Summary
Bir retina uyarıcı içinde tek tek elektrotlar doğrudan bitişik retina hücre mimarisini görselleştirmek teknikleri.
Abstract
Retina protezlerin son gelişmeler ile, klinik öncesi çalışmalarda bu cihazların güvenliğini değerlendirmek için güvenilir teknikleri geliştirmek önemlidir. Ancak, standart fiksasyon, hazırlık ve otomatik histoloji prosedürleri ideal değildir. Burada bir implant doğrudan bitişik retina sağlığı değerlendirmek için yeni prosedürler tarif. Retina protezleri göz dokusuna temas elektrod dizileri vardır. Önceki yöntemler mekansal dizi içinde tek tek elektrotlar bitişik oküler doku lokalize etmek mümkün olmamıştır. Buna ek olarak, standart histolojik işleme genellikle implante gözleri değerlendirilmesi retina tabakalarının brüt artefakt dekolmanı ile sonuçlanır. Sonuç olarak, implante edilmiş bir elektrot dizisi implantasyonu ve stimülasyon nedeniyle, mevcut ise, lokalize hasarı değerlendirmek için zor olmuştur. Bu nedenle, implante e bitişik oküler doku belirlenmesi ve lokalize için bir yöntem geliştirmiştirbir (renk kodlu) boya işaretleme düzeni kullanarak, ve biz artefakt retina dekolmanı en aza indirmek için bir göz fiksasyon tekniği modifiye lectrodes. Bu yöntem aynı zamanda bireysel elektrotlar ve bir implant belirli bölümlerine lokalizasyonu sağlayan sklera saydam hale. Son olarak, histopatolojik değerlendirmeler gücünü artırmak için bir eşleştirilmiş kontrol kullanılır. Özet olarak, bu yöntem implant göz retina hücre mimarisini güvenilir ve etkin ayrımcılık ve değerlendirme sağlar.
Introduction
Retina protezleri kısa sürede ciddi görme kaybı çeşitli şekillerde tedavi için yararlı klinik müdahaleler olabilir. Bazı tür retinitis pigmentosa gibi koşullar, (RP), göz fotoreseptör yaygın dejenerasyonu sonucu, bu sinir sinyalleri ışık iletici sorumlu hücrelerdir. Bununla birlikte, retinanın diğer katmanları bazı hücrelerin kalır ve bir retina protez 1 ile elektriksel uyarımı için potansiyel hedeflerdir. Insan klinik çalışmalarda ilk sonuçlar elektrot epiretinal 2,3, subretinal 4,5 implante diziler ve intraskleral 6 yerler için umut verici olmuştur. Bu cihazlar farklı şekillerde farklı malzemelerden yapılmış, ama hepsi görsel gözlemleri yaratmak için retinanın kalan canlı nöronların etkinleştirmek için elektrik sinyalleri kullanırlar.
Bizim daha geniş grup (Bionic Vision Avustralya) ilerleyici olan bir retina implant geliştirmiştirsuprakoroidal elektrot dizileri (Klinik Çalışma Numarası: NCT01603576) implante 3 RP hasta ile klinik pilot çalışma için sed. Şekil 1A bu suprakoroidal prototip retina protezi gösterir.
Hasta güvenliği insan çalışmaları başlamadan önce, biz (Şekil 1B) klinik öncesi modellerde geniş akut ve kronik testi uygulandı, böylece klinik çalışmalarda her şeyden önemlidir ve. Histopatolojik değerlendirmeler, cerrahi işlemler refine elektrot tasarım yineleme, ve sonuçta implantın güvenliği açısından gerekli idi. Standart klinik patoloji uygulamaları ile örtüştüğünü verimli bir iş akışı sağlamak için, bir parafin gömme tekniği kullanılmıştır. Aynı zamanda kolayca patolog tarafından yorumlanır hematoksilen ve eozin (H & E), gibi klinik standartlar ile karşılaştırılabilir boyama işlemleri kullanmak için arzulanan bir durumdur. Ayrıca, immünohistokimyasal analiz için adapte edilebilir bir tekniği, aranandaha da dokuların hücresel değerlendirme kolaylaştırmak için sipariş.
Implant malzemeleri ve kronik elektriksel stimülasyon güvenlik biyouyumluluk, dikkatli bir şekilde değerlendirilmesi gerekir. Bu, dizi içindeki ayrı uyarıcı elektrotlar bitişik oküler doku patolojisi test edebilmek için önemlidir. Ancak, diziler bunlar test edilebilir böylece örnekleri işleme önce kaldırılması için gerekli, ve metalik bileşenler kolayca kesitli olamazdı çünkü. Sonuç olarak, bizim kurulan doku hazırlanması implante elektrotlar 7 ile ilgili doku lokalizasyonu ve haritalama izin vermedi. Bir doku lokalizasyonu metodu eksikliği ek olarak, standart formaldehit bazlı tespit ve işleme teknikleri gözün çeşitli katmanlar ayırıcı çekme (Şekil 2) için en yaygın retina nedeniyle eser ve ayrılması ile sonuçlanmıştır. T homojensizlik nedeniyleo retina, özellikle kantitatif ölçümler için, kontrol doku ile geçerli karşılaştırmalar yapmak zordu. Bu kombine sınırlamalar bizim implante diziler neden potansiyel zararı doğru değerlendirmeler karmaşık.
Burada bu sınırlamaları aşmak için yeni teknikler mevcut. Biz parafin bazlı histoloji ile uyumluluğu korumak için özel göz fiksasyon ve işleme teknikleri 8-10 değiştirdiniz. Biz klinik patologlar gelen yorumlarına dayanarak, karşılaştırılabilir sonuçlar vermek için standart histolojik ve immünohistokimyasal lekeleri değiştirdiniz. Skleral doku saydam render sonra, boya temelli renkli-kodu suprakoroidal uzaydan dizi çıkarmadan önce, her bir elektrot bitişik oküler doku işaretlemek için kullanılmıştır. Elektrot dizi ve tek tek elektrot siteleri işaretleyerek, örnekleri doğru elektrot komşu bölgelerden toplanmış olabilir. Uyumlu örnekleri inci elde edilebilirE kontrolü göz ikili karşılaştırmaları kolaylaştırmak için.
Protocol
1. Enükleasyon ve Post-Fiksasyon
Bu protokol konu bir suprakoroidal elektrot dizi ile tek taraflı implante olduğunu varsayar.
- Cam Schott şişelerde postfix çözümler hazırlayın.
- Davidson'un fiksatif çözüm, 100 ml 2x
- Formalin 2 ml (% 37 formaldehit)
- 10 ml buzlu asetik asit (% 99.7)
- 35 ml etanol (% 98)
- 53 ml distile su
- % 50 etanol, 100 ml 2x
- % 70 etanol, 100 ml 2x
- Davidson'un fiksatif çözüm, 100 ml 2x
- Transcardially ile sıcak konu serpmek (37 ° C) takip heparinize tuzlu soğuk (4 ° C) nötr (10%) tamponlu formalin.
- Her iki gözde üstün limbus (veya suprakoroidal diziden uzak bir yerde) de sütür kravat - Bir rektus doğrultusunda, bir dönüm noktası olarak hizmet etmek.
- Aydınlatmak gözler, implante göz herhangi bir dış yol korumak.
- EAC yerleştirinh Davidson'un fiksatif solüsyonu 100 ml göz ve oda sıcaklığında post-düzeltmek için bırakın.
- 18 st sonra -% 70 etanol ile (oda sıcaklığında) son olarak, daha sonra 8 saat - Davidson sabitleştirici 36 saat için 6,% 50 etanol (oda sıcaklığında) aktarın.
- 4 numune buzdolabında diseksiyonu kadar ° C ve mağaza.
Sağlam ve basınçlı göz küreler olumsuz sonuç histoloji etkilemeden 3 ay için bu şekilde kadar saklanır edilmiştir.
2. Kimlik ve Doku Haritalama
Yukarıdaki tespit protokolü (adım 1) sklera saydam hale ve dizi şimdi görünür - bireyin elektrot siteleri (Şekil 3) de dahil olmak üzere.
- Etanol implante dünya çıkarın ve dikkatli konjonktiva ve Tenon kapsülü dahil olmak üzere aşırı doku, uzak trim. 3 mm uzunluk (Şekil 3A) - 2 ile optik sinir kesin.
- Bir histolojik boya markin kullanarakg düzeni, önceden tanımlanmış bir renk kodu ile etiket elektrotlar, boya bulaşmaya özen.
- Biz özel histolojik boya bir ticari paketi (Ek bakınız) seçti. Boya Az miktarda dikkatle dokuya ince uçlu boya fırçası (Roymac boyutu 00) ile uygulanır ve en fazla 5 dakika için kurumaya izin verildi.
- Diğer aktif elektrotlar için kırmızı,, büyük çaplı geri dönüş elektrotları için sarı, (idi) olan aktif elektrot (ler) için yeşil çalışma süresi için, suprathreshold düzeyde, maksimum teşvik ve: Bizim için, biz seçtik ek kılavuzları ve / veya anatomik mesafe işaretleri (Şekil 3B ve 3C) için mavi.
- Bazı deneme yanılma sonraki aşamalar boyunca stabil olan bir boya bulmak için gerekli olabilir. Örneğin, Şekil 4, bu yeşil boya kırmızı boyanın daha esnek olduğu görülebilir. % 70 etanol içinde boya sulandırma lipit Penet artırmaya yardımcı olurrasyon ve doku kaplama.
- Bu ileride boyalı dünya kroki veya fotoğraf için yararlıdır.
- Boya kurutmak için% 70 etanol dön.
- Unimplanted kontrolü dünya için 2.1 adımı tekrarlayın.
- Adım 1.3 dikişler kullanarak, kontrol göz ve bir aynalı çift olarak implante göz hizalayın.
- Implant implante dizi konumunun hazır görselleştirme izin implante göz (NB saydam sklera ve adım 2.2 boya işaretleri bulunur gibi kontrol göz yansıtılmış yerde bir silikon şablon (elektrot dizisi ile aynı boyutlara sahip) yerleştirin .)
- Her implante elektrot sitesi bir anatomik karşılaştırılabilir (yani ayna eşdeğer uyumlu) bir yerde bir kontrol çift vardır, böylece adımları kontrol göz için 2.2 ve 2.3 gerçekleştirin.
3. Diseksiyon ve Gömme
- Gözünden implant dizi çıkarın ve gözün ön kaldırma(Kornea, iris ve lens dahil). Kalan göz fincan (arka kamara) gelen vitreus sıvı çıkarın.
- Birden Örnek şeritler (~ 2 mm kalınlık) boya işaretli bölgeler (Şekil 3B) bir alt kümesini içeren her biri içine göz implante ayır. Şeritlerin yönünü implant 7 doku tepkisi çeşitli yönlerini değerlendirmek yardımcı olmak için seçilmiş olması gerektiğine dikkat ediniz.
Bu boya bölgelerde her şerit ve onların göreceli konumları (ve renk) mevcut olan bir kayıt yapmak için, ileride, yararlıdır.
- İlk bakan aşağı (Şekil 3E) kesilecek yüzü -, sıvılaştırılmış agar sığ bir havuz (90 ° C 80% 4) içine yan şerit yerleştirin.
- Bir kez ağar, set köpük ekler (Şekil 3F) tarafından desteklenen bir doku kaset içine örnek ve yeri çevresinde azalttı.
- Tekrar kontrol göz için 3.1-3.3 adımları - taking bakım ayna-uyumlu şeritler incelemek.
- Standart (gece otomatik) parafin işleme tekniği yoluyla tüm kasetleri işleyin.
- İlk aşağı bakacak kesilecek yüzü parafin içinde işlenen doku yerleştir.
4. Kesme ve Boyama
- Adım 2 ve 3 notları düzenli olarak atıfta 5 mikron bölüme parafin blok kesin.
- Boyalı bölgelerin her birinden bölümleri toplayın ve slaytlar monte.
Sklera her boyalı noktaya hemen bitişik bölge şimdi dizideki karşılık gelen elektrot (Şekil 4) en yakın yakınlık olduğunu güvenle değerlendirilebilir.
- Leke ya da istediğiniz gibi immünofloresan gerçekleştirmek. Şekil 5'te gösterilen Örnek lekeleri ve immünhistokimya şunlardır: H &e; Luxol hızlı mavi (LFB); cresyl menekşe, Masson trikrom mavi, periyodik asit schiff (PAS); Perls 'Prusya mavisi staiçerisinde, anti-glutamin sentetaz (GS), bir anti-sinir lifi Protein (NF), anti-glial fibriler asidik protein (GFAP) ve 4 ',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI).
- Standart ve özel lekeleri ayrıntılı olarak yapıldı:
- H & E boyama Leica multistainer banyosu dizi ST5020 (Leica Biosystems) tarafından sağlanan yönteme göre yapıldı.
- LFB ve cresyl menekşe (11 değiştirilmiş):
- Ksilen 3 değişiklikler (3x 2 dakika) ve etanol 2 değişiklikler (% 100,% 100) (2 x 1 dakika) ve musluk suyu (45 sn) durulama mumunu gidermek.
- % 95 etanol, hidrat bölümleri.
- 37 LFB çözüm 11 koyun - 42 ° C (gece).
- Fazla% 70 etanol ile leke durulayın.
- Damıtılmış suyla durulayın.
- Seyreltik lityum karbonat yerleştirin (8%) (birkaç saniye).
- % 70 etanol (birkaç saniye) içinde ayırt.
- Damıtılmış suyla durulayın.
- Gerekirse b kadar, 4.4.2.8 adımları 4.4.2.6 tekrarlayınackground renksizdir.
- 37 ° C (10 dakika) cresyl menekşe asetat çalışma çözüm yerleştirin.
- Suda yıkamayın.
- Mutlak alkol 3 değişiklik (1x 30 sn, 2x 20 sn) ve ksilen 3 değişiklik (1x 1 dk 30 sn, 2x 1 dak) kurutmak.
- DPX Mount ve kapak.
- Masson trikrom mavi (11 değiştirilmiş):
- 4.4.2.1 göre mumunu gidermek.
- Bölümler su (2 dk) getirin.
- Weigert demir hematoksilen (2 dk) kullanarak çekirdekleri leke.
- Musluk suyunda yıkayın, distile su ile durulayın.
- Biebrich kızıl-asit fuksin solüsyonu (5 dk) leke.
- Damıtılmış suyla durulayın.
- Kollajen soluk pembe (6 dk) kadar fosfomolibdik-fosfotungstik asit ayırt.
- Damıtılmış suyla durulayın.
- Anilin blue (1 dakika) Counterstain.
- % 1 asetik asit (1 dakika) içinde iyice yıkayın.
- P olarak kurutmak, montaj ve kapaker 4.4.2.12 ve 4.4.2.13.
- PAS (11 değiştirilmiş):
- 4.4.2.1 göre mumunu gidermek.
- % 1 periyodik asit (15 dakika) okside eder.
- Su daha sonra saf su çalışan yıkayın.
- Schiff reaktifi (15 dakika) leke.
- Su (5 dakika) yıkanır.
- Harris hematoksilen (1 dk) ile Counterstain.
- Musluk suyu kısaca yıkayın.
- % 0.5 asit alkol (1 dip) olarak ayırt.
- Musluk suyu içinde iyice yıkayın.
- Scott'ın musluk suyu (1 dak) Mavi.
- Su ile iyice yıkayın.
- 4.4.2.12 ve 4.4.2.13 göre, montaj ve kapak kurutmak.
- 11 'de tarif edildiği gibi perls' boyası.
- İmmünofloresan boyama ayrıntılı olarak yapıldı:
- 4.4.2.1 göre mumunu gidermek.
- Distile su (2x 5 dakika) ile durulayın.
- ° C (20 dakika) 80-75% 0.01 sitrat tamponu, pH 6 kullanılarak antijen alma gerçekleştirmekD% 0.01 sitrat tampon çözeltisi (20 dakika) içinde soğumaya bırakın.
- Fosfat yıkayın bölümler tuzlu su (PBS) (2 x 5 dakika) tamponlu.
- Yıkama tampon çözeltisi (10 dakika) hücre zarının geçirgenliği artar.
- Serum blok çözeltisi (2 saat) inkübe edin.
- Antikor sulandırıcı ile sulandırılmış bir tek primer antikor (% 10 normal keçi serum/0.1% Triton X-100/PBS) (buzdolabında gece) bölümleri inkübe edin. Kullanılan her bir primer antikor titresi Tablo 1 'de gösterilmiştir.
- Gece boyunca inkübasyondan sonra, yıkama tampon çözeltisi (5x 3 dk) bölümleri yıkayın. Bu noktadan itibaren, karanlıkta bölümleri tutun.
- Belirli bir süre (ayrıntılar için bakınız Tablo 1) için 1:500 bir titre de ilgili ikincil antikor bölümleri inkübe edin.
- Yıkama tampon çözeltisi (3 x 5 dakika) bölümleri yıkayın.
- DAPI (1:25000 / PBS) (30 dk) bölümleri inkübe edin.
- Yıkama tampon çözeltisi (3 x 5 dakika) bölümleri yıkayın.
- Montaj ve kapak floresan kullanaraknt montaj medya.
Test örnekleri ve kontrol örnekleri çiftli karşılaştırması için hazırdır.
Representative Results
Şekil 4, Şekil 3 'de gösterilen örnek bir kesim elde edilen temsili bir kesitini göstermektedir. Bölüm yukarıda tarif edilen protokollere göre, H & E ile 5 um kalınlıkta ve lekeli de kesildi. Örnek şerit brüt şekli minimal diferansiyel doku eserler (Şekil 4A) ile korunur. Yeşil boya kırmızı (Şekil 4B) daha esnek olmasına rağmen her iki boya işaretleri, sklera üzerinde görünüyordu. Retina katmanları artifactually müstakil değildi ve retina morfolojisi (Şekil 4C) korunur. Dizideki elektrotların bulunduğu yere karşılık gelen boya işaretler bitişik, retina dokusu, kolayca tespit edilebilir.
Şekil 5 doku bölümleri temsilcisi özel boyama ve immünhistokimyasal mevcut protokole göre hazırlanan gösterir. 5 captio bkz.özel lekeleri ve kullanımı yapılan değişiklikler hakkında daha fazla ayrıntı için n ve Yardımcı Malzemeler. Post-değişiklik, bu lekeleri ve immünhistokimya belirlenmiş standartlara eşitti - patolog tarafından doğrulanmadı gibi.
| Primer antikor ve titre tipi (parantez içerisinde) | GFAP (1:1500) | NF200 (1:100) | GS (1:100) |
| Ikincil antikor ve titre tipi (parantez içerisinde) | Alexa Fluor 594 | Alexa Fluor 488 | Alexa Fluor 488 |
| Ikincil antikor inkübasyon süresi | 1 saat | 2 saat | 45 dakika |
Tablo 1. Antikor Tipi, Titre ve Etiketleme Süresi.
Şekil 1. Suprachoroidal Prototip Elektrod Dizisi. Bir klinik sınıf kalıp dizinin A) Makro fotoğraf. B) el yapımı klinik öncesi dizinin photomicrograph.
Şekil 2. Eski Retina histolojisi. Standart histolojik yöntemler bu hazırlamak için kullanıldı, H & E ile boyanmış, bir suprakoroidal elektrot dizisi ile implante edilen bir göz bölümleri. A) 'deki elektrot dizisinde, boşluğun (bir yıldız ile gösterilen) ile bir dik kesit. Retina dış göz dokusundan ayrılır. Bu implante bölgesi (ok) altında özellikle belirgindir. Bu dizinin her bir elektrot bitişik retina kısmının belirlemek mümkün değildir. Ölçek çubuğu = 1 mm. B) Masası'ndaki kutulu bölgenin daha yüksek büyütme bir. Retina laye içinde, düzenli aralıklı, çeşitli eserler vardırRS (oklar) yanı sıra, tapetal katmanı (kedi gözü içinde yansıtıcı tabaka) dan büyük dekolmanı. Ölçek çubuğu = 100 mikron. C) paneli B kutulu bölgenin daha yüksek büyütme. Ok kopma olarak, in vivo ya da travma patolojisinde neden olmanın aksine, işleme bölgesinin yan etki, bir artefakt olduğunu düşündüren, fotoreseptör dış bölümler, hem de sağlam kalır pigmenter epitel olduğuna işaret etmektedir. Ölçek çubuğu = 20 mikron.
Şekil 3,. Elektrot-Bitişik Doku. AD lokalizasyonu ve diseksiyonu) yerinde bir suprakoroidal elektrot dizi ile bir enükleasyon göz Yüksek dinamik aralık makro fotoğraf,. A) Mesaj Davidson'un fiksatif ile sabit ve önce dizi kaldırılması, saydam sklera görselleştirme sağlardizi içinde özel elektrotlar (tek örnek ok ile gösterilen). B) elektrotlar önceden tanımlanmış bir boya renk ile işaretlenmiştir. C) anatomik düzenli aralıklarla Boya işaretler deneyler arasında tutarlılığı korumak için kullanılır. D) çıkarılması üzerine dizi, göz örnek şeritler halinde elle disseke edilir. Renkli oklar skleraya elektrot komşu bölgelerde iki göstermektedir. Sarı kesikli çizgi Kesit düzlemi gösterir. E) Panel E gelen agar-embed örnek şerit, köpük biyopsi yastıkları tarafından desteklenen kesip ve bir gömme kaset yerleştirilen bir agar bloğu. F içinde gömülü örnek şerit Makro-fotoğraf) Makro fotoğraf işlem sırasında bölümün hareketi en aza indirmek için.
Şekil 4. Yeni Retina Histoloji. trong> elektrot cep içeren Yukarıdaki örnek şerit (Şekil 3 boyutlu), H & E. A) Yeşil ve kırmızı boyalı bölgeleri (Şekil 3D aynı oklar, gösterilen) ile 5 mikron ve boyandı parafin, kesitli oldu görülebilir bir bölüm Şekil 3D sarı kesikli çizgi düzeyinde alınan. Ölçek çubuğu = 1,000 mikron. Retina dizi cep altında ne de uzaktan ne, müstakil değildir. B) Masası'ndan kutulu bölge görünür kırmızı ve yeşil boya ile bir oklarla gösterilen ve sağlam retina boyunca. Ölçek çubuğu = 500 mikron. Yeşil boya bitişik sağlam, ekli, retina gösteren Panel B'den C) kutulu bölge,. Ölçek çubuğu = 50 mikron. Boya yerini bir elektrot olarak görev varsa, biz güvenle elektrik stimülasyonu neden, hasar komşu retina dokusunun değerlendirmek gösterir bilerek.
Şekil 5,. Özel lekeleri ve immun kullanılarak değiştirilebilir retina cytohistochemistry örnekleri. Olarak ana protokol metinde açıklanan standart formalin ile tespit yöntemleri, alışılmış boyama protokolleri için gerekli değişiklikler, aksine Davidson sabitleştirici, kullanımı. Patologlar bu değişiklikler eşdeğer boyama yol açtığını doğruladı. A) H &e; pembe eozin leke hücre sitoplazma, kollajen ve destek doku çeşitli tonları. B) LFB lekeleri miyelin mavi cresyl menekşe counterstain mor hematoksilen lekeleri hücre çekirdekleri kullanılabilir iken ise . perikaryon mavi içinde Nissl organları boyama ve hücreleri çevreleyen uydu hücreleri vurgulayarak ganglion hücreleri belirlemek C) Masson trikrom mavi, Biebrich kırmızı-asit fuksin solüsyonu lekeleri kas fiyle kırmızı, anilin mavi lekeler kollajen, bu durumda sklera, mavi D) PAS ise,.. hematoksilen hücre çekirdekleri mor E) Perls 'Prusya mavisi counterstains ise bazal membran ve bağ dokusu bileşenleri glikoprotein bileşenleri, mor lekeli; nötr kırmızı leke renklerin yanı sıra kırmızı lizozomlar ise kanama yerinde, demir komplekslerinin bozulmuş kırmızı kan hücreleri ve açığa çıkan hemosiderin oluşumu bir mor renk üretir F) GS;. Müller hücrelerinde 13 fazlası Bu nörotransmitter aşağılayıcı enzim (yeşil .), iç nükleer tabaka ve iç sınırlayıcı membranı G), NF-200 oluşturan Müller hücre endfeet olarak Müller hücre yapıları ile her iki yönde uzanan görülebilir, bu ağır zincir iskelet proteini (yeşil) hücre soma ve işlemlerde bulunan , nöronlar 14,15 yapısını korumak için diğer nörofilament ile çapraz bağlar. Ganglionkedi retinada iç nükleer tabaka dış yatılı bulunan yatay hücrelerin aksonları sahip olmuştur hücreleri ve bunların aksonlar, ganglion hücre tabakası ve sinir lifi görülebilir. . DAPI (mavi) ile counterstaining retina katmanlarının görselleştirme H) GFAP sağlar, bu iskelet protein (kırmızı), gliozis 16 sırasında Müller hücreleri ve astrositlerde çoğaldı için iç ile ince uzantıları oluşturan Müller hücreleri ile sinir lifi tabakası astar görülebilir dış retina katmanları. DAPI ile counterstaining (mavi) retina tabakalarının görselleştirme sağlar. Tüm panellerde ölçek çubuğu = 50 mikron. Iç retina her görüntünün üst kısmında gösterilir; dış retina subscleral reaksiyon gösterir Panel E, hariç her görüntünün alt kısmında gösterilir.
Discussion
Implantın güvenlik değerlendirilmesi klinik öncesi çalışmalar için bir temel unsurlardan biridir. Bir retina protezi insanlarda implante edilebilir önce herhangi bir zarar vermez doğrulamak için gereklidir. Bu implant biyouyumluluk 17-23 hem de 24-26 kronik elektrik stimülasyonu neden olabilir olası hasar hem de bir değerlendirme gerektirir. Bu koklear implant gibi benzer nöral protez, deneyim, stimülasyon geniş ve doku hasarı 27 neden olmaz fiziksel, parametrelere fikir verir. Ancak, retina diğer implantasyon sitelere farklı özellikler ve bu nedenle hassas güvenlik sınırları (örneğin maksimum yük yoğunluğu gibi) diğer sistemlerde daha önceki çalışmalardan kabul edilemez vardır. Yük yoğunlukları aktif elektrot siteleri en yüksek ve bu zarar için en büyük potansiyeli olan gelir. Doğrudan bitişik dokuya lokalize Bu nedenle bir yöntemBireysel aktif elektrotlara büyük ölçüde bu çalışmaların yararını arttıracaktır. İmplantın belirli bölgelerine komşu doku da daha yakından inceleme için belirgin olarak görünebilir. Bu hedef yaklaşım "en kötü durum senaryosu" incelenmiştir olduğunu koruyarak güven iken, analiz edilmesi için daha az bölümleri izin verir.
Burada açıklanan skleral boya lokalizasyon yöntemi yaygın el şeklinde ve kalıplı silikon / Pt elektrot dizileri 28-30 ile test edilmiştir. Bu ince film poliamid diziler 7,31 ve aynı zamanda ince film silikon / Pt diziler 32 ile kullanılmıştır. Bazı retina protezi çalışmalar intraskleral implantasyonu 33 ile "mermi şeklinde" elektrotlar kullandı. Mevcut teknik elektrod dizileri bu tür değerlendirmek için etkili olmalıdır. Ince sklera ile Kedi gözleri (arka kutup 90 kalınlığı - 200 mikron) bir dizi bireysel elektrot görselleştirme izin verdi. Ancak, olsa bile tek tek elektrodes konumlarını kolayca dizinin taslak (adım 2.6 kullanılana benzer) görülebilir bir silikon şablon kullanılarak türetilmiş olabilir, görünür değildi.
Boya eşleme boya ile mevcut yalnızca bölümlerini elde edilen gibi ilgili olmayan doku bölümleri elde etmek için ihtiyaç sınırlar. Doğru elektrot konumu anlaması için yeteneği ilgili histopatolojik analizi ve daha fazla istatistiksel güç verir, ancak işçilik maliyeti yanı sıra kullanılan slaytlar ve bıçaklar miktarı azaltarak zaman ve maliyet yönetimi üzerinde önemli bir etkisi vardır sadece. Yapışık olduğunu ve aynı zamanda boyanmamış doku kesitlerinde görünür olmak iken doku işleme dayanabilir boyanın kullanılması önemli bir başlangıç husustur. Diseksiyon da doku, boya ve oryantasyon ve gömme sırasında yeri hakkında bilgi kesme işlemi yardımcı olur. Bu doğru eğik kesilmez bir bölüm elde etmek için blok yönlendirici içeren ve tam representati verirdoku üzerinde. Bu kesim yapan kişi boya uygulama, diseksiyon ve gömme sırasında mevcut olduğunu önemlidir.
Genel protokol özellikle tespit zamanlamaları ile, küçük değişiklik için sağlamdır. Ancak, göz diseksiyon ve boya işaretleme adımları iyi el becerisi yarar numune zarar vermemek için bu hassas işlemlerdir. Davidson'un sabitleştirici bir implant yakın retina dekolmanı artefakt azaltmak için etkili olduğu kanıtlanmıştır iken, bu diseksiyonu sırasında doğrudan mekanik hasar engellemez. Davidson'un sabitleştirici bazı özel histolojik ve immünohistokimyasal işlemleri ile kolayca uyumlu değildi. Bu nedenle yukarıda ayrıntılı olarak açıklandığı gibi adımları değiştirmek / optimize etmek için bir ihtiyaç vardı. Optimum sonuç elde edilene kadar boyama süreleri ve konsantrasyonları artan değişiklikler yapılmıştır - Daha fazla bilgi için, ek materyalleri bakın.
Retina ölçümühistoloji sorunlu olmaya devam etmektedir. Retina homojen olmayan ve kalınlığı ve alan centralis 34,35 den artan mesafe ile hücre yoğunluğu değişim hem de. Bu nedenle, göz implante içinde komşu doku karşılaştırmaları için kullanılamaz ve bir kontrol gözü yerine kullanılır. Pairwise kontrol gözle her bölümün uyan bize patolojik değişikliklerin daha güçlü bir istatistiksel karşılaştırma verir, bir konu 36 diğer gözleri karşılaştırırken retina protez ile etkinlik ve emniyet sonuçları daha iyi değerlendirilir. Özel bakım Bu miktar etkileyecek gibi eğik kesme en aza indirmek için alınması gerekir.
Özet olarak, yöntemler belirgin da daha verimli bir ön-klinik akışına yol açmıştır eden histopatolojik inceleme, iyileştirilmiştir yukarıda tarif edilmiştir. Bu yöntemleri kullanarak klinik öncesi çalışmaların sonuçları doğrudan 3 RP hastaların güvenli bir şekilde suprachoroi ile implante edildiği bir klinik çalışma yol açtıdal retinal protez. Bu yöntemler, retina uyarıcıları ve uzun süreli implantasyon için patolojik yanıt değerlendirilmesi gereken diğer oküler implant hem de ilgilidir. Bu yöntem, implant üzerinde ilgi bölgelere patolojinin hücre mimarisini ve kayıt muhafaza edilmesi için değerli bir avantaj sağlanmaktadır. Özel olarak test Bununla birlikte, bu prosedürlerin bir modifikasyonudur bir dizi yüzeysel implante edilir özellikle burada, diğer türler ve diğer anatomik yerlerde kullanılabilir.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Yazarlar teşekkür etmek istiyorum: Bayan Alexia Saunders ve Bayan Michelle McPhedran deneysel yardım için, elektrot imalat için Bayan Helen Feng; Dr Penny Allen ve cerrahi yardım için Dr Jonathan Yeoh, Royal Victorian Göz ve Kulak Hastanesi Biyolojik Kurmay hayvan bakımı Araştırma Merkezi; boyunca genel rehberlik için Prof Rob Çoban ve Dr Bryony Nayagam ve el yazması bir taslak form üzerinde eleştirel yorumlar için Sayın Ronald Leung.
Bu çalışma Biyonik Enstitüsü ve St Vincent Hastanesi, Melbourne yapıldı. Fon Ian Potter Vakfı, John T Reid Bağış Güven ve Bionic Vision Avustralya (BVA) Bionic Vizyon Bilim ve Teknoloji hibe yılında Özel Araştırma Girişimi ile Avustralya Araştırma Konseyi tarafından sağlandı. Biyonik Enstitüsü onun Operasyonel Altyapısının Desteklenmesi Programı aracılığıyla Victoria Hükümeti aldığı desteği kabul eder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| The Davidson marking system | Bradley Products | 1163-4 - red 1163-5 - blue 1163-2 - yellow 1163-1- green | |
| Rabbit Polyclonal Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody | Millipore | AB5804 | 1:1500, overnight incubation |
| Mouse Monoclonal Anti-Glutamine Synthetase Antibody | Millipore | MAB302 | 1:100 overnight incubation |
| Monoclonal Mouse Anti-Neurofilament 200 Antibody | Sigma-Aldrich | N0142 | 1:100 overnight incubation |
| 4',6-diamindino-2-phenylindole, dilactate (dilactate) | Life Technologies | D3571 | 1:25,000 30 min incubation |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A11029 | 1:500 |
| Superfrost 90° yellow | Grale Scientific | SF41299 | |
| FLEX IHC Microscope Slides | DAKO | K802021-2 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A11037 | 1:500 |
| Normal goat serum | Life Technologies | PCN5000 | 10% serum/0.1% Triton X-100/PBS |
| Non-Standard Solution Preparation for Special Stains 1% Aqueous Cresyl Violet Stock Solution
Cresyl Violet Acetate Working Solution
Biebrich Scarlet-Acid Fuchsin Solution
Phosphomolybdic-Phosphtungstic Acid Solution
Aniline Blue Solution
Solutions for Immunohistochemistry Wash Buffer Solution
Serum Block Solution
SUPPLEMENTARY MATERIAL Luxol Fast Blue The purpose of performing a Luxol Fast Blue (LFB) stain was to identify the ganglion cells in the ganglion cell layer through the counterstain of cresyl violet. While LFB stains myelin, the cresyl violet stain binds to the Nissl substances in neurons, composed of rough endoplasmic reticulum and ribosomes. Numerous cells in the retina contain Nissl substance including amacrine cells. These cells usually are located in the inner boundary layer of the inner nuclear layer, but displaced amacrine cells can be found in the ganglion cell layer. The staining of Nissl substance is helpful in differentiating large, heavily stained ganglion cells from smaller displaced amacrine cells. To aid visualisation of these cells, we modified the cresyl violet working solution protocol by increasing the volume of the cresyl violet stock solution in the working solution. We increased the volume in 1.0 ml increments from 6.0 ml to 9.0 ml, in turn reducing the volume of distilled water. Assessing the ease of visualising and identifying the ganglion cells, optimal staining was achieved with 9 ml of additional cresyl violet stock solution and 51 ml of distilled water. Cresyl violet is a basic dye, though to dye the Nissl substance, it is required to be used in an acidic solution, and therefore the volume of acetic acid remained unchanged at 0.5 ml. Periodic Acid Schiff The Periodic Acid Schiff (PAS) stain was performed to highlight polysaccharides especially glycogen, found in basement membranes and fungal cell walls, indicating a fungal infection. The process of the PAS stain is to oxidise the hydroxyl groups in polysaccharides using periodic acid, producing aldehyde groups. The application of the Schiff reagent, binds to the aldehyde groups producing a magenta color with haematoxylin counterstaining producing purple cell nuclei. Our slides showed weak staining at the inner limiting membrane. This may be due to the polysaccharides present, as not all polysaccharides can be oxidised with a standard time frame, especially those containing anionic polysaccharides. We therefore increased the duration of the oxidation step from 10 min to 12, 15, and 20 min. We found that a 15 min oxidation step was most effective in PAS staining. Masson’s Trichrome Blue The principle of the Masson's trichrome blue stain is to stain collagen and muscle, which in our retinal slides can be used to indicate an increase in collagen tissue which may indicate fibrosis due to injury. This stain is sensitive to fixation techniques, so alterations were needed to obtain optimal staining. The process of this stain is to initially stain cytoplasm and muscle fibres red using the acidic Biebrich scarlet-acid fuchsin red dye. Differentiation with phosphomolybdic/phosphotungstic acid competes with the red dye in the collagen fibres. In the sclera, the large phosphomolybdic/phosphotungstic acid molecules are able to penetrate the loose connective tissue, as opposed to the dense muscle fibres which are penetrable to small molecules only. Aniline blue dye is then applied to replace the acid in the collagen fibres producing blue dyed sclera. To optimise this stain in retinal sections, the duration of staining with Biebrich scarlet-acid fuchsin dye was reduced to create a balance between the blue and the red dye. The use of Davidson's fixative also required an extended differentiation time to remove the red dye from the collagen. We trialled differentiation at 5, 6, 8, and 10 min, with optimal results occurring at 6 min. Differentiation also varies on the thickness and cutting of smooth sections, with greater than 6 min differentiation possibly being required. Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Antibody Polyclonal, host species is rabbit, has a molecular weight of 50 kDa. GFAP antigen is an intermediate filament found in the cytoplasm (the cytoplasm of astrocytes and Müller cells in the retina), the antigen is made form 428 amino acids and has a molecular weight of 49512 Da. Neurofilament-200 antibody Monoclonal, host species is mouse, clone N52, isotype IgG1, it recognises phosphorylated and non-phosphorylated forms of the heavy neurofilaments which have a molecular weight of 200 kDa. The antibody will bind to an epitope in the tail domain of the neurofilament. The antibody will stain neurofilaments in the neuronal perikarya, dendrites and axons. Glutamine Synthetase (GS) antibody Monoclonal, clone GS-6, host species is mouse, has a molecular weight of 45 kDa and antibody isotype IgG2a. The GS antigen is found in the cell cytoplasm (cytoplasm of Müller cells in the retina), the antigen has 373 amino acids and a molecular weight of 42,064 Da. |
|||
References
- Santos, A., Humayun, M. S., et al. Preservation of the inner retina in retinitis pigmentosa. Arch. Ophthalmol. 115, 511-515 (1997).
- Humayun, M. S., Weiland, J. D., et al. Visual perception in a blind subject with a chronic microelectronic retinal prosthesis. Vision Res. 43, 2573-2581 (2003).
- Roessler, G., Laube, T., et al. Angiographic findings folowing tack fixation of a wireless epiretinal retina implant device in blind RP patients. Graefes. Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 249, 1281-1286 (2011).
- Chow, A. Y., Chow, V. Y., et al. The artificial silicon retina microchip for the treatment of vision loss from retinitis pigmentosa. Arch. Ophthalmol. 122, 460-469 (2004).
- Zrenner, E., Bartz-Schmidt, K. U., et al. Subretinal electronic chips allow blind patients to read letters and combine them to words. Proc. R. Soc. B. 278, 1489-1497 (2011).
- Fujikado, T., Kamei, M., et al. Testing of semichronically implanted retinal prosthesis by suprachoroidal-transretinal stimulation in patients with retinitis pigmentosa. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 4726-4733 (2011).
- Villalobos, J., Allen, P. J., et al. Development of a surgical approach for a wide-view suprachoroidal retinal prosthesis: evaluation of implantation trauma. Graefes. Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 250, 399-407 (2012).
- Latendresse, J. R., Warbittion, A. R., Jonassen, H., Creasy, D. M. Fixation of testes and eyes using a modified Davidson's fluid: comparison with Bouin's fluid and conventional Davidson's fluid. Toxicol. Pathol. 30, 524-533 (2002).
- Agrawal, R. N., He, S., et al. In vivo models of proliferative vitreoretinopathy. Nat. Protoc. 2, 67-77 (2007).
- Margo, C. E., Lee, A. Fixation of whole eyes: the role of fixative osmolarity in the production of tissue artifact. Graefes. Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 233, 366-370 (1995).
- Bancroft, J. D., Gamble, M. Theory and practice of histological techniques. , 6, Churchill Livingstone. (2008).
- Horobin, R. W., Bancroft, J. D. Troubleshooting histology stains. , Churchill Livingstone. (1998).
- Pow, D. V., Robinson, S. R. Glutamante in some retinal neurons is derived solely from glia. Neuroscience. 60, 355-366 (1994).
- Lewis, S. E., Nixon, R. A. Multiple phosphorylated variants of the high molecular mass subunit of neurofilaments in axons of retinal cell neurons: characterization and evidence for their differential association with stationary and moving neurofilaments. J. Cell Biol. 107, 2689-2701 (1988).
- Ruiz-Ederra, J., García, M., Hicks, D., Vecino, E. Comparative study of the three neurofilament subunits within pig and human retinal ganglion cells. Mol. Vis. 10, 83-92 (2004).
- Bringmann, A., Pannicke, T., et al. Müller cells in the healthy and diseased retina. Prog. Retin. Eye Res. 25, 397-424 (2006).
- Seo, J. M., Kim, S. J., et al. Biocompatibility of polyimide microelectrode array for retinal stimulation. Mater. Sci. Eng. C. 24, 185-189 (2004).
- Gerding, H., Benner, F. P., Taneri, S. Experimental implantation of epiretinal retina implants (EPI-RET) with an IOL-type receiver unit. J. Neural Eng. 4, S38-S49 (2007).
- Majji, A. B., Humayun, M. S., et al. Long-term histological and electrophysiological results of an inactive epiretinal electrode array implantation in dogs. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 40, 2073-2081 (1999).
- Walter, P., Szurman, P., et al. Successful long-term implantation of electrically inactive epiretinal microelectrode arrays in rabbits. Retina. 19, 546-552 (1999).
- Pardue, M. T., Stubbs, E. B. Jr, et al. Immunohistochemical studies of the retina following long-term implantation with subretinal microphotodiode arrays. Exp. Eye Res. 73, 333-343 (2001).
- Gekeler, F., Szurman, P., et al. Compound subretinal prostheses with extra-ocular parts designed for human trials: successful long-term implantation in pigs. Graefes. Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 245, 230-241 (2007).
- Montezuma, S. R., Loewenstein, J. I., Scholz, C., Rizzo, J. F. III Biocompatibility of materials implanted into the subretinal space of Yucatan minipigs. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 47, 3514-3522 (2006).
- Montezuma, S. R., Loewenstein, J. I., Scholz, C., Rizzo, J. F. III Biocompatibility of materials implanted into the subretinal space of Yucatan minipigs. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 47, 3514-3522 (2006).
- Ray, A., Colodetti, L., et al. Immunocytochemical analysis of retinal neurons under electrical stimulation. Brain Res. 1255, 89-97 (2009).
- Nakauchi, K., Fujikado, T., et al. Threshold suprachoroidal-transretinal stimulation current resulting in retinal damage in rabbits. J. Neural. Eng. 4, S50-S57 (2007).
- Shepherd, R. K., Murray, M. T., Houghton, M. E., Clark, G. M. Scanning electron microscopy of chronically stimulated platinum intracochlear electrodes. Biomaterials. 6, 237-242 (1985).
- Villalobos Villa, J. Safety of a Wide-Field Suprachoroidal Retinal Prosthesis. , The University of Melbourne. (2012).
- Nayagam, D. A. X., Allen, P. J., et al. A Pre-Clinical Model for Chronic Electrical Stimulation of the Retina via Suprachoroidal Electrodes. Association for Research in Vision and Ophthalmology Annual Meeting, Fort Lauderdale, Florida, USA, , (2012).
- Nayagam, D. A. X., Villalobos, J., et al. A Suprachoroidal Retinal Prosthesis is Safe in a Chronic Implantation Model. in Vision and Ophthalmology Annual Meeting., Vol. 4928/A327. Association for Research in Vision and Ophthalmology Annual Meeting, Fort Lauderdale, Florida, USA, , (2011).
- Cicione, R., Shivdasani, M. N., et al. Visual cortex responses to suprachoroidal electrical stimulation of the retina: effects of electrode return configuration. J. Neural Eng. 9, 036009 (2012).
- Schuettler, M., Stiess, S., King, B. V., Suaning, G. J. Fabrication of implantable microelectrode arrays by laser cutting of silicone rubber and platinum foil. J. Neural Eng. 2, S121-S128 (2005).
- Morimoto, T., Kamei, M., et al. Chronic implantation of newly developed suprachoroidal-transretinal stimulation prosthesis in dogs. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 6785-6792 (2011).
- Bron, A. J., Tripathi, R. C., Tripathi, B. J. Wolff's anatomy of the eye and orbit. , Arnold. (2001).
- Stein, J. J., Johnson, S. A., Berson, D. M. Distribution and coverage of beta cells in the cat retina. J. Comp. Neurol. 372, 597-617 (1996).
- Dagnelie, G. Psychophysical evaluation for visual prosthesis. Annu. Rev. Biomed Eng. 10, 339-368 (2008).
