تقنيات لمعالجة العيون تزرع لهم تعويضات الشبكية لتحليل المرضية المترجمة

Summary

تقنيات لتصور التهندس الخلوي الشبكية المجاورة مباشرة لأقطاب الفردية داخل مشجعا في شبكية العين.

Abstract

مع التطورات الأخيرة في شبكية العين الاصطناعية، فمن المهم لتطوير تقنيات موثوق بها لتقييم سلامة هذه الأجهزة في الدراسات قبل السريرية. ومع ذلك، فإن تثبيت القياسية، وإعداد، والإجراءات الأنسجة الآلي ليست مثالية. نحن هنا وصف الإجراءات الجديدة لتقييم صحة شبكية العين المجاورة مباشرة إلى الزرع. الأطراف الاصطناعية الشبكية تحتوي صفائف الكهربائي في اتصال مع أنسجة العين. لم تكن الطرق السابقة قادرة على توطين مكانيا أنسجة العين المجاورة لأقطاب فرد داخل مجموعة. وبالإضافة إلى ذلك، وتجهيز النسيجية القياسية في كثير من الأحيان يؤدي إلى انفصال مصطنعة الإجمالي من طبقات شبكية العين عند تقييم عيون مزروع. وبناء على ذلك، فقد كان من الصعب تقييم الأضرار المحلية، إذا كان موجودا، والناجمة عن زرع والتحفيز من صفيف القطب المزروع. لذلك، قمنا بتطوير طريقة لتحديد وإضفاء الطابع المحلي على الأنسجة العين المجاورة له مزروعlectrodes باستخدام (مرمزة) صبغ مخطط وضع العلامات، ونحن المعدلة تقنية تثبيت العين للحد من انفصال الشبكية مصطنعة. كما أصدرت هذه الطريقة شفافة الصلبة، وتمكين التوطين من الأقطاب الكهربائية الفردية وأجزاء معينة من الزرع. أخيرا، استخدمنا عنصر تحكم مطابقة لزيادة قوة التقييمات التشريحية المرضية. في ملخص، تمكن هذه الطريقة التمييز موثوقة وفعالة وتقييم التهندس الخلوي الشبكية في العين مزروع.

Introduction

قد تصبح طرفا اصطناعيا الشبكية قريبا التدخلات السريرية مفيدة لعلاج مختلف أشكال فقدان البصر الشديد. ظروف معينة، مثل التهاب الشبكية الصباغي (RP)، نتيجة في انحطاط واسع النطاق للخلايا مستقبلة للضوء في العين، وهذه هي الخلايا المسؤولة عن transducing الضوء إلى إشارات العصبية. ومع ذلك، تظل بعض الخلايا في طبقات أخرى من شبكية العين وتكون أهدافا محتملة للالتحفيز الكهربائي مع الشبكية بدلة ^1. النتائج في وقت مبكر من تجارب اكلينيكية على البشر واعدة للصفائف القطب مزروع في ^2،3 فوق الشبكي، تحت الشبكية ^4،5، وداخل الصلبة ⁶ مواقع. وتتكون هذه الأجهزة من مواد مختلفة ذات أشكال مختلفة، ولكن عليهم ان يستخدموا كل النبضات الكهربائية لتنشيط الخلايا العصبية قابلة للحياة المتبقية من الشبكية من أجل خلق رؤيتين البصرية.

وقد وضعت لدينا مجموعة أوسع (بيونيك الرؤية أستراليا) زرع شبكية العين التي لديها بروخرسالحوار الاقتصادي الاستراتيجي لدراسة تجريبية سريرية مع 3 مرضى RP مزروع مع صفائف القطب suprachoroidal (السريرية عدد المحاكمة: NCT01603576). الشكل 1A يظهر هذا النموذج suprachoroidal بدلة الشبكية.

سلامة المريض أمر بالغ الأهمية في الدراسات السريرية، وبالتالي، قبل بدء التجارب على الانسان، أجرينا اختبار الحادة والمزمنة واسعة في نماذج ما قبل السريرية (1B الشكل). تقييم التشريحية المرضية ضرورية لتحسين العمليات الجراحية، يكرر من خلال تصميم الكهربائي، ووضع في نهاية المطاف سلامة زرع. للحفاظ على سير العمل بكفاءة تتوافق مع الممارسات الباثولوجيا الإكلينيكية القياسية، كان يعمل تقنية التضمين البارافين. كان من المستحسن أيضا للاستفادة من الإجراءات تلطيخ مقارنة مع المعايير السريرية، مثل haematoxylin ويوزين (H & E)، التي يتم تفسيرها بسهولة من قبل الأطباء. أردنا أيضا تقنية التي يمكن تكييفها لتحليلات المناعى، فيبغية مواصلة تيسير تقييم الخلوي للأنسجة.

توافق مع الحياة من المواد المستخدمة في زراعة، وسلامة التحفيز الكهربائي المزمنة، والحاجة إلى إجراء تقييم دقيق. من المهم أن تكون قادرة على دراسة التشريح المرضي للأنسجة العين المجاورة لتحفيز كهربائي فرد داخل مجموعة. ومع ذلك، فإن صفائف ثمة حاجة لإزالة قبل معالجة العينات بحيث يمكن اختبارها، ولأن مكوناتها المعدنية لا يمكن أن يكون مقطوع بسهولة. ونتيجة لذلك، لم إعداد لدينا الأنسجة راسخة لا تسمح التعريب ورسم الخرائط من الأنسجة فيما يتعلق أقطاب كهربائية مزروعة ^7. بالإضافة إلى عدم وجود طريقة التعريب الأنسجة، ونتج عن تثبيت المستندة إلى الفورمالديهايد القياسية وتقنيات معالجة القطع الأثرية في نطاق واسع ومفرزة من شبكية العين بسبب إلى انكماش الفرق من مختلف الطبقات من العين (الشكل 2). ونظرا لعدم تجانس رانه شبكية العين، كان من الصعب إجراء مقارنات سليمة مع الأنسجة السيطرة، ولا سيما بالنسبة للقياسات الكمية. هذه القيود مجتمعة معقدة تقييمات دقيقة للأضرار المحتملة الناجمة عن صفائف لدينا مزروع.

هنا نقدم تقنيات رواية للتغلب على هذه القيود. قمنا بتعديل التثبيت وتجهيز التقنيات العين ^8-10 المتخصصة للحفاظ على التوافق مع الأنسجة المحتوية على البارافين. قمنا بتعديل البقع النسيجية والمناعية موحدة لتقديم نتائج قابلة للمقارنة، على أساس التغذية المرتدة من علم الأمراض السريرية. بعد جعل شفافة الأنسجة الصلبة، كان يعمل المستندة إلى صبغ لون رمز للاحتفال الأنسجة العين المجاورة لبعضها القطب الفردية، قبل إزالة مجموعة من الفضاء suprachoroidal. عن طريق وضع علامة مجموعة القطب والقطب المواقع الفردية، والعينات ويمكن جمع بدقة من المناطق المجاورة القطب. يمكن جمع عينات مطابقة من اله العين التحكم في النظام لتسهيل المقارنات البشرى.

Protocol

1. قلع وبعد التثبيت

يفترض هذا البروتوكول أن الموضوع قد تم زرعها من طرف واحد مع مجموعة القطب suprachoroidal.

1. إعداد الحلول POSTFIX في زجاج زجاجات شوت.
   1. حل ديفيدسون تثبيتي، 2X 100 مل
      • 2 مل الفورمالين (37٪ فورمالدهيد)
      • 10 مل حمض الخليك الجليدي (99.7٪)
      • 35 مل ايثانول (98٪)
      • 53 مل من الماء المقطر
   2. 50٪ من الإيثانول، 2X 100 مل
   3. 70٪ من الإيثانول، 2X 100 مل
2. يروي Transcardially الموضوع مع دافئ (37 درجة مئوية) المالحة heparinized تليها الباردة (4 ° C) محايدة مخزنة الفورمالين (10٪).
3. ربط الغرز في حوف متفوقة (أو موقع غير بعيد من مجموعة suprachoroidal) من كلتا العينين - تماشيا مع العضلات المستقيمة، لتكون بمثابة علامة فارقة.
4. عيون استأصل، والحفاظ على أي خيوط الخارجية من العين مزروع.
5. وضع مجموعة شرق افريقياح العين في 100 مل من محلول ديفيدسون تثبيتي، وترك لمرحلة ما بعد الإصلاح في درجة حرارة الغرفة.
6. بعد 18 - 36 ساعة في تثبيتي ديفيدسون، ونقل إلى الإيثانول 50٪ (درجة حرارة الغرفة) ل6-8 ساعة، ثم أخيرا إلى الإيثانول 70٪ (درجة حرارة الغرفة).
7. بردت العينات في 4 درجات مئوية وتخزينها حتى تشريح.

وقد تم تخزين الكرات العين سليمة والضغط بهذه الطريقة لمدة تصل إلى 3 أشهر دون أن يؤثر ذلك سلبا على الأنسجة الناتجة.

2. تحديد ورسم الخرائط الأنسجة

بروتوكول تثبيت أعلاه (الخطوة 1) قد أصدرت شفافة الصلبة ومجموعة مرئيا الآن - بما في ذلك مواقع القطب فرد (الشكل 3).

1. إزالة العالم مزروع من الإيثانول وتقليم بعناية بعيدا الأنسجة الزائدة، بما في ذلك الملتحمة وكبسولة تينون. تقليم العصب البصري إلى 2-3 مم طول (الشكل 3A).
2. باستخدام النسيجي صبغ ماركينز مخطط، والتسمية الأقطاب مع رمز اللون محددة مسبقا، مع الحرص على عدم طخة الصبغة.

• اخترنا جناح المتاحة تجاريا من صبغ النسيجية المتخصصة (يرجى الرجوع إلى التذييل). تم تطبيق كميات صغيرة من الصبغة بعناية مع غرامة الرؤوس فرشاة الطلاء (Roymac حجم 00) إلى الأنسجة ويسمح للهواء الجاف لمدة تصل إلى 5 دقائق.
• لأغراضنا، اخترنا: الأخضر للالقطب النشط (ق) التي كان (كانت) حفز الحد الأقصى، على المستويات suprathreshold، لمدة الدراسة؛ الأحمر لأقطاب نشطة أخرى؛ الصفراء لأقطاب أكبر العودة قطر، و الأزرق للأدلة إضافية و / أو علامات مسافة التشريحية (أرقام 3B و3C).
• بعض التجربة والخطأ قد تكون هناك حاجة لإيجاد الصبغة التي هي مستقرة في جميع أنحاء الخطوات اللاحقة. على سبيل المثال، في الشكل (4)، يمكن أن ينظر إليه من أن الصبغة الخضراء كان أكثر مرونة من الصبغة الحمراء. تمييع الصبغة في الايثانول 70٪ يساعد على تحسين penet الدهونالتموينية وطلاء الأنسجة.
• ومن المفيد رسم أو صورة فوتوغرافية في العالم مصبوغ لتكون مرجعا في المستقبل.

3. العودة إلى 70٪ من الإيثانول إلى يذوى الصبغة.
4. كرر الخطوة 2.1 لمراقبة العالم unimplanted.
5. باستخدام الخيوط الجراحية من الخطوة 1.3، محاذاة العين تحكم والعين مزروع كزوج لها نسخ متطابقة.
6. وضع قالب سيليكون (مع نفس الأبعاد بوصفها مجموعة الكهربائي) في الموقع معكوسة على العين السيطرة حيث يقع على زرع العين مزروع (NB الصلبة العينية شفافة وعلامات صبغ من الخطوة 2.2 سماح التصور استعداد لموقف مجموعة مزروع ).
7. تنفيذ الخطوات 2.2 و 2.3 للعين التحكم، بحيث يكون كل موقع القطب المزروع لديه زوج التحكم في موقع مشابه تشريحيا (أي مرآة مطابقة ما يعادلها).

3. تشريح وتضمينها

1. إزالة مجموعة من زرع العين وإزالة الجزء الأمامي من العين(بما في ذلك القرنية، القزحية والعدسة). إزالة السائل الزجاجي من كأس العين المتبقية (الغرفة الخلفية).
2. تشريح العين مزروع إلى شرائح متعددة ممثل (~ 2 مم سماكة) تحتوي كل منها على مجموعة فرعية من المناطق صبغ ملحوظ (الشكل 3D). لاحظ أن التوجه للشرائط يجب أن يكون محددا للمساعدة في تقييم الجوانب المختلفة للاستجابة الأنسجة لزرع ^7.

ومن المفيد، لتكون مرجعا في المستقبل، لجعل رقما قياسيا من المناطق التي صبغ موجودة على كل قطاع ومواقعها النسبية (والألوان).

3. وضع الشريط على جانبها في بركة ضحلة من أجار المسال (4٪؛ 80-90 ° C) مع الجانب لا بد من تخفيض نزولا تواجه أول (الشكل 3E).
4. مرة واحدة وقد وضعت آغار، قطع حول العينة ومكان في شريط الأنسجة التي تدعمها إدراج رغوة (الشكل 3F).
5. كرر الخطوات من 3،1-3،3 للعين التحكم - تاكالرعاية جي لتشريح مرآة مطابقة شرائط.
6. معالجة كافة أشرطة عبر البارافين تقنية قياسية (الآلي بين عشية وضحاها) وتجهيز.
7. تضمين الأنسجة المصنعة في البارافين مع الجانب لا بد من تخفيض نزولا تواجه أول.

4. قطع وتلطيخ

1. قطع كتل البارافين إلى 5 أقسام ميكرون اشارة منتظمة إلى الملاحظات من الخطوات 2 و 3.
2. جمع المقاطع من كل منطقة من المناطق المصبوغة وجبل على الشرائح.

المنطقة المتاخمة فورا إلى كل بقعة من مصبوغ الصلبة ويمكن الآن أن تقيم مع الثقة أنه كان في القرب الاقرب الى القطب المقابل في مجموعة (الشكل 4).

3. وصمة عار أو أداء المناعي كما تريد. البقع سبيل المثال والمناعية هو مبين في الشكل (5) هي: H والتقييم؛ Luxol سريع الأزرق (LFB)؛ البنفسجي الكريزيل؛ ثلاثي الألوان ماسون في الزرقاء؛ الدوري حمض شيف (PAS)؛ بيرلز زرقة بروسيا ستافي؛ مخلقة مكافحة الجلوتامين (GS)؛ بروتين مضاد للخيط عصبي (NF)؛ المضادة للالدبقية ييفي البروتين الحمضية (GFAP) و 4 '،6-diamidino-2-phenylindole (دابي).
4. أجريت البقع القياسية والخاصة على النحو المفصل:
   1. تم إجراء H & E تلطيخ وفقا لبروتوكول تقدمها لايكا multistainer حمام مجموعة ST5020 (لايكا النظم البيولوجية).
   2. البنفسجي LFB والكريزيل (معدلة من ^11):
      1. Dewax في 3 تغييرات الزيلين (3X 2 دقيقة) و 2 تغييرات من الإيثانول (100٪، 100٪) (2X 1 دقيقة)، وشطف في ماء الصنبور (45 ثانية).
      2. أقسام هيدرات إلى 95٪ من الإيثانول.
      3. المكان في حل LFB ¹¹ في 37-42 درجة مئوية (بين عشية وضحاها).
      4. شطف الزائدة وصمة عار مع الايثانول 70٪.
      5. شطف في الماء المقطر.
      6. مكان في كربونات الليثيوم المخففة (8٪) (بضع ثوان).
      7. التفريق في الايثانول 70٪ (بضع ثوان).
      8. شطف في الماء المقطر.
      9. كرر الخطوات من 4.4.2.6 إلى 4.4.2.8، إذا لزم الأمر، حتى بackground هو عديم اللون.
      10. مكان في الكريزيل البنفسجي خلات حل العاملة عند 37 ° C (10 دقيقة).
      11. لا يغسل في الماء.
      12. يذوى في 3 تغييرات من الكحول المطلق (1X 30 ثانية، 20 ثانية 2X) و 3 تغييرات الزيلين (1X 1 دقيقة و 30 ثانية، 2X 1 دقيقة).
      13. جبل وساترة مع DPX.
   3. ثلاثي الألوان ماسون في الزرقاء (معدلة من ^11):
      1. Dewax حسب 4.4.2.1.
      2. جلب المقاطع على المياه (2 دقيقة).
      3. وصمة عار على النوى باستخدام الحديد haematoxylin بحسب فايغرت (2 دقيقة).
      4. تغسل في ماء الصنبور، وشطف في الماء المقطر.
      5. وصمة عار في Biebrich القرمزي الحمضية حل فوكسين (5 دقائق).
      6. شطف في الماء المقطر.
      7. التفريق في حمض الفسفومولبديك-الفسفوتنغستيك حتى الكولاجين وردي شاحب (6 دقائق).
      8. شطف في الماء المقطر.
      9. مباين في زرقة الأنيلين (1 دقيقة).
      10. يغسل جيدا في حامض الخليك 1٪ (1 دقيقة).
      11. يذوى، وجبل ساترة كما عإيه 4.4.2.12 4.4.2.13 و.
   4. PAS (معدلة من ^11):
      1. Dewax حسب 4.4.2.1.
      2. أكسدة حامض في الدوري 1٪ (15 دقيقة).
      3. يغسل في المياه الجارية الماء ثم المقطر.
      4. وصمة عار في كاشف شيف (15 دقيقة).
      5. يغسل في الماء (5 دقائق).
      6. مباين مع هاريس haematoxylin (1 دقيقة).
      7. غسل لفترة وجيزة في مياه الحنفية.
      8. التفريق في 0.5٪ كحول حامض (1 مجمع دبي للاستثمار).
      9. يغسل جيدا في ماء الصنبور.
      10. الأزرق في مياه الحنفية سكوت (1 دقيقة).
      11. يغسل جيدا في الماء.
      12. يذوى، وجبل ساترة وفقا 4.4.2.12 4.4.2.13 و.
   5. بيرلز البروسي الأزرق وصمة عار كما هو موضح في ^11.
5. تم تنفيذ تلطيخ المناعي كما هو مفصل:
   1. Dewax حسب 4.4.2.1.
   2. شطف في الماء المقطر (2X 5 دقائق).
   3. أداء استرجاع مستضد باستخدام 0.01٪ العازلة سيترات، ودرجة الحموضة 6 في 75 - 80 درجة مئوية (20 دقيقة) علىد السماح لتبرد في 0.01٪ سيترات حل العازلة (20 دقيقة).
   4. غسل المقاطع في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) (2X 5 دقائق).
   5. Permeabilize غشاء الخلية في غسل حل العازلة (10 دقيقة).
   6. احتضان في حل كتلة المصل (2 ساعة).
   7. احتضان المقاطع في الأجسام المضادة الأولية مخففة في واحد مخفف الأضداد (10٪ عادي الماعز serum/0.1٪ تريتون X-100/PBS) (بين عشية وضحاها في الثلاجة). يظهر عيار من كل الأجسام المضادة الأولية المستخدمة في الجدول 1.
   8. بعد مرور فترة الحضانة بين عشية وضحاها، ويغسل المقاطع في غسل حل العازلة (5X 3 دقيقة). من هذه النقطة، والحفاظ على المقاطع في الظلام.
   9. احتضان المقاطع في الضد الثانوية المقابلة في عيار 1:500 لمدة محددة (انظر الجدول رقم 1 للحصول على التفاصيل).
   10. غسل المقاطع في غسل حل العازلة (3X 5 دقائق).
   11. احتضان المقاطع في دابي (1:25،000 / PBS) (30 دقيقة).
   12. غسل المقاطع في غسل حل العازلة (3X 5 دقائق).
   13. جبل وساترة باستخدام فلورةوسائل الاعلام تركيب NT.

عينات الاختبار وعينات مراقبة مستعدون للمقارنة البشرى.

Representative Results

ويبين الشكل 4 مقطع ممثل الحصول عليها من قطع العينة هو مبين في الشكل (3). تم قطع الجزء في سمك 5 ميكرون والملون مع H & E وفقا للبروتوكولات الموصوفة أعلاه. هو الحفاظ على الشكل الإجمالي للقطاع عينة مع الحد الأدنى من القطع الأثرية الأنسجة الفرق (الشكل 4A). كانت كل علامات مرئية على صبغ الصلبة، على الرغم من أن الصبغة الخضراء كان أكثر مرونة من الأحمر (الشكل 4B). وكانت طبقات الشبكية لا فصل artifactually ويتم الاحتفاظ مورفولوجيا الشبكية (4C الشكل). الأنسجة الشبكية المجاورة للعلامات صبغ، والتي تتطابق مع الموقع من الأقطاب الكهربائية في الصفيف، يمكن التعرف بسهولة.

ويبين الشكل 5 تلطيخ الممثل الخاص والمناعية من أقسام الأنسجة أعدت وفقا للبروتوكول الحالي. الرجوع إلى الشكل 5 captioن والتكميلية مواد لمزيد من التفاصيل على بقع محددة والتعديلات التي أدخلت على استخدامها. كانت مرحلة ما بعد التعديل، وهذه البقع والمناعية يعادل المعايير الموضوعة - كما تم التحقق منها من قبل الأطباء.

نوع من الأجسام المضادة الأولية وعيار (بين قوسين)	GFAP (1:1500)	NF200 (1:100)	GS (1:100)
نوع من الأجسام المضادة الثانوية وعيار (بين قوسين)	فلور اليكسا 594	فلور اليكسا 488	فلور اليكسا 488
مدة الحضانة من الأجسام المضادة الثانوية	1 ساعة	2 ساعة	45 دقيقة

الجدول 1. نوع الأجسام المضادة، وعيار المدة من وصفها.

الشكل 1. Suprachoroايدال النموذج الكهربائي صفيف. A) صورة ماكرو من الصف مجموعة مصبوب السريرية. B) صورة مجهرية من مجموعة قبل السريرية اليدوية.

الشكل 2. واستخدمت الأنسجة الشبكية السابق. الطرق القياسية النسيجي لإعداد هذه، H & E الملون، أقسام العين مزروع مع مجموعة القطب suprachoroidal. أ) قسم متعامد من خلال تجويف مجموعة الكهربائي (يصور نجم). يتم فصل الشبكية من نسيج العين الخارجي. هذا واضح بشكل خاص تحت منطقة مزروع (السهم). فمن المستحيل لتحديد أي جزء من شبكية العين والمجاورة لبعضها القطب الفردية للمجموعة. Scalebar = 1 مم. ب) التكبير أعلى من المنطقة محاصر في لوحة A. هناك عدة، متباعدة بصورة منتظمة، والتحف في لاي الشبكيةRS (السهام)، وكذلك مفرزة كبيرة من الطبقة بساطي (طبقة عاكسة في عيون القطط). Scalebar = 100 ميكرون. C) التكبير أعلى من المنطقة محاصر في لوحة B. وأشارت سهم القطاعات الخارجية للخلايا مستقبلة للضوء، وكذلك ظهارة مخضب، والتي لا تزال سليمة، مما يدل على أن مفرزة كان من الآثار الجانبية مصطنعة للتجهيز، بدلا من ان يكون سببها في الجسم الحي صدمة أو أمراض. Scalebar = 20 ميكرون.

الشكل (3). توطين وتشريح الكهربائي متجاورة الأنسجة. م) مجموعة ديناميكية عالية والصور، الماكرو من العين منزوعة النواة، مع مجموعة والقطب suprachoroidal في الموقع. أ) وظيفة ثابتة مع تثبيتي ديفيدسون، وقبل إزالة مجموعة، والصلبة شفافة تمكن من التصوريتم استخدام أقطاب الفردية في مجموعة (يشار مثال واحد مع السهم). B) يتم وضع علامة على الأقطاب مع لون صبغة محددة مسبقا. C) علامات صبغ في تباعد العادية من المعالم التشريحية للحفاظ على التناسق عبر التجارب. د) لدى وإزالة صفيف، يتم تشريح العين باليد إلى شرائح العينة. السهام الملونة تشير إلى اثنين من المواقع المتاخمة القطب على الصلبة. أصفر خط متقطع يدل طائرة من باجتزاء. E) الكلي صورة من قطاع عينة جزءا لا يتجزأ من داخل كتلة آغار. F) صورة ماكرو من قطاع عينة أجار محتوى غير مناسب من لوحة E، قطع ووضعها في كاسيت التضمين بدعم من رغوة منصات خزعة لتقليل حركة المقطع أثناء معالجة.

الشكل 4. علم الأنسجة الشبكية الجديدة. ترونج> الشريط العينة أعلاه (من الشكل 3D)، الذي يحتوي على جيب القطب، وكان البارافين جزءا لا يتجزأ، مقطوع في 5 ميكرومتر والملون مع H & E. A) الخضراء والمناطق مصبوغ الأحمر (المشار إليها السهام، نفس الشكل 3D) واضحة في قسم المتخذة على مستوى خط أصفر متقطع في 3D الشكل. شريط مقياس = 1،000 ميكرومتر. لا يتم فصل شبكية العين، لا تحت جيب مجموعة ولا عن بعد. B) منطقة محاصر من لوحة A مع مرئية صبغ أحمر وأخضر يتبين من السهام، وشبكية العين سليمة في جميع أنحاء. شريط النطاق = 500 ميكرومتر. C) منطقة محاصر من لوحة B، والتي تبين سليمة، المرفقة، شبكية العين المتاخمة للالصبغة الخضراء. شريط النطاق = 50 ميكرومتر. مع العلم أن موقع الصبغة يشير إلى موقف من إلكترود، يمكننا تقييم بثقة أنسجة الشبكية المجاورة عن الأضرار، إن وجدت، والناجمة عن التحفيز الكهربائي.

ve_content "FO: المحافظة على together.within الصفحات =" دائما ">
الشكل 5. أمثلة من cytohistochemistry الشبكية تعديلها باستخدام البقع الخاصة والمناعي. استخدام مثبت ديفيدسون، بدلا من التقنيات القياسية الفورمالين التثبيت، والتعديلات المطلوبة لالبروتوكولات تلطيخ المعتادة، على النحو المبين في نص البروتوكول الرئيسي. وقد أكد الطب الشرعى أن هذه التعديلات أدت إلى تلطيخ ما يعادلها. A) H والتقييم؛ haematoxylin البقع الخلية نواة باللون الأرجواني بينما يوزين البقع السيتوبلازم الخلية، والكولاجين والأنسجة الداعمة ظلال مختلفة من اللون الوردي. B) LFB البقع الزرقاء المايلين في حين أن مباين البنفسجي الكريزيل يمكن استخدامها ل . تحديد الخلايا العقدية التي كتبها تلطيخ أجسام نيسل في الزرقاء حوائط النواة وتسليط الضوء على الخلايا الأقمار الصناعية المحيطة خلايا C) ثلاثي الألوان ماسون في الزرقاء، وBiebrich القرمزي الحمضية فوكسين حل البقع العضلات فايBERS الأحمر، في حين أن البقع الزرقاء الأنيلين الكولاجين، في هذه الحالة الصلبة، الأزرق D) PAS؛. مكونات بروتين سكري من الغشاء القاعدي ومكونات النسيج الضام هي ملطخة الأرجواني، في حين أن haematoxylin counterstains الخلية نواة الأرجواني E) بيرلز زرقة بروسيا.؛ في موقع النزف، وتشكيل haemosiderin من تدهور خلايا الدم الحمراء وإطلاق مجمعات الحديد ينتج اللون الأرجواني بينما إضافة محايدة الألوان وصمة عار أحمر أحمر الجسيمات الحالة F) GS؛. هذا الناقل العصبي انزيم المهينة وجدت في خلايا مولر ¹³ (الأخضر )، يمكن أن ينظر تمتد في كلا الاتجاهين مع أجسام الخلايا مولر في الطبقة النووية الداخلية ومولر endfeet الخلية تشكيل تحد من الغشاء الداخلي G) NF-200؛. هذه السلسلة الثقيلة البروتين هيكل الخلية (الخضراء) وجدت في سوما الخلية والعمليات ، crosslinks مع neurofilaments أخرى للحفاظ على بنية الخلايا العصبية ^14،15. عقدةويمكن رؤية الخلايا والمحاور العصبية في طبقة الخلايا العقدية وطبقة من الألياف العصبية، في حين يتم تسليط الضوء أيضا محاور عصبية من الخلايا الأفقية الموجودة في الحدود الخارجية للطبقة النووية الداخلية في شبكية العين القطط،. Counterstaining مع دابي (الأزرق) يسمح التصور من طبقات الشبكية H) GFAP؛. هذا البروتين هيكل الخلية (الحمراء) انتشرت في خلايا مولر والخلايا النجمية خلال دباق ^16، ويمكن رؤية بطانة طبقة الألياف العصبية مع الخلايا مولر تشكيل ملحقات رقيقة من خلال الداخلية ل طبقات الشبكية الخارجي. Counterstaining مع دابي (الأزرق) يسمح لتصور من طبقات الشبكية. شريط النطاق = 50 ميكرومتر في كل اللوحات. يظهر الشبكية الداخلية في أعلى كل صورة؛ يظهر شبكية العين الخارجي في أسفل كل صورة، باستثناء لوحة E، مما يدل على تفاعل subscleral.

Discussion

تقييم سلامة زرع هو الاعتبار الأول للدراسات ما قبل السريرية. قبل بدلة الشبكية يمكن زرعها في البشر فمن الضروري للتحقق من أنه لن يسبب أي ضرر. هذا يتطلب تقييما من كل من توافق مع الحياة زرع ^17-23 وكذلك أي ضرر المحتملة التي يمكن أن تسببها التحفيز الكهربائي المزمنة ^24-26. تجربة مع الأطراف الاصطناعية العصبية مماثلة، مثل زرع قوقعة الأذن، يوفر نظرة ثاقبة على مجموعة واسعة من التحفيز، والمادية، والمعلمات التي لا تتسبب في تلف الأنسجة ^27. ومع ذلك، فإن شبكية العين لديه خصائص مختلفة إلى مواقع أخرى، وغرس حدود السلامة بالتالي دقيقة (مثل كثافة الشحنة الأقصى) لا يمكن افتراض من الدراسات السابقة في أنظمة أخرى. الكثافات التهمة هي أعلى في مواقع القطب بالموقع وهذا يتوافق مع أعظم احتمال حدوث ضرر. ولذلك وسيلة لإضفاء الطابع المحلي على الأنسجة المجاورة مباشرةإلى الأقطاب النشطة الفردية من شأنه أن يزيد كثيرا من فائدة هذه الدراسات. النسيج المجاور لمناطق معينة من زرع ويمكن أيضا أن أبرز لتوثيق التفتيش. يسمح هذا النهج استهدفت أقسام أقل ليتم تحليلها، مع الإبقاء ثقته بأن "السيناريو الأسوأ" تم فحص.

طريقة التعريب صبغ الصلبة وصفها هنا وقد تم اختبار على نطاق واسع مع ناحية الشكل ومصبوب سيليكون / صفائف الكهربائي حزب العمال ^28-30. وقد تم استخدامه مع الأغشية الرقيقة صفائف مادة البولي أميد ^7،31 وأيضا الأغشية الرقيقة سيليكون / حزب العمال صفائف ^32. بعض الدراسات بدلة الشبكية المستخدمة "رصاصة على شكل" الأقطاب الكهربائية مع زرع داخل الصلبة ^33. وينبغي أن تكون هذه التقنية موجودة فعالة لتقييم هذا النوع من المصفوفات القطب. عيون القطط مع الصلبة رقيقة (سمك في القطب الخلفي 90-200 ميكرون) يسمح التصور من الأقطاب الكهربائية الفردية في صفيف. ومع ذلك، حتى لو الكهربائية الفرديةدي كانت غير مرئية، مواقفها يمكن الاستدلال بسهولة باستخدام قالب سيليكون عندما الخطوط العريضة للمجموعة ويمكن رؤية (مماثلة لتلك المستخدمة في الخطوة 2.6).

يحد من رسم الخرائط صبغ الحاجة إلى الحصول على أقسام الأنسجة غير ذات الصلة كما يتم الحصول على المقاطع فقط مع الحاضر صبغ. القدرة على الاستدلال بدقة موقف القطب يسمح ليس فقط تحليل الأنسجة ذات الصلة وزيادة القوة الإحصائية، ولكن لديه تأثير كبير على الوقت وإدارة التكاليف من خلال تقليل كمية من الشرائح وريش المستخدمة فضلا عن تكلفة اليد العاملة. استخدام الصبغة التي هي ملتصقة ويمكن أن تحمل معالجة الأنسجة في حين يجري أيضا واضحة في أقسام الأنسجة غير ملوثين من الاعتبارات الأولية الهامة. معرفة مكان وجود صبغة واتجاه النسيج في تشريح وخلال تضمين يساعد عملية التقطيع. وهذا يشمل orientating كتلة لتحقيق المقطع الذي لم يتم قطع بشكل غير مباشر بشكل صحيح ويعطي representati كاملعلى من الأنسجة. ولذا فمن المهم أن الشخص الذي يؤدي القطع موجودا في ذلك الوقت من تطبيق صبغ، تشريح والتضمين.

بروتوكول العام هو قوية لتعديلات طفيفة، خاصة مع توقيت التثبيت. ومع ذلك، فإن تشريح العين وخطوات وضع العلامات صبغة والإجراءات الدقيقة التي تستفيد من البراعة اليدوية جيدة لتجنب إتلاف العينة. في حين أثبت تثبيتي ديفيدسون فعالة للحد من مفرزة مصطنعة من شبكية العين بالقرب من زرع، فإنه لا يمنع التلف الميكانيكي المباشر أثناء تشريح. وكان تثبيتي ديفيدسون غير متوافق بسهولة مع بعض الإجراءات النسيجية والمناعية الخاصة. ولذلك كانت هناك حاجة لتعديل / تحسين هذه الخطوات على النحو المفصل أعلاه. تم إجراء تغييرات تدريجية في أوقات تلطيخ وتركيزات حتى تم تحقيق النتيجة المثلى - لمزيد من التفاصيل، يرجى الرجوع إلى المواد التكميلية.

الكمي لشبكية العينعلم الأنسجة ما زالت تشكل معضلة. شبكية العين هي غير متجانسة وكلا من سماكة وتغير كثافة الخلية مع زيادة المسافة من الباحة المركزية ^34،35. ولذلك، الأنسجة المجاورة داخل العين مزروع لا يمكن استخدامها لإجراء مقارنات ويعمل على العين السيطرة بدلا من ذلك. البشرى مطابقة من كل قسم مع العين سيطرة يعطينا المقارنة الإحصائية أكثر قوة من التغيرات المرضية، ويتم تقييم النتائج فعالية وسلامة مع الأطراف الاصطناعية الشبكية أفضل عند مقارنة عيون الزميل في ³⁶ موضوع. يجب إيلاء عناية خاصة لتقليل القطع المائل وهذا من شأنه أن يؤثر على التقدير الكمي.

وباختصار، فإن الأساليب المذكورة أعلاه قد تحسنت بشكل ملحوظ تحليلنا التشريحية المرضية، والذي بدوره أدى إلى سير العمل قبل السريرية أكثر كفاءة. أدت نتائج الدراسات قبل السريرية باستخدام هذه الطرق مباشرة لتجربة سريرية في المرضى RP 3 التي تم زرعها بأمان مع suprachoroiالدال الأطراف الاصطناعية في شبكية العين. هذه الأساليب هي ذات الصلة على حد سواء إلى التحفيز والتشجيع الشبكية ويزرع العينية الأخرى حيث يحتاج استجابة مرضية لزرع المدى الطويل التي سيتم تقييمها. قدمت هذا الأسلوب مزايا جديرة بالاهتمام للمحافظة على التهندس الخلوي وتسجيل علم الأمراض إلى مناطق الفائدة على الزرع. على الرغم من عدم اختباره بوجه خاص، على تعديل هذه الإجراءات يمكن أن تستخدم في الأنواع الأخرى والمواقع التشريحية الأخرى، ولا سيما حيث يتم زرع مجموعة بشكل سطحي.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
The Davidson marking system	Bradley Products	1163-4 - red 1163-5 - blue 1163-2 - yellow 1163-1- green
Rabbit Polyclonal Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody	Millipore	AB5804	1:1500, overnight incubation
Mouse Monoclonal Anti-Glutamine Synthetase Antibody	Millipore	MAB302	1:100 overnight incubation
Monoclonal Mouse Anti-Neurofilament 200 Antibody	Sigma-Aldrich	N0142	1:100 overnight incubation
4',6-diamindino-2-phenylindole, dilactate (dilactate)	Life Technologies	D3571	1:25,000 30 min incubation
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG	Life Technologies	A11029	1:500
Superfrost 90° yellow	Grale Scientific	SF41299
FLEX IHC Microscope Slides	DAKO	K802021-2
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG	Life Technologies	A11037	1:500
Normal goat serum	Life Technologies	PCN5000	10% serum/0.1% Triton X-100/PBS
Non-Standard Solution Preparation for Special Stains 1% Aqueous Cresyl Violet Stock Solution Cresyl violet 1 g Distilled water 100 ml Cresyl Violet Acetate Working Solution 1% aqueous cresyl violet stock solution 9 ml Distilled water 51 ml 10% acetic acid 0.5 ml Biebrich Scarlet-Acid Fuchsin Solution 1% Beihrich scarlet 90 ml 1% acid fuchsin 10 ml Glacial acetic acid 1 ml Phosphomolybdic-Phosphtungstic Acid Solution Phosphomolybdic acid 2.5 g Phosphotungstic acid 2.5 g Distilled water 100 ml Aniline Blue Solution Aniline blue 2.5 g Glacial acetic acid 2 g Distilled water 100 ml Solutions for Immunohistochemistry Wash Buffer Solution 0.1% Triton X-100 in Phosphate buffered saline (PBS) Serum Block Solution 10% normal goat serum/0.1% Triton X-100 in PBS SUPPLEMENTARY MATERIAL Luxol Fast Blue The purpose of performing a Luxol Fast Blue (LFB) stain was to identify the ganglion cells in the ganglion cell layer through the counterstain of cresyl violet. While LFB stains myelin, the cresyl violet stain binds to the Nissl substances in neurons, composed of rough endoplasmic reticulum and ribosomes. Numerous cells in the retina contain Nissl substance including amacrine cells. These cells usually are located in the inner boundary layer of the inner nuclear layer, but displaced amacrine cells can be found in the ganglion cell layer. The staining of Nissl substance is helpful in differentiating large, heavily stained ganglion cells from smaller displaced amacrine cells. To aid visualisation of these cells, we modified the cresyl violet working solution protocol by increasing the volume of the cresyl violet stock solution in the working solution. We increased the volume in 1.0 ml increments from 6.0 ml to 9.0 ml, in turn reducing the volume of distilled water. Assessing the ease of visualising and identifying the ganglion cells, optimal staining was achieved with 9 ml of additional cresyl violet stock solution and 51 ml of distilled water. Cresyl violet is a basic dye, though to dye the Nissl substance, it is required to be used in an acidic solution, and therefore the volume of acetic acid remained unchanged at 0.5 ml. Periodic Acid Schiff The Periodic Acid Schiff (PAS) stain was performed to highlight polysaccharides especially glycogen, found in basement membranes and fungal cell walls, indicating a fungal infection. The process of the PAS stain is to oxidise the hydroxyl groups in polysaccharides using periodic acid, producing aldehyde groups. The application of the Schiff reagent, binds to the aldehyde groups producing a magenta color with haematoxylin counterstaining producing purple cell nuclei. Our slides showed weak staining at the inner limiting membrane. This may be due to the polysaccharides present, as not all polysaccharides can be oxidised with a standard time frame, especially those containing anionic polysaccharides. We therefore increased the duration of the oxidation step from 10 min to 12, 15, and 20 min. We found that a 15 min oxidation step was most effective in PAS staining. Masson’s Trichrome Blue The principle of the Masson's trichrome blue stain is to stain collagen and muscle, which in our retinal slides can be used to indicate an increase in collagen tissue which may indicate fibrosis due to injury. This stain is sensitive to fixation techniques, so alterations were needed to obtain optimal staining. The process of this stain is to initially stain cytoplasm and muscle fibres red using the acidic Biebrich scarlet-acid fuchsin red dye. Differentiation with phosphomolybdic/phosphotungstic acid competes with the red dye in the collagen fibres. In the sclera, the large phosphomolybdic/phosphotungstic acid molecules are able to penetrate the loose connective tissue, as opposed to the dense muscle fibres which are penetrable to small molecules only. Aniline blue dye is then applied to replace the acid in the collagen fibres producing blue dyed sclera. To optimise this stain in retinal sections, the duration of staining with Biebrich scarlet-acid fuchsin dye was reduced to create a balance between the blue and the red dye. The use of Davidson's fixative also required an extended differentiation time to remove the red dye from the collagen. We trialled differentiation at 5, 6, 8, and 10 min, with optimal results occurring at 6 min. Differentiation also varies on the thickness and cutting of smooth sections, with greater than 6 min differentiation possibly being required. Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Antibody Polyclonal, host species is rabbit, has a molecular weight of 50 kDa. GFAP antigen is an intermediate filament found in the cytoplasm (the cytoplasm of astrocytes and Müller cells in the retina), the antigen is made form 428 amino acids and has a molecular weight of 49512 Da. Neurofilament-200 antibody Monoclonal, host species is mouse, clone N52, isotype IgG1, it recognises phosphorylated and non-phosphorylated forms of the heavy neurofilaments which have a molecular weight of 200 kDa. The antibody will bind to an epitope in the tail domain of the neurofilament. The antibody will stain neurofilaments in the neuronal perikarya, dendrites and axons. Glutamine Synthetase (GS) antibody Monoclonal, clone GS-6, host species is mouse, has a molecular weight of 45 kDa and antibody isotype IgG2a. The GS antigen is found in the cell cytoplasm (cytoplasm of Müller cells in the retina), the antigen has 373 amino acids and a molecular weight of 42,064 Da.