Summary
Методы визуализации сетчатки цитоархитектонике, непосредственно прилегающие к электродам в отдельных сетчатки стимулятора.
Abstract
С недавним развитием протезы сетчатки, важно разработать надежные методы оценки безопасности этих устройств в доклинических исследованиях. Однако стандартная фиксация, подготовки и автоматизированные процедуры гистологии не являются идеальными. Здесь описаны новые процедуры оценки состояния здоровья сетчатки, непосредственно прилегающей к имплантату. Протезы сетчатки имеются массивы электродов в контакте с глазной ткани. Предыдущие способы не смогли пространственно локализовать глазной ткани, прилегающей к отдельных электродов в массиве. Кроме того, стандартный гистологической обработки часто приводит к искусственной валового отряд слоев сетчатки при оценке имплантированных глазами. Следовательно, было трудно оценить локальное повреждение, если присутствует, вызванных имплантацией и стимулирование имплантированный электрод массив. Поэтому мы разработали метод для выявления и локализации глазной ткани, прилегающей к имплантированной электроннойlectrodes использованием (разноцветных) красителя маркировки схемы, а мы модифицировали технику фиксации взгляда, чтобы минимизировать артефакты отслойки сетчатки. Этот метод также оказывает полупрозрачный склеры, позволяя локализации отдельных электродов, и определенные части имплантата. Наконец, мы использовали из контрольной увеличить силу гистопатологические оценок. Таким образом, этот метод позволяет надежная и эффективная дискриминации и оценка сетчатки цитоархитектонике в имплантированных глаза.
Introduction
Протезы сетчатки вскоре может стать полезной клинических вмешательств для лечения различных форм тяжелой потери зрения. Определенных условий, таких как пигментный ретинит (RP), результат в распространенном дегенерация фоторецепторов в глазу; эти клетки, ответственные за трансдуцирующих свет в нервные сигналы. Тем не менее, некоторые клетки в других слоев сетчатки остаются и являются потенциальными мишенями для электрической стимуляцией сетчатки протеза 1. Первые результаты клинических испытаний на человеке были перспективны для электрода массивов имплантированный в эпиретинальных 2,3, 4,5 субретинальной и интрасклеральный 6 местах. Эти устройства изготовлены из различных материалов с различными формами, но все они используют электрические импульсы, чтобы активировать оставшиеся жизнеспособные нейроны сетчатки для того, чтобы создавать визуальные восприятия.
Наша широкая группа (Bionic Видение Австралия) разработал имплантат сетчатки, который имеет прогрессированияСЭД в клиническом экспериментальном исследовании пациентов с 3 RP имплантировали супрахориоидальном массивы электродов (клиническая Число суд: NCT01603576). рис. 1А показывает, что это прототип сетчатки супрахориоидальном протеза.
Безопасность пациентов имеет первостепенное значение в клинических исследованиях и, таким образом, перед началом испытания на человеке, мы провели обширное острых и хронических тестирование на доклинических моделях (рис. 1В). Гистологические оценки были необходимы для уточнения хирургических процедур, итерацию электрод дизайн и, наконец, установить безопасность имплантата. Для поддержания эффективной работы ИС с учетом стандартной клинической патологии практики, техники парафином работал. Желательно также, чтобы использовать процедуры окрашивания сопоставимы с клиническими стандартами, такими как гематоксилином и эозином (H & E), которые могут быть легко истолкованы патологи. Мы также хотели, техника, которая может быть адаптирована для иммуногистохимического анализа, вцелях содействия дальнейшему сотовой оценки тканей.
Биосовместимость имплантата материалы и безопасность хронической электростимуляции, необходимо тщательно оценить. Важно, чтобы иметь возможность изучить гистопатология глазной ткани, прилегающей к отдельным стимулирующих электродов в массиве. Тем не менее, массивы необходимо удалить перед обработкой образцов, чтобы они могли быть испытаны, и потому, что их металлические компоненты не могут быть легко секционного. Таким образом, наши установленный подготовки ткани не позволили локализации и отображение ткани по отношению к имплантированных электродов 7. В дополнение к отсутствию метода локализации ткани, стандарт на основе формальдегида фиксации и методы обработки привело к широкому распространению артефакты и отслоение сетчатки из-за дифференциальной усадки различные слои глаз (рис. 2). В связи с неоднородностью тон сетчатки, было трудно сделать достоверное сравнение с контрольной ткани, в частности, для количественных измерений. В совокупности эти ограничения сложно точно оценить возможный ущерб, причиненный нашими имплантированных массивов.
Здесь мы представляем новые методы для преодоления этих ограничений. Мы модифицировали специализированных глаз фиксации и обработки методами 8-10 Для поддержания совместимости с парафиновой основе гистологии. Мы модифицировали стандартных гистологических и иммуногистохимических пятна давать сопоставимые результаты, основанные на обратной связи от клинической патологии. После оказания склеры полупрозрачная ткань, на основе красителя цвет-код был использован, чтобы отметить глазной ткани, прилегающих к каждому электроду, перед снятием массив из супрахориоидальное пространстве. Нанося массива электродом и отдельных участков электродов, образцы могут быть точно собраны из электродов прилегающих регионах. Соответствие образцов может быть собрана из йэлектронный контрольный глаз в целях содействия парных сравнений.
Protocol
1. Энуклеация и пост-фиксации
Этот протокол предполагает, что предмет был имплантирован в одностороннем порядке с супрахориоидальном массив электродов.
- Подготовьте Postfix решений в стеклянных бутылках Schott.
- Фиксирующий раствор Дэвидсона, 2x 100 мл
- 2 мл формалина (37% формальдегида)
- 10 мл ледяной уксусной кислоты (99,7%)
- 35 мл этанола (98%)
- 53 мл дистиллированной воды
- 50% этанола, 2x 100 мл
- 70% этанолом, 2x 100 мл
- Фиксирующий раствор Дэвидсона, 2x 100 мл
- Транскардиальной перфузии субъекта с теплой (37 ° С) гепаринизированным физиологическим раствором с последующей холодной (4 ° С) нейтральный буферный формалин (10%).
- Свяжите швов в верхнем лимбе (или места, удаленного от супрахориоидальное массив) обоих глаз - в соответствии с прямой мышцы, чтобы служить в качестве ориентира.
- Выяснять глаза, поддерживая любые внешние выводы из имплантированных глаза.
- Наведите EACч глазом в 100 мл фиксирующего раствора Дэвидсона и оставить постфиксных при комнатной температуре.
- Через 18 - 36 часов в фиксаторе Дэвидсона, перевод на 50%-ном этаноле (при комнатной температуре) в течение 6 - 8 ч, затем, наконец, в 70%-ном этаноле (комнатная температура).
- Охладите образцы при 4 ° С и хранят до вскрытия.
Неповрежденной и давлением глобусы глаза были сохранены таким образом на срок до 3 месяцев без отрицательного влияния на результирующий гистологии.
2. Идентификация и ткани карт
Выше протокол фиксации (шаг 1) оказал склеры полупрозрачные и массив теперь видны - в том числе отдельных участках электрода (рис. 3).
- Снимите имплантированных мира из этанола и осторожно обрежьте лишнюю ткань, в том числе конъюнктивы и капсулы Тенонову. Обрезать зрительному нерву в 2 - 3 мм длины (рис. 3А).
- Использование гистологических красителей Маркинг схема, этикетки электродов с заданным кодом цвета, стараясь не размазать краску.
- Мы выбрали коммерчески доступный набор специализированных гистологических красителей (см. Приложение). Небольшие количества красителя были тщательно наносится тонкой наконечником кисть (Roymac размер 00) в ткани и дают высохнуть на воздухе в течение 5 мин.
- Для наших целей мы выбрали: зеленый для активного электрода (ов), который (за которые) стимулировали максимально, на сверхпороговой уровнях, в течение всего срока исследования; красная для других активных электродов, желтый для больших электродов диаметром возвращение, синий для дополнительных руководств и / или анатомических маркировки расстояния (рис. 3В и 3С).
- Методом проб и ошибок может потребоваться, чтобы найти краситель, который является стабильным на протяжении последующих стадиях. Например, на фигуре 4, можно видеть, что зеленый краситель была более устойчивой, чем красный краситель. Разбавление краситель в 70% этаноле способствует улучшению липидного Penetрациона и тканей покрытия.
- Это полезно рисовать или фотографировать окрашенных миру для дальнейшего использования.
- Вернуться на 70% этанола для обезвоживания красителя.
- Повторите шаг 2.1 для управления unimplanted миру.
- Использование швов, начиная с шага 1.3, совместите глазом управления и имплантированным глазом как зеркальной пары.
- Поместите силиконовый шаблон (с теми же размерами, что и электрод массив) в том месте, зеркальной по контролю глазом как имплантат расположен на имплантированный глаз (NB полупрозрачный склеры и краситель маркировку с шагом 2,2 позволить готовый визуализации имплантировали массив положение ).
- Выполнить шаги 2,2 и 2,3 для контроля глаз, так что каждый имплантированный электрод сайт имеет контроль пара в анатомически сопоставимых (т.е. зеркало соответствует эквивалент) расположения.
3. Вскрытие и внедрение
- Удалить имплантат массив из глаза и удалить перед глазом(Включая роговицу, радужную оболочку и линзы). Удалите жидкость из стекловидного оставшиеся чашки глазом (задней камеры).
- Рассеките имплантированы в глаз множества полос представитель (~ 2 мм толщиной), каждый из которых содержит подмножество краситель отмечены областей (рис. 3D). Следует отметить, что ориентация полосы должны быть выбраны, чтобы помочь в оценке различных аспектов реакции тканей на имплантат 7.
Это полезно, для использования в будущем, сделать запись которого краситель регионах присутствуют на каждой полосе и их относительное расположение (и цвета).
- Поместите полосу на боку в мелком бассейне сжиженного агара (4%, 80 - 90 ° C) с боковыми быть сокращены первого вниз (рис. 3Е).
- После того, агар установила, вырезать вокруг образца и место в ткань кассеты поддерживают поролоновыми вставками (рис. 3F).
- Повторите шаги 3.1-3.3 для контроля глаза - Takму обслуживанию препарировать зеркало соответствием полос.
- Обработать все кассеты с помощью стандартных (автоматизированная ночь) метод обработки парафин.
- Вставить обработанных тканей в парафин с боковой быть сокращены первого вниз.
4. Резка и окрашивание
- Вырезать парафиновых блоков в 5 мкм разделы, касающиеся регулярно Записки из шагов 2 и 3.
- Сбор разделов от каждого из окрашенных областей и установить на слайдах.
Области, непосредственно примыкающей к каждой окрашенный место склеры теперь могут быть оценены с уверенностью, что это было в непосредственной близости к соответствующему электроду в массиве (рис. 4).
- Пятно или выполнять иммунофлюоресценции как хотелось бы. Пример пятен и иммуногистохимии показано на рисунке 5 являются: H &E; Luxol быстрый синий (LFB); крезиловым фиолетовым; Массона трехцветный сине; периодические кислоты Шиффа (PAS); Перлза берлинская лазурь STAВ, анти-глутаминсинтетазу (GS); анти-нейрофиламента белка (NF); анти-глиальных фибриллярный кислый белок (GFAP) и 4 ',6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI).
- Стандартные и специальные окрашивали, как описано:
- H & E окрашивание проводили в соответствии с протоколом, прилагаемым к Leica multistainer ванны массив ST5020 (Leica Biosystems).
- LFB и крезиловым фиолетовым (модифицированный из 11):
- Dewax в три изменения ксилола (3 х 2 мин) и 2 изменения этанола (100%, 100%) (2x 1 мин) и полоскание в водопроводной воде (45 сек).
- Гидрат секций 95% этанола.
- Место в LFB решение 11 при 37 - 42 ° C (в течение ночи).
- Смойте избыточного пятна с 70% этанола.
- Промыть в дистиллированной воде.
- Место в разбавленных карбоната лития (8%) (несколько секунд).
- Дифференцировать в 70% этаноле (несколько секунд).
- Промыть в дистиллированной воде.
- Повторяйте шаги с 4.4.2.6 до 4.4.2.8, при необходимости, до Bсправочных бесцветна.
- Место в крезиловым фиолетовым ацетат рабочего раствора при 37 ° С (10 мин).
- Не мойте в воде.
- Высушить в три изменения абсолютного спирта (1x 30 сек, 20 сек 2x) и 3 изменения ксилоле (1x 1 мин 30 сек, 2 х 1 мин).
- Горы и покровного с DPX.
- Массона трехцветный синий (модифицированный из 11):
- Dewax согласно 4.4.2.1.
- Принесите срезы в дистиллированную воду (2 мин).
- Пятно ядер с использованием Weigert железный гематоксилин (2 мин).
- Стирать в водопроводной воде, промыть в дистиллированной воде.
- Пятно в Biebrich алого фуксинсернистой кислотой раствор (5 мин).
- Промыть в дистиллированной воде.
- Дифференцироваться в фосфомолибденового-фосфорновольфрамовая кислоту до коллаген бледно-розового (6 мин).
- Промыть в дистиллированной воде.
- Контрастное в анилин синий (1 мин).
- Хорошо промыть в 1%-ной уксусной кислотой (1 мин).
- Дегидрировать, гора и покровного как пER 4.4.2.12 и 4.4.2.13.
- PAS (модифицированный из 11):
- Dewax согласно 4.4.2.1.
- Oxidize в 1% йодной кислотой (15 мин).
- Мыть в проточной воде, затем дистиллированной водой.
- Пятно в реагента Шиффа (15 мин).
- Стирать в воде (5 мин).
- Контрастное с Харрисом гематоксилином (1 мин).
- Вымойте кратко в водопроводной воде.
- Дифференцировать в 0,5% кислоты спиртом (1 DIP).
- Хорошо промыть в водопроводной воде.
- Синий в водопроводной воде Скотта (1 мин).
- Хорошо промыть в воде.
- Дегидрировать, гора и покровного согласно 4.4.2.12 и 4.4.2.13.
- Перлза прусской синевы, как описано в 11.
- Иммунофлуоресцентное окрашивание проводили, как описано:
- Dewax согласно 4.4.2.1.
- Промыть в дистиллированной водой (2х 5 мин).
- Выполнение поиска антигена использованием 0,01% цитратным буфером, рН 6 при 75 - 80 ° C (20 мин)д дать остыть в 0,01%-ном растворе цитратного буфера (20 мин).
- Мытье секций в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS) (2 х 5 мин).
- Проницаемость клеточной мембраны в промывочном буфере раствора (10 мин).
- Инкубируют в сыворотке решение блоке (2 ч).
- Выдержите разделов в одном первичных антител разводят в антителом разбавителя (10% нормальной козьей serum/0.1% Тритон X-100/PBS) (на ночь в холодильник). Титр каждого первичного антитела использовали показано в таблице 1.
- После инкубации в течение ночи, мыть мыть в разделах буферный раствор (5x 3 мин). С этого момента, держите разделов в темноте.
- Инкубируйте разделы в соответствующие вторичные антитела в титре 1:500 в течение определенного времени (см. таблицу 1 для деталей).
- Вымойте секций в мытье буферным раствором (3x 5 мин).
- Инкубируйте разделы DAPI (1:25000 / PBS) (30 мин).
- Вымойте секций в мытье буферным раствором (3x 5 мин).
- Горы и покровного использованием светитьсяNT монтажная СМИ.
Образцы для испытаний контрольных образцов и готовы к парного сравнения.
Representative Results
На рисунке 4 показана представитель разделе получены от резки образца изображен на рисунке 3. Раздел был вырезан в 5 мкм толщиной и окрашивали H & E в соответствии с методиками, описанными выше. Валовая форма образца полосы сохраняется с минимальной разнице ткани артефактов (рис. 4а). Оба красителя маркировки были видны на склеру, хотя зеленого красителя была более устойчивой, чем красный (фиг.4В). Слоях сетчатки не artifactually отсоединяется, и морфологию сетчатки сохраняется (рис. 4в). Ткань сетчатки, прилегающей к красителем маркировку, которая соответствует расположению электродов в матрице, могут быть легко идентифицированы.
5 показан специальный представитель и иммуногистохимического окрашивания срезов тканей получали в соответствии с текущим протоколом. См. Рисунок 5 captioN и вспомогательных материалов для более подробно на конкретных пятна и модификаций, произведенных с их использованием. После модификации, эти пятна и иммуногистохимии были эквивалентны установленными стандартами - и это будет проверено патологоанатомами.
| Тип первичного антитела и титр (в скобках) | GFAP (1:1500) | NF200 (1:100) | GS (1:100) |
| Тип вторичные антитела и титр (в скобках) | Alexa Fluor 594 | Alexa Fluor 488 | Alexa Fluor 488 |
| Продолжительность инкубации вторичным антителом | 1 час | 2 часа | 45 мин |
Таблица 1. Тип антител, титр и продолжительность маркировки.
Рисунок 1. SuprachoroIdal матрицы электродов Prototype. А) Макро фотография клинической класса формованных массива. B) микрофотография ручной доклинических массива.
Рисунок 2. Бывший сетчатки гистологии. Стандартные гистологические методы были использованы для подготовки этих, H & E окрашенных, участки глаз имплантировали массив электродов супрахориоидальном.) Ортогональных разрез полости матрицы электродов (изображена звезда). Сетчатки отсоединяется от внешней ткани глаза. Это особенно очевидно под имплантированным региона (стрелка). Невозможно определить, какая часть сетчатки примыкает к каждому отдельному электроду массива. Масштабная линейка = 1 мм. B) с большим увеличением в штучной упаковке в области панели. Есть несколько, регулярно расположенных, артефакты в сетчатке ЛэРТС (стрелки), а также основные отрыва от тапетума слой (отражающего слоя в кошачий глаз). Масштабная линейка = 100 мкм. C) с большим увеличением в штучной упаковке региона на панели В. Стрелка указанных наружных сегментов фоторецепторов, а также пигментный эпителий, которые остаются нетронутыми, предполагая, что отделение было искусственной побочный эффект обработки, в отличие от быть вызваны в естественных условиях травмы или патологии. Масштабной линейки = 20 мкм.
Рисунок 3. Локализация и рассечение электродов соседних тканей. Н.э.) Высокий динамический диапазон макро фотографии энуклеированными глазом, с супрахориоидальном массива электродов на месте.) Сообщение фиксируется фиксатором Дэвидсона, а до удаления массива, полупрозрачные склеры позволяет визуализироватьотдельные электроды в массиве (одного примера показано стрелкой). B) электроды выделены заранее определенный цвет красителя. C) краска маркировки на регулярных расстояниях от анатомических ориентиров используются для поддержания согласованности между экспериментами. D) После удаления Массив, глаз расчленена руку в образце полос. Цветные стрелки показывают два электрода соседних участков на склеру. Желтый пунктирная линия указывает плоскости срезов. E) Макро-фотографии полоска образца встроена в агар блока. F) Макро фотография агар-вставки полоски образца от панели Е, вырезаны и помещены в кассету вложение поддерживается губки биопсии свести к минимуму движение секции в процессе обработки.
Рисунок 4. Новый сетчатки гистологии. Чонг> выше полоска образца (на рисунке 3D), содержащая электрод кармане, был парафин, срезы по 5 мкм и окрашивали H & E. A), зеленый и красный окрашенных областей (указано стрелками, так же как рисунок 3D) видны разрез на уровне желтого пунктирной линией на фиг 3D. Шкала бар = 1,000 мкм. Сетчатка не отсоединяется, ни под группой кармана, ни удаленно. B) коробку области от панели с видимым красным и зеленым красителем, указанном стрелками, и сохранности сетчатки во всем. Шкала бар = 500 мкм. C) коробку от региона Панель В, показывая нетронутыми, прилагается, сетчатки, прилегающих к зеленым красителем. Шкала бар = 50 мкм. Зная, что расположение краситель указывает положение электрода, можно с уверенностью оценить соседние ткани сетчатки на наличие повреждений, если таковые имеются, вызванной электрическим стимулированием.
Рисунок 5. Примеры изменение сетчатки cytohistochemistry помощью специальных пятен и иммунофлюоресценции. Использование фиксатора Дэвидсона, в отличие от стандартных методов фиксации формалином, требуются изменения в обычные протоколы окрашивания, как указано в основном тексте протокола. Патологоанатомов подтвердили, что эти модификации привели к эквивалентным окрашивания.) H &E; гематоксилином пятна клеточных ядер фиолетовый в то время как эозином пятна цитоплазме клеток, коллаген и поддерживающей ткани различных оттенков розового цвета. B) LFB пятна миелина синий цвет, а контрастирующая крезиловым фиолетовым может быть использован для . выявления ганглиозных клеток путем окрашивания Ниссля органов в рамках перикариона синий и подчеркнув спутниковой клетки, окружающие клетки C) Массона трехцветный сине; Biebrich алой кислоты фуксин решение пятна мышц Fiнов красный, в то время как анилин голубой окраски коллагена, в данном случае склеры, синий D) PAS;. гликопротеин компонентов базальной мембраны и компоненты соединительной ткани окрашивали фиолетовый, в то время как гематоксилином counterstains клеточных ядер фиолетовый E) Перлза берлинскую лазурь.; в месте кровотечения, образование гемосидерина из деградированных эритроцитов и выделение железа производит комплексы фиолетового цвета в то время как добавление нейтральных красное пятно красного цвета лизосом F) GS;. этого нейротрансмиттера фермент в клетках Мюллера 13 (зеленый ), можно видеть, проходящих в обоих направлениях с клеткой Мюллера органов во внутреннем ядерном слое и Мюллера клетки endfeet образующий внутреннюю ограничивающую мембрану G) NF-200;. этой тяжелой цепи белка цитоскелета (зеленый), найденные в сомы клеток и процессы , поперечные связи с другими нейрофиламенты для сохранения структуры нейронов 14,15. Ганглийклеток и их аксонов можно увидеть в слое ганглиозных клеток и слой нервных волокон, в то время как аксоны горизонтальных клеток, расположенных на внешней границы внутреннего ядерного слоя в кошачьих сетчатки, также выделены. Контрастного с DAPI (синий) позволяет визуализировать слои сетчатки H) GFAP;. Эта белка цитоскелета (красный) распространение в клетках Мюллера и астроцитов в течение глиозом 16, можно видеть, выстилающих слой нервных волокон с клетками Мюллера формирования тонких расширений через внутреннюю чтобы внешние слои сетчатки. Контрастного с DAPI (синий) позволяет выводить слоев сетчатки. Шкала бар = 50 мкм на всех панелях. Внутренний сетчатки показано в верхней части каждого изображения; внешней сетчатки показано в нижней части каждого изображения, за исключением Панель Е, которое показывает subscleral реакции.
Discussion
Оценке безопасности имплантата первоочередное внимание для проведения доклинических исследований. Перед протез сетчатки могут быть имплантированы в организме человека очень важно убедиться, что это не вызовет никакого вреда. Это требует оценки как биосовместимость имплантата 17-23, а также любой потенциальный ущерб, который может быть вызвано хроническим электрической стимуляции 24-26. Опыт работы с подобными нейронных протезов, такие как кохлеарный имплантат, дает представление о широком диапазоне стимуляции, и физических, параметров, которые не вызывают повреждение тканей 27. Тем не менее, сетчатка имеет различные характеристики на других сайтах имплантации и поэтому точный пределы безопасности (например, максимальная плотность заряда) не может предположить из предыдущих исследований в других системах. Плотности заряда являются самыми высокими в активных центрах электрода и это соответствует, имеющие наибольший потенциал для повреждения. Поэтому способ локализации ткани в непосредственной близостив отдельных активных электродов значительно увеличит полезность этих исследований. Ткани, прилегающей к конкретным регионам имплантата также могут выделяться, для детального изучения. Этот целевой подход позволяет меньше разделов, которые будут проанализированы, сохраняя уверенность, что "наихудший сценарий" был рассмотрен.
Склеральное метода локализации красителя описанные здесь был тщательно протестирован с ручной формы и формованные силиконовые / массивы Pt электрода 28-30. Он был использован с тонкопленочными полиамид 7,31 массивов, а также тонкопленочных силиконовых / Pt массивов 32. Некоторые исследования протез сетчатки занятых "в форме пули" электродов с интрасклеральный имплантаций 33. В настоящем техники должно быть эффективным для оценки этого типа электрод массивов. Кошачьего глаза с тонкой склеры (толщина в заднем полюсе 90 - 200 мкм) позволило визуализации отдельных электродов в массиве. Тем не менее, даже если отдельные электродез не были видны, их позиции могут быть легко выведены использованием силиконового шаблона при контур массива можно увидеть (аналогичный используемому в шаге 2.6).
Краситель отображение ограничивает необходимость получения нерелевантные срезов тканей, как только участки с красителем настоящее получаются. Способность точно вывести положения электродов позволяет не только соответствующие гистопатологического анализа и большей статистической мощности, но имеет большое влияние на время и стоимость управления за счет сокращения количества слайдов и лезвия использоваться, а также расходы на оплату труда. Использование красителя, который является приверженцем и может выдержать обработки ткани в то время также видна в неокрашенных срезов тканей является важным первоначального рассмотрения. Знание расположения краситель и ориентацию ткани при вскрытии и во время встраивания помогает процесса резки. Это включает в правильной ориентации блока для достижения секцию, которая не косым срезом и дает полное representatiна ткани. Поэтому важно, что лицо, осуществляющее резки присутствует во время краситель приложений, рассечение и вложение.
Общий протокол является устойчивым к незначительному изменению, в частности, с фиксацией таймингов. Тем не менее, рассечение глаза и красителем маркировку шаги деликатных хирургических вмешательств, которые выигрывают от хорошей ловкости рук, чтобы избежать повреждения образца. В то время как фиксатор Дэвидсон оказался эффективным для снижения искусственной отряд сетчатки вблизи имплантата, это не мешает прямого механического повреждения во время вскрытия. Фиксатором Дэвидсона не было легко совместимы с некоторыми специальными гистологических и иммуногистохимических процедур. Поэтому существует необходимость изменить / оптимизировать эти шаги как описано выше. Дополнительные изменения в окрашивании раза и концентрации были сделаны до достижения оптимального результата достигнуто не было - для более подробной информации, обратитесь к дополнительным материалам.
Количественная оценка сетчаткигистологии остается проблематичным. Сетчатка неоднородных и оба толщины и изменение плотности клеток с увеличением расстояния от области Centralis 34,35. Таким образом, соседние ткани в имплантированный глаз не может быть использована для сравнения и контрольный глаз используется вместо этого. Попарно соответствующие каждой секции с контролем глаза дает нам более мощные статистические сравнения патологических изменений; эффективности и безопасности результатов с протезирования сетчатки лучше оценивать при сравнении парных глазах в теме 36. Особое внимание должно быть принято, чтобы минимизировать наклонного среза, как это может повлиять на количественной оценке.
Таким образом, способы, описанные выше, значительно улучшили гистопатологические анализа, который в свою очередь привело к более эффективному доклинических процесса. Результаты доклинических исследований с использованием этих методов непосредственно привело к клиническому испытанию, в котором 3 RP пациентов были благополучно имплантировали suprachoroiДал сетчатки протезов. Эти методы являются актуальными как для сетчатки стимуляторов и других глазных имплантатов, где патологический ответ на долгосрочные имплантация должна быть оценена. С помощью этого метода стоит преимуществ для поддержания цитоархитектонике и регистрация патологии регионах, представляющих интерес на имплантат. Хотя это специально не проверены, модификации этих процедур может быть использован в других видах и других анатомических местах, особенно там, где массив имплантируется поверхностно.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы выражают благодарность: г-жа Alexia Сондерс и г-жа Мишель McPhedran для экспериментальных помощи; г-жа Хелен Фэн для изготовления электродов, д-р Пенни Аллен и доктор Джонатан Йео для хирургической помощи; штаба Королевский Викторианский глаз и ушей больницы Биологические Научно-исследовательский центр по уходу за животными; Профессор Роб овчарки для создания общего представления по всему, и д-р Бриони Nayagam и г-н Рональд Люн за критические замечания по проекту форме рукописи.
Эта работа была выполнена в Институте бионики и больницы Св. Винсента, Мельбурн. Финансирование было предоставлено Яна Поттера, Фонд Джона Рида T Благотворительные фонды, и Австралийского совета исследований через своего Специального научно-исследовательской инициативы в Bionic науке и технике Видение грант Bionic видения Австралии (BVA). Бионика института благодарит за поддержку он получает от правительства штата Виктория в рамках своей оперативной программы поддержки инфраструктуры.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| The Davidson marking system | Bradley Products | 1163-4 - red 1163-5 - blue 1163-2 - yellow 1163-1- green | |
| Rabbit Polyclonal Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody | Millipore | AB5804 | 1:1500, overnight incubation |
| Mouse Monoclonal Anti-Glutamine Synthetase Antibody | Millipore | MAB302 | 1:100 overnight incubation |
| Monoclonal Mouse Anti-Neurofilament 200 Antibody | Sigma-Aldrich | N0142 | 1:100 overnight incubation |
| 4',6-diamindino-2-phenylindole, dilactate (dilactate) | Life Technologies | D3571 | 1:25,000 30 min incubation |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A11029 | 1:500 |
| Superfrost 90° yellow | Grale Scientific | SF41299 | |
| FLEX IHC Microscope Slides | DAKO | K802021-2 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A11037 | 1:500 |
| Normal goat serum | Life Technologies | PCN5000 | 10% serum/0.1% Triton X-100/PBS |
| Non-Standard Solution Preparation for Special Stains 1% Aqueous Cresyl Violet Stock Solution
Cresyl Violet Acetate Working Solution
Biebrich Scarlet-Acid Fuchsin Solution
Phosphomolybdic-Phosphtungstic Acid Solution
Aniline Blue Solution
Solutions for Immunohistochemistry Wash Buffer Solution
Serum Block Solution
SUPPLEMENTARY MATERIAL Luxol Fast Blue The purpose of performing a Luxol Fast Blue (LFB) stain was to identify the ganglion cells in the ganglion cell layer through the counterstain of cresyl violet. While LFB stains myelin, the cresyl violet stain binds to the Nissl substances in neurons, composed of rough endoplasmic reticulum and ribosomes. Numerous cells in the retina contain Nissl substance including amacrine cells. These cells usually are located in the inner boundary layer of the inner nuclear layer, but displaced amacrine cells can be found in the ganglion cell layer. The staining of Nissl substance is helpful in differentiating large, heavily stained ganglion cells from smaller displaced amacrine cells. To aid visualisation of these cells, we modified the cresyl violet working solution protocol by increasing the volume of the cresyl violet stock solution in the working solution. We increased the volume in 1.0 ml increments from 6.0 ml to 9.0 ml, in turn reducing the volume of distilled water. Assessing the ease of visualising and identifying the ganglion cells, optimal staining was achieved with 9 ml of additional cresyl violet stock solution and 51 ml of distilled water. Cresyl violet is a basic dye, though to dye the Nissl substance, it is required to be used in an acidic solution, and therefore the volume of acetic acid remained unchanged at 0.5 ml. Periodic Acid Schiff The Periodic Acid Schiff (PAS) stain was performed to highlight polysaccharides especially glycogen, found in basement membranes and fungal cell walls, indicating a fungal infection. The process of the PAS stain is to oxidise the hydroxyl groups in polysaccharides using periodic acid, producing aldehyde groups. The application of the Schiff reagent, binds to the aldehyde groups producing a magenta color with haematoxylin counterstaining producing purple cell nuclei. Our slides showed weak staining at the inner limiting membrane. This may be due to the polysaccharides present, as not all polysaccharides can be oxidised with a standard time frame, especially those containing anionic polysaccharides. We therefore increased the duration of the oxidation step from 10 min to 12, 15, and 20 min. We found that a 15 min oxidation step was most effective in PAS staining. Masson’s Trichrome Blue The principle of the Masson's trichrome blue stain is to stain collagen and muscle, which in our retinal slides can be used to indicate an increase in collagen tissue which may indicate fibrosis due to injury. This stain is sensitive to fixation techniques, so alterations were needed to obtain optimal staining. The process of this stain is to initially stain cytoplasm and muscle fibres red using the acidic Biebrich scarlet-acid fuchsin red dye. Differentiation with phosphomolybdic/phosphotungstic acid competes with the red dye in the collagen fibres. In the sclera, the large phosphomolybdic/phosphotungstic acid molecules are able to penetrate the loose connective tissue, as opposed to the dense muscle fibres which are penetrable to small molecules only. Aniline blue dye is then applied to replace the acid in the collagen fibres producing blue dyed sclera. To optimise this stain in retinal sections, the duration of staining with Biebrich scarlet-acid fuchsin dye was reduced to create a balance between the blue and the red dye. The use of Davidson's fixative also required an extended differentiation time to remove the red dye from the collagen. We trialled differentiation at 5, 6, 8, and 10 min, with optimal results occurring at 6 min. Differentiation also varies on the thickness and cutting of smooth sections, with greater than 6 min differentiation possibly being required. Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Antibody Polyclonal, host species is rabbit, has a molecular weight of 50 kDa. GFAP antigen is an intermediate filament found in the cytoplasm (the cytoplasm of astrocytes and Müller cells in the retina), the antigen is made form 428 amino acids and has a molecular weight of 49512 Da. Neurofilament-200 antibody Monoclonal, host species is mouse, clone N52, isotype IgG1, it recognises phosphorylated and non-phosphorylated forms of the heavy neurofilaments which have a molecular weight of 200 kDa. The antibody will bind to an epitope in the tail domain of the neurofilament. The antibody will stain neurofilaments in the neuronal perikarya, dendrites and axons. Glutamine Synthetase (GS) antibody Monoclonal, clone GS-6, host species is mouse, has a molecular weight of 45 kDa and antibody isotype IgG2a. The GS antigen is found in the cell cytoplasm (cytoplasm of Müller cells in the retina), the antigen has 373 amino acids and a molecular weight of 42,064 Da. |
|||
References
- Santos, A., Humayun, M. S., et al. Preservation of the inner retina in retinitis pigmentosa. Arch. Ophthalmol. 115, 511-515 (1997).
- Humayun, M. S., Weiland, J. D., et al. Visual perception in a blind subject with a chronic microelectronic retinal prosthesis. Vision Res. 43, 2573-2581 (2003).
- Roessler, G., Laube, T., et al. Angiographic findings folowing tack fixation of a wireless epiretinal retina implant device in blind RP patients. Graefes. Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 249, 1281-1286 (2011).
- Chow, A. Y., Chow, V. Y., et al. The artificial silicon retina microchip for the treatment of vision loss from retinitis pigmentosa. Arch. Ophthalmol. 122, 460-469 (2004).
- Zrenner, E., Bartz-Schmidt, K. U., et al. Subretinal electronic chips allow blind patients to read letters and combine them to words. Proc. R. Soc. B. 278, 1489-1497 (2011).
- Fujikado, T., Kamei, M., et al. Testing of semichronically implanted retinal prosthesis by suprachoroidal-transretinal stimulation in patients with retinitis pigmentosa. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 4726-4733 (2011).
- Villalobos, J., Allen, P. J., et al. Development of a surgical approach for a wide-view suprachoroidal retinal prosthesis: evaluation of implantation trauma. Graefes. Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 250, 399-407 (2012).
- Latendresse, J. R., Warbittion, A. R., Jonassen, H., Creasy, D. M. Fixation of testes and eyes using a modified Davidson's fluid: comparison with Bouin's fluid and conventional Davidson's fluid. Toxicol. Pathol. 30, 524-533 (2002).
- Agrawal, R. N., He, S., et al. In vivo models of proliferative vitreoretinopathy. Nat. Protoc. 2, 67-77 (2007).
- Margo, C. E., Lee, A. Fixation of whole eyes: the role of fixative osmolarity in the production of tissue artifact. Graefes. Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 233, 366-370 (1995).
- Bancroft, J. D., Gamble, M. Theory and practice of histological techniques. , 6, Churchill Livingstone. (2008).
- Horobin, R. W., Bancroft, J. D. Troubleshooting histology stains. , Churchill Livingstone. (1998).
- Pow, D. V., Robinson, S. R. Glutamante in some retinal neurons is derived solely from glia. Neuroscience. 60, 355-366 (1994).
- Lewis, S. E., Nixon, R. A. Multiple phosphorylated variants of the high molecular mass subunit of neurofilaments in axons of retinal cell neurons: characterization and evidence for their differential association with stationary and moving neurofilaments. J. Cell Biol. 107, 2689-2701 (1988).
- Ruiz-Ederra, J., García, M., Hicks, D., Vecino, E. Comparative study of the three neurofilament subunits within pig and human retinal ganglion cells. Mol. Vis. 10, 83-92 (2004).
- Bringmann, A., Pannicke, T., et al. Müller cells in the healthy and diseased retina. Prog. Retin. Eye Res. 25, 397-424 (2006).
- Seo, J. M., Kim, S. J., et al. Biocompatibility of polyimide microelectrode array for retinal stimulation. Mater. Sci. Eng. C. 24, 185-189 (2004).
- Gerding, H., Benner, F. P., Taneri, S. Experimental implantation of epiretinal retina implants (EPI-RET) with an IOL-type receiver unit. J. Neural Eng. 4, S38-S49 (2007).
- Majji, A. B., Humayun, M. S., et al. Long-term histological and electrophysiological results of an inactive epiretinal electrode array implantation in dogs. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 40, 2073-2081 (1999).
- Walter, P., Szurman, P., et al. Successful long-term implantation of electrically inactive epiretinal microelectrode arrays in rabbits. Retina. 19, 546-552 (1999).
- Pardue, M. T., Stubbs, E. B. Jr, et al. Immunohistochemical studies of the retina following long-term implantation with subretinal microphotodiode arrays. Exp. Eye Res. 73, 333-343 (2001).
- Gekeler, F., Szurman, P., et al. Compound subretinal prostheses with extra-ocular parts designed for human trials: successful long-term implantation in pigs. Graefes. Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 245, 230-241 (2007).
- Montezuma, S. R., Loewenstein, J. I., Scholz, C., Rizzo, J. F. III Biocompatibility of materials implanted into the subretinal space of Yucatan minipigs. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 47, 3514-3522 (2006).
- Montezuma, S. R., Loewenstein, J. I., Scholz, C., Rizzo, J. F. III Biocompatibility of materials implanted into the subretinal space of Yucatan minipigs. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 47, 3514-3522 (2006).
- Ray, A., Colodetti, L., et al. Immunocytochemical analysis of retinal neurons under electrical stimulation. Brain Res. 1255, 89-97 (2009).
- Nakauchi, K., Fujikado, T., et al. Threshold suprachoroidal-transretinal stimulation current resulting in retinal damage in rabbits. J. Neural. Eng. 4, S50-S57 (2007).
- Shepherd, R. K., Murray, M. T., Houghton, M. E., Clark, G. M. Scanning electron microscopy of chronically stimulated platinum intracochlear electrodes. Biomaterials. 6, 237-242 (1985).
- Villalobos Villa, J. Safety of a Wide-Field Suprachoroidal Retinal Prosthesis. , The University of Melbourne. (2012).
- Nayagam, D. A. X., Allen, P. J., et al. A Pre-Clinical Model for Chronic Electrical Stimulation of the Retina via Suprachoroidal Electrodes. Association for Research in Vision and Ophthalmology Annual Meeting, Fort Lauderdale, Florida, USA, , (2012).
- Nayagam, D. A. X., Villalobos, J., et al. A Suprachoroidal Retinal Prosthesis is Safe in a Chronic Implantation Model. in Vision and Ophthalmology Annual Meeting., Vol. 4928/A327. Association for Research in Vision and Ophthalmology Annual Meeting, Fort Lauderdale, Florida, USA, , (2011).
- Cicione, R., Shivdasani, M. N., et al. Visual cortex responses to suprachoroidal electrical stimulation of the retina: effects of electrode return configuration. J. Neural Eng. 9, 036009 (2012).
- Schuettler, M., Stiess, S., King, B. V., Suaning, G. J. Fabrication of implantable microelectrode arrays by laser cutting of silicone rubber and platinum foil. J. Neural Eng. 2, S121-S128 (2005).
- Morimoto, T., Kamei, M., et al. Chronic implantation of newly developed suprachoroidal-transretinal stimulation prosthesis in dogs. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 6785-6792 (2011).
- Bron, A. J., Tripathi, R. C., Tripathi, B. J. Wolff's anatomy of the eye and orbit. , Arnold. (2001).
- Stein, J. J., Johnson, S. A., Berson, D. M. Distribution and coverage of beta cells in the cat retina. J. Comp. Neurol. 372, 597-617 (1996).
- Dagnelie, G. Psychophysical evaluation for visual prosthesis. Annu. Rev. Biomed Eng. 10, 339-368 (2008).
