner er repræsenteret på hvert bånd og deres relative placeringer (og farver).

3. Placer strimlen på sin side i en lavvandet pool af flydende agar (4%, 80 - 90 ° C) med den side, der skal skæres først, vender nedad (figur 3E).
4. Når agaren har sat, skåret omkring prøven og anbringes i et væv kassette understøttes af skumindlæg (figur 3F).
5. Gentag trin 3.1-3.3 for kontrol eye - taking omhu for at dissekere spejl-matchede strimler.
6. Behandle alle kassetter via standard (automatiseret natten over) paraffin teknik.
7. Integrer forarbejdet væv i paraffin med den side, der skal skæres første nedad.

4.. Skæring og farvning

1. Skær paraffinblokke i 5 um snit henviser regelmæssigt til noterne fra trin 2 og 3.
2. Saml sektioner fra hver af de farvede områder og montere på dias.

Regionen umiddelbart op til hver farvet plet af sclera kan nu vurderes med tillid til, at det var i tætteste nærhed til den tilsvarende elektrode i matrixen (figur 4).

3. Stain eller udføre immunfluorescens som ønsket. Eksempel pletter og immunhistokemi vist i figur 5, er: H &E; Luxol Fast Blue (LFB), cresylviolet, Massons trichrom blå, periodisk syre schiff (PAS), Perls 'Prussian blue stai anti-glutaminsynthetase (GS), anti-neurofilamentprotein (NF), anti-glial fibrillært surt protein (GFAP) og 4 ',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI).
4. Standard og special pletter blev udført som beskrevet:
   1. H & E farvning blev udført i overensstemmelse med den protokol, som Leica Multistainer bad matrix ST5020 (Leica Biosystems).
   2. LFB og cresylviolet (ændret fra ^11):
      1. Dewax i 3 skift af xylen (3x 2 min) og 2 ændringer i ethanol (100%, 100%) (2x 1 min) og skylles i ledningsvand (45 sek).
      2. Hydrat sektioner til 95% ethanol.
      3. Sted i LFB-løsning ¹¹ ved 37-42 ° C (natten over).
      4. Skyl overskydende pletten med 70% ethanol.
      5. Skyl i destilleret vand.
      6. Sted i fortyndet lithiumcarbonat (8%) (få sekunder).
      7. Differentiere i 70% ethanol (få sekunder).
      8. Skyl i destilleret vand.
      9. Gentag trin 4.4.2.6 til 4.4.2.8, hvis nødvendigt, indtil bAGGRUND er farveløs.
      10. Sted i cresylviolet acetat arbejder opløsning ved 37 ° C (10 min).
      11. Må ikke vaskes i vand.
      12. Dehydrer i 3 ændringer i absolut alkohol (1x 30 sek, 2x 20 sek) og 3 ændringer i xylen (1x 1 min 30 sec, 2x 1 min).
      13. Mount og dækglasset med DPX.
   3. Massons trichrom blå (ændret fra ^11):
      1. Dewax pr 4.4.2.1.
      2. Bring sektioner til vand (2 min).
      3. Farv kernerne hjælp Weigert jern hæmatoxylin (2 min).
      4. Vask i hanevand, skyl i destilleret vand.
      5. Farv i Biebrich scarlet-syre-fuchsin opløsning (5 min.)
      6. Skyl i destilleret vand.
      7. Differentiere phosphormolybdaen-phosphorwolframsyre indtil kollagen er lyserød (6 min).
      8. Skyl i destilleret vand.
      9. Kontrastfarve i anilinblåt (1 min.)
      10. Vask godt i 1% eddikesyre (1 min.)
      11. Dehydrer, montere og dækglas som pis 4.4.2.12 og 4.4.2.13.
   4. PAS (ændret fra ^11):
      1. Dewax pr 4.4.2.1.
      2. Oxidere i 1% periodiske syre (15 min).
      3. Vask i rindende vand og derefter destilleret vand.
      4. Farv i Schiffs reagens (15 min).
      5. Vask i vand (5 min).
      6. Kontrastfarve med Harris hæmatoxylin (1 min.)
      7. Vask kortvarigt i vand fra hanen.
      8. Differentiere 0,5% syre alkohol (1 dip).
      9. Vask godt i postevand.
      10. Blå i Scotts postevand (1 min.)
      11. Vask godt i vand.
      12. Dehydrer, montere og dækglas pr 4.4.2.12 og 4.4.2.13.
   5. Perls 'Prussian blåsplint som beskrevet i ^11..
5. Immunofluorescensfarvning blev udført som detaljeret:
   1. Dewax pr 4.4.2.1.
   2. Skyl i destilleret vand (2x 5 min).
   3. Udfør antigen hentning hjælp 0,01% citratpuffer, pH 6 ved 75 - 80 ° (20 min) end afkøles i 0,01% citratbufferopløsning (20 min).
   4. Vask sektioner i phosphatpufret saltvand (PBS) (2x 5 min).
   5. Permeabilisere cellemembranen i vaskebuffer opløsning (10 min).
   6. Inkuber i serum blok opløsning (2 timer).
   7. Inkuber sektioner i en enkelt primær antistof fortyndet i antistof-fortyndingsmiddel (10% normalt ged serum/0.1% Triton X-100/PBS) (natten over i køleskabet). Titeren for hver anvendte primære antistof er vist i tabel 1..
   8. Efter inkubation natten over, vaskes sektioner i vaskebuffer opløsning (5x 3 min). Fra dette punkt på, holder sektioner i mørke.
   9. Inkuber sektioner i den tilsvarende sekundært antistof ved en titer på 1:500 for en bestemt varighed (se tabel 1 for detaljer).
   10. Vask sektioner i vaskebuffer opløsning (3x 5 min).
   11. Inkuber sektioner i DAPI (1:25.000 / PBS) (30 min).
   12. Vask sektioner i vaskebuffer opløsning (3x 5 min).
   13. Mount og dækglas hjælp fluorescerernt monteringssæt medier.

Testprøver og kontrolprøver er klar til parvise sammenligning.

Representative Results

Figur 4 viser et repræsentativt udsnit opnået fra skære prøven afbildet i figur 3. Afsnittet blev skåret ved 5 um tykkelse og farvet med H & E ifølge protokollerne beskrevet ovenfor. Brutto form af prøvestrimlen er bevaret med minimale differentiale væv artefakter (figur 4A). Begge farvestof markeringer var synlige på sclera, selvom grønt farvestof var mere modstandsdygtig end den røde (figur 4B). De retinale lag blev ikke artifactually løsnet sig, og retinal morfologi er konserveret (fig. 4C). Nethindevævet støder op til farvning markeringer, hvilket svarer til placeringen af ​​elektroderne i matrixen, kan let identificeres.

Figur 5 viser repræsentativ særlige farvning og immunhistokemi af vævssnit fremstillet i henhold til den gældende protokol. Der henvises til figur 5 caption og supplerende materialer til flere detaljer om de specifikke pletter og de ændringer, der til deres forbrug. Post-modifikation, disse pletter og immunhistokemi svarede til etablerede standarder - som verificeret af patologer.

Type af primært antistof og titer (i parentes)	GFAP (1:1500)	NF200 (1:100)	GS (1:100)
Type af sekundært antistof og titer (i parentes)	Alexa Fluor 594	Alexa Fluor 488	Alexa Fluor 488
Varigheden af ​​inkubation af sekundært antistof	1 time	2 timer	45 min

Tabel 1. Antibody Type, Titre og varighed mærkning.

Figur 1. Suprachoroidal Prototype Elektrode Array. A) Makro fotografi af en klinisk kvalitet støbt array. B) mikrofotografi af en håndlavet præklinisk array.

Figur 2. Tidligere Retinal Histologi. Standard histologiske metoder blev anvendt til at fremstille disse, H & E farves, dele af et øje implanteret med en suprachoroidal elektrode-array. A) En retvinklet snit gennem elektroden matrix hulrum (afbildet ved en stjerne). Nethinden er løsrevet fra den ydre øjenvæv. Dette er især tydeligt under den implanterede område (pil). Det er umuligt at afgøre, hvilken del af nethinden var støder op til den enkelte elektrode af matrixen. Scalebar = 1 mm. B) en højere forstørrelse af den indrammede område i panel A. Der er flere, regelmæssige mellemrum, artefakter i retinal layers (pile), såvel som store adskillelse fra tapetum lag (det reflekterende lag i feline øjne). Scalebar = 100 um. C) En større forstørrelse af den indrammede region i panel B. Pil angivet de ydre segmenter af fotoreceptorer, samt pigmental epitel, som forbliver intakte, tyder på, at frigørelse var en kunstig bivirkning af behandlingen i modsætning til at være forårsaget af en in vivo-traume eller patologi. Scalebar = 20 um.

Figur 3. Lokalisering og Dissektion af elektrode-tilstødende væv. AD) high dynamic range makro fotografier af en enukleeret øje, med en suprachoroidal elektrode matrix in situ. A) Indlæg fikseret med Davidson fiksativ, og før matrix udsendelsen, gennemskinnelige sclera muliggør visualisering afde enkelte elektroder i array (enkelt eksempel angivet med pil). B) Elektroderne er markeret med en foruddefineret farvestof farve. C) Dye markeringer med regelmæssige mellemrum fra anatomiske landemærker bruges til at bevare sammenhængen på tværs eksperimenter. D) Efter fjernelse af matrix, er øjet dissekeret manuelt i prøve strimler. Farvede pile viser to af de elektroder tilstødende steder på sclera. Gul stiplede linje angiver plan sektionering. E) Makro-fotografi af prøvestrimmel indlejret i en agar blok. F) Makro fotografi af agar-indlejrede prøvestrimmel fra Felt E, skåret ud og anbragt i en indlejring kassette understøttes af skum biopsi puder at minimere bevægelse af sektionen under behandlingen.

Figur 4.. Ny Retinal Histologi. Trong> Ovennævnte prøvestrimmel (fra figur 3D), der indeholder elektroden lomme, var paraffin indlejret, sektioneret på 5 um og farvet med H & E. A) grøn og rød farvet regioner (angivet med pile, samme som figur 3D) er synlige i et snit på niveau med den gule stiplede linie i figur 3D. Skala bar = 1.000 um. Nethinden er ikke fritstående, hverken under array lomme eller via fjernadgang. B) Det indrammede område fra Panel A med synlig rød og grøn farvestof angivet med pile, og intakt nethinden hele vejen igennem. Skala bar = 500 um. C) Den indrammede region fra panel B, viser intakte, vedlagte, nethinden støder op til grønt farvestof. Skala bar = 50 um. Vel vidende, at placeringen af ​​farvestoffet indikerer positionen af ​​en elektrode, kan vi trygt vurdere den tilstødende retinavæv for skader, hvis nogen, forårsaget af elektrisk stimulering.

ve_content "fo: keep-together.within-page =" altid ">
Figur 5. Eksempler på modificerede retinal cytohistochemistry hjælp af specielle pletter og immunofluorescens. Anvendelsen af Davidson fiksativ, i modsætning til standard formalinfiksering teknikker, der er nødvendige ændringer til de sædvanlige farvning protokoller, som skitseret i hovedsagen protokol tekst. Patologer har bekræftet, at disse ændringer resulterede i ækvivalente farvning. A) H &E; hæmatoxylin pletter cellekerner lilla mens eosin pletter cellecytoplasma, collagen og støttende væv forskellige nuancer af pink. B) LFB pletter myelin blå mens cresylviolet kontrastfarve kan bruges til . identificere ganglieceller ved farvning Nissl organer inden for perikaryon blå og fremhæve de satellit celler omgiver cellerne C) Massons trichrom blå, den Biebrich scarlet-syre-fuchsin løsning pletter muskel fimer rød, mens anilinblåt pletter kollagen, i dette tilfælde sclera, blå D) PAS,. glycoprotein komponenter af basalmembran og bindevæv komponenter farves lilla, mens hematoxylin counterstains cellekerner lilla E) Perls 'preussisk blå.; på stedet for blødning, producerer dannelsen af haemosiderin fra nedbrudte røde blodlegemer og frigivelse af jernkomplekser en lilla farve, mens tilføjelsen af neutrale røde bejdsefarver lysosomer rødt F) GS,. denne neurotransmitter nedværdigende enzym i Müller celler ¹³ (grøn ), kan ses strækker sig i begge retninger med Müller cellelegemer i den indre nukleare lag og Müller celle endfeet danner den indre begrænsende membran G) NF-200,. denne tunge kæde cytoskeletprotein (grøn) fundet i cellen soma og processer , tværbindinger med andre neurofilamenter at bevare strukturen af neuroner ^14,15. Ganglionceller og deres axoner kan ses i ganglion cellelag og nerve fiber lag, mens axoner horisontale celler placeret på den ydre grænse af det indre nukleare lag i den feline nethinden, også er fremhævet. Modfarvning DAPI (blå) tillader visualisering af retinalag H) GFAP,. Denne cytoskeletprotein (rød) prolifererede i Müller celler og astrocytter i løbet af gliose ^16, kan ses foring nerve fiber lag med Müller celler danner tynde udvidelser gennem den indre til ydre retinalag. Modfarvning DAPI (blå) giver mulighed for visualisering af retinalag. Skala bar = 50 um i alle paneler. Den indre nethinde vises i toppen af hvert billede, den ydre nethinde er vist nederst på hvert billede, bortset Felt E, som viser subscleral reaktion.

Discussion

Vurdere sikkerheden af ​​implantatet er en primær overvejelse for prækliniske studier. Før et retinal protese kan implanteres i mennesker er det vigtigt at kontrollere, at det ikke vil forårsage nogen skade. Dette kræver en vurdering af både implantatet biokompatibilitet ^17-23 samt eventuelle potentielle skader, der kan være forårsaget af kronisk elektrisk stimulation ^24-26. Erfaringerne med lignende neurale proteser, såsom cochlear implant, giver et indblik i den brede vifte af stimulation, og fysisk, parametre, der ikke forårsager vævsskader ^27. Men nethinden har forskellige egenskaber til andre implantationssteder, og derfor præcise sikkerhedsfaktorer grænser (såsom maksimalt ladningstæthed) kan ikke antages fra tidligere undersøgelser i andre systemer. Ladningsdensiteter er højest på den aktive elektrode sites, og dette svarer til det største potentiale for skader. Derfor en fremgangsmåde til at lokalisere væv direkte tilstødendede enkelte aktive elektroder ville i høj grad øge anvendeligheden af ​​disse undersøgelser. Vævet støder op til bestemte områder af implantatet kan også fremhæves for nærmere inspektion. Denne målrettede tilgang tillader færre sektioner, der skal analyseres, og samtidig bevare tilliden til, at "worst case scenario" blev undersøgt.

Den sclera farvestof lokalisering her beskrevne er blevet grundigt testet med hånd-formet og støbt silicone / Pt-elektrode arrays ^28-30. Det har været brugt med tynd-film polyamid arrays ^7,31 og også tynd-film silikone / Pt arrays ^32. Nogle retinale protese undersøgelser beskæftiget "bullet formet" elektroder med intrascleral implantationer ^33.. Den foreliggende teknik bør være effektive til at vurdere denne type elektrode arrays. Feline øjnene med tynd sclera (tykkelse ved bageste stang 90-200 um) tilladt visualisering af de enkelte elektroder i et array. Men selv om individuel elektrodes var ikke synlige, deres positioner let kan udledes ved hjælp af en silikone skabelon, når omridset af array kan ses (svarende til den, der anvendes i trin 2.6).

Farvestoffet kortlægning begrænser behovet for at opnå ikke-relevante vævssektioner da kun sektioner med farvestoffet øjeblikket opnås. Evnen til præcist at udlede elektrode position ikke kun giver mulighed relevante histopatologiske analyse og større statistisk styrke, men har en stor indflydelse på tid og omkostninger med at reducere mængden af ​​dias og klinger anvendes, såvel som prisen på arbejdskraft. Brugen af ​​farvestof, der er holdbar og kan modstå vævsbehandlingen samtidig også synlig i ufarvede vævssnit er et vigtigt indledende overvejelse. Kendskab til placering af farvestoffet og orienteringen af ​​vævet ved dissektion og under indlejring bistår opskæringen. Dette omfatter korrekt orientere blokken for at opnå en sektion, der ikke skåret skråt og giver en fuld representatipå af vævet. Det er derfor vigtigt, at den person, der udfører skæringen er til stede på tidspunktet for farvestoffet ansøgning, dissektion og forankring.

Den overordnede protokol er robust over for mindre ændring, især med fiksering tider. Men øjet dissektion og farvestof mærkning skridt er hårfine procedurer, der nyder godt god håndelag for at undgå at beskadige prøven. Mens Davidson fixativ har vist sig effektiv til at reducere kunstig nethindeløsning nær et implantat, er det ikke forhindre direkte mekaniske skader under dissektion. Davidson fiksativ var ikke umiddelbart foreneligt med nogle specielle histologiske og immunhistokemiske procedurer. Derfor var der behov for at ændre / optimere disse trin som beskrevet ovenfor. Trinvise ændringer i farvning tider og koncentrationer blev foretaget indtil den optimale resultat blev opnået - for flere detaljer til de supplerende materiale henvises.

Kvantificering af retinalhistologi fortsat problematisk. Nethinden er uensartet, og både tykkelsen og celledensiteten forandring med stigende afstand fra området centralis ^34,35. Derfor kan tilstødende væv i det implanterede øje ikke anvendes til sammenligninger og en kontrol øje anvendes i stedet. Parvis matching af hvert afsnit med kontrol-eye giver os en mere kraftfuld statistisk sammenligning af patologiske forandringer, effekt og sikkerhed resultater med retinale proteser er bedre vurderes når man sammenligner de kolleger øjne i et emne ^36. Særlig forsigtighed skal udvises for at minimere skrå skæring, da dette vil påvirke kvantificering.

Sammenfattende beskrev de metoder ovenfor, har væsentligt forbedret vores histopatologisk analyse, hvilket igen har ført til en mere effektiv præklinisk workflow. Resultaterne af prækliniske studier med disse metoder direkte førte til et klinisk forsøg, hvor 3 RP patienter er blevet sikkert implanteret med suprachoroidal retinale proteser. Disse metoder er relevante for både de retinale stimulatorer og andre okulære implantater, hvor den patologiske reaktion på lang sigt implantation skal evalueres. Denne metode forudsat værdifulde fordele for at opretholde cytoarchitecture og registrering af patologi til områder af interesse på implantatet. Skønt det ikke specifikt testes, kan en ændring af disse procedurer anvendes i andre arter og andre anatomiske steder, navnlig når en matrix er implanteret overfladisk.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
The Davidson marking system	Bradley Products	1163-4 - red 1163-5 - blue 1163-2 - yellow 1163-1- green
Rabbit Polyclonal Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody	Millipore	AB5804	1:1500, overnight incubation
Mouse Monoclonal Anti-Glutamine Synthetase Antibody	Millipore	MAB302	1:100 overnight incubation
Monoclonal Mouse Anti-Neurofilament 200 Antibody	Sigma-Aldrich	N0142	1:100 overnight incubation
4',6-diamindino-2-phenylindole, dilactate (dilactate)	Life Technologies	D3571	1:25,000 30 min incubation
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG	Life Technologies	A11029	1:500
Superfrost 90° yellow	Grale Scientific	SF41299
FLEX IHC Microscope Slides	DAKO	K802021-2
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG	Life Technologies	A11037	1:500
Normal goat serum	Life Technologies	PCN5000	10% serum/0.1% Triton X-100/PBS
Non-Standard Solution Preparation for Special Stains 1% Aqueous Cresyl Violet Stock Solution Cresyl violet 1 g Distilled water 100 ml Cresyl Violet Acetate Working Solution 1% aqueous cresyl violet stock solution 9 ml Distilled water 51 ml 10% acetic acid 0.5 ml Biebrich Scarlet-Acid Fuchsin Solution 1% Beihrich scarlet 90 ml 1% acid fuchsin 10 ml Glacial acetic acid 1 ml Phosphomolybdic-Phosphtungstic Acid Solution Phosphomolybdic acid 2.5 g Phosphotungstic acid 2.5 g Distilled water 100 ml Aniline Blue Solution Aniline blue 2.5 g Glacial acetic acid 2 g Distilled water 100 ml Solutions for Immunohistochemistry Wash Buffer Solution 0.1% Triton X-100 in Phosphate buffered saline (PBS) Serum Block Solution 10% normal goat serum/0.1% Triton X-100 in PBS SUPPLEMENTARY MATERIAL Luxol Fast Blue The purpose of performing a Luxol Fast Blue (LFB) stain was to identify the ganglion cells in the ganglion cell layer through the counterstain of cresyl violet. While LFB stains myelin, the cresyl violet stain binds to the Nissl substances in neurons, composed of rough endoplasmic reticulum and ribosomes. Numerous cells in the retina contain Nissl substance including amacrine cells. These cells usually are located in the inner boundary layer of the inner nuclear layer, but displaced amacrine cells can be found in the ganglion cell layer. The staining of Nissl substance is helpful in differentiating large, heavily stained ganglion cells from smaller displaced amacrine cells. To aid visualisation of these cells, we modified the cresyl violet working solution protocol by increasing the volume of the cresyl violet stock solution in the working solution. We increased the volume in 1.0 ml increments from 6.0 ml to 9.0 ml, in turn reducing the volume of distilled water. Assessing the ease of visualising and identifying the ganglion cells, optimal staining was achieved with 9 ml of additional cresyl violet stock solution and 51 ml of distilled water. Cresyl violet is a basic dye, though to dye the Nissl substance, it is required to be used in an acidic solution, and therefore the volume of acetic acid remained unchanged at 0.5 ml. Periodic Acid Schiff The Periodic Acid Schiff (PAS) stain was performed to highlight polysaccharides especially glycogen, found in basement membranes and fungal cell walls, indicating a fungal infection. The process of the PAS stain is to oxidise the hydroxyl groups in polysaccharides using periodic acid, producing aldehyde groups. The application of the Schiff reagent, binds to the aldehyde groups producing a magenta color with haematoxylin counterstaining producing purple cell nuclei. Our slides showed weak staining at the inner limiting membrane. This may be due to the polysaccharides present, as not all polysaccharides can be oxidised with a standard time frame, especially those containing anionic polysaccharides. We therefore increased the duration of the oxidation step from 10 min to 12, 15, and 20 min. We found that a 15 min oxidation step was most effective in PAS staining. Masson’s Trichrome Blue The principle of the Masson's trichrome blue stain is to stain collagen and muscle, which in our retinal slides can be used to indicate an increase in collagen tissue which may indicate fibrosis due to injury. This stain is sensitive to fixation techniques, so alterations were needed to obtain optimal staining. The process of this stain is to initially stain cytoplasm and muscle fibres red using the acidic Biebrich scarlet-acid fuchsin red dye. Differentiation with phosphomolybdic/phosphotungstic acid competes with the red dye in the collagen fibres. In the sclera, the large phosphomolybdic/phosphotungstic acid molecules are able to penetrate the loose connective tissue, as opposed to the dense muscle fibres which are penetrable to small molecules only. Aniline blue dye is then applied to replace the acid in the collagen fibres producing blue dyed sclera. To optimise this stain in retinal sections, the duration of staining with Biebrich scarlet-acid fuchsin dye was reduced to create a balance between the blue and the red dye. The use of Davidson's fixative also required an extended differentiation time to remove the red dye from the collagen. We trialled differentiation at 5, 6, 8, and 10 min, with optimal results occurring at 6 min. Differentiation also varies on the thickness and cutting of smooth sections, with greater than 6 min differentiation possibly being required. Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Antibody Polyclonal, host species is rabbit, has a molecular weight of 50 kDa. GFAP antigen is an intermediate filament found in the cytoplasm (the cytoplasm of astrocytes and Müller cells in the retina), the antigen is made form 428 amino acids and has a molecular weight of 49512 Da. Neurofilament-200 antibody Monoclonal, host species is mouse, clone N52, isotype IgG1, it recognises phosphorylated and non-phosphorylated forms of the heavy neurofilaments which have a molecular weight of 200 kDa. The antibody will bind to an epitope in the tail domain of the neurofilament. The antibody will stain neurofilaments in the neuronal perikarya, dendrites and axons. Glutamine Synthetase (GS) antibody Monoclonal, clone GS-6, host species is mouse, has a molecular weight of 45 kDa and antibody isotype IgG2a. The GS antigen is found in the cell cytoplasm (cytoplasm of Müller cells in the retina), the antigen has 373 amino acids and a molecular weight of 42,064 Da.