Techniques pour les yeux de traitement implantés avec une prothèse rétinienne pour l'analyse histopathologique localisée

Summary

Techniques de visualisation cytoarchitecture rétine directement adjacent aux électrodes individuelles au sein d'un stimulateur rétinien.

Abstract

Avec le développement récent de prothèses rétiniennes, il est important de développer des techniques fiables pour évaluer la sécurité de ces dispositifs dans les études précliniques. Toutefois, la fixation standard, la préparation et les procédures d'histologie automatisés ne sont pas idéales. Nous décrivons ici les nouvelles procédures d'évaluation de la santé de la rétine directement adjacent à un implant. Prothèses rétiniennes disposent matrices d'électrodes en contact avec les tissus oculaires. Les méthodes précédentes n'ont pas été en mesure de localiser spatialement le tissu oculaire adjacent aux électrodes individuelles au sein de la matrice. En outre, le traitement histologique standard se traduit souvent par détachement artifactual brut des couches de la rétine lors de l'évaluation yeux implantés. Par conséquent, il a été difficile d'évaluer les dégâts localisés, s'il est présent, causée par l'implantation et la stimulation d'un réseau d'électrodes implanté. Par conséquent, nous avons développé une méthode pour identifier et localiser le tissu oculaire à côté implanté electrodes en utilisant une (code couleur) système de marquage colorant, et nous avons modifié une technique de fixation d'oeil à minimiser décollement de la rétine artefact. Cette méthode a également rendu la sclère translucide, ce qui permet la localisation des électrodes individuelles et des pièces spécifiques d'un implant. Enfin, nous avons utilisé un témoin apparié pour augmenter la puissance des évaluations histopathologiques. En résumé, cette méthode permet de discrimination et d'évaluation fiable et efficace de la cytoarchitecture rétinienne dans un œil implanté.

Introduction

Prothèses rétiniennes pourraient bientôt devenir interventions cliniques utiles pour le traitement de diverses formes de perte de vision sévère. Certaines conditions, telles que la rétinite pigmentaire (RP), conduisent à la dégénérescence généralisée des photorécepteurs de l'œil, ce sont les cellules responsables de la transduction de la lumière en signaux neuronaux. Cependant, certaines cellules dans d'autres couches de la rétine restent et sont des cibles potentielles pour la stimulation électrique avec une prothèse rétinienne ^1. Les premiers résultats des essais cliniques humains ont été prometteurs pour matrices d'électrodes implantées dans le epiretinal ^{2,3, 4,5,} sous-rétinien et intrascléral ⁶ emplacements. Ces dispositifs sont constitués de matériaux différents ayant des formes différentes, mais ils utilisent tous des impulsions électriques pour activer les neurones viables restantes de la rétine en vue de créer des percepts visuels.

Notre groupe plus large (Bionic Vision Australia) a développé un implant rétinien qui a progressed pour une étude clinique pilote avec 3 patients atteints de RP implantés avec des réseaux d'électrodes suprachoroïdien (Clinical numéro d'essai: NCT01603576). figure 1A montre ce prototype suprachoroïdien prothèse rétinienne.

La sécurité des patients est primordiale dans les études cliniques et, par conséquent, avant de commencer les essais humains, nous avons effectué des essais de toxicité aiguë et chronique extensive dans des modèles précliniques (figure 1B). Évaluations histopathologiques étaient indispensables pour affiner les procédures chirurgicales, parcourir la conception de l'électrode, et, finalement, d'établir l'innocuité de l'implant. Afin de maintenir un flux de travail efficace en queue d'aronde avec les pratiques de pathologie clinique standard, une technique d'enrobage de paraffine a été employée. Il était également souhaitable d'utiliser des méthodes de coloration comparables aux normes cliniques, tels que l'hématoxyline et l'éosine (H & E), qui sont facilement interprété par les pathologistes. Nous voulions aussi une technique qui pourrait être adapté pour des analyses immunohistochimiques, enafin de faciliter une évaluation plus poussée cellulaire des tissus.

La biocompatibilité des matériaux d'implants, et la sécurité de la stimulation électrique chronique, doit être évaluée avec soin. Il est important d'être en mesure d'examiner l'histopathologie du tissu oculaire à proximité des électrodes de stimulation individuels au sein de la matrice. Cependant, les tableaux devaient être enlevés avant le traitement des échantillons afin qu'ils puissent être testés, et parce que leurs composants métalliques ne pouvaient pas être facilement sectionné. En conséquence, notre préparation des tissus établie ne permet pas la localisation et la cartographie des tissus par rapport aux électrodes implantées ^7. En plus de l'absence d'une méthode de localisation des tissus, la fixation à base de formaldéhyde standard et les techniques de transformation ont donné lieu à des artefacts répandues et décollement de la rétine due à la contraction différentielle des différentes couches de l'œil (Figure 2). En raison de la non-homogénéité de til rétine, il était difficile d'établir des comparaisons valables avec le tissu de contrôle, en particulier pour des mesures quantitatives. Ces limitations combinées compliquées évaluations précises des dommages potentiels causés par nos réseaux implantés.

Ici, nous présentons de nouvelles techniques pour surmonter ces limitations. Nous avons modifié les techniques de fixation et le traitement des yeux spécialisées ^8-10 pour maintenir la compatibilité avec l'histologie à base de paraffine. Nous avons modifié les taches histologiques et immunohistochimiques standard pour donner des résultats comparables, basée sur les commentaires des pathologistes cliniques. Après avoir rendu le translucide de tissu scléral, un code de couleur à base de colorant a été utilisé pour marquer le tissu oculaire adjacente à chaque électrode individuelle, avant de retirer la matrice de l'espace suprachoroïdien. Par le marquage du réseau d'électrodes et les sites d'électrodes individuelles, les échantillons peuvent être prélevés avec précision à partir des régions adjacentes d'électrodes. Échantillons appariés pourraient être recueillies auprès èmee oeil de commande, afin de faciliter les comparaisons par paires.

Protocol

1. Énucléation et post-fixation

Ce protocole suppose que le sujet a été implanté unilatéralement avec un réseau d'électrodes suprachoroïdien.

1. Préparer des solutions postfix dans des bouteilles en verre Schott.
   1. Fixateur de Davidson, 2x 100 ml
      • 2 ml de formol (formaldéhyde à 37%)
      • 10 ml d'acide acétique glacial (99,7%)
      • 35 ml d'éthanol (98%)
      • 53 ml d'eau distillée
   2. 50% d'éthanol, 2 fois 100 ml
   3. 70% d'éthanol, 2x 100 ml
2. Transcardiaque perfuser sujet au chaud (37 ° C) du sérum physiologique hépariné suivie par le froid (4 ° C) du formol tamponné neutre (10%).
3. Cravate suture au niveau du limbe supérieur (ou dans un endroit qui est éloigné de la matrice suprachoroïdienne) des deux yeux - en ligne avec un muscle grand droit, pour servir de point de repère.
4. yeux enucleate, le maintien de toutes les pistes externes de l'œil implanté.
5. Placez each œil dans 100 ml de solution fixateur de Davidson et de laisser à la post-fixer à la température ambiante.
6. Après 18 - 36 h dans le fixateur de Davidson, transfert à l'éthanol à 50% (à température ambiante) pour 6-8 heures, puis finalement à 70% d'éthanol (à température ambiante).
7. Réfrigérer les échantillons à 4 ° C et le magasin jusqu'à ce que la dissection.

Globes oculaires intacts et sous pression ont été stockés de cette manière pendant jusqu'à 3 mois sans nuire à l'histologie qui en résulte.

2. L'identification et la cartographie des tissus

Le protocole de fixation ci-dessus (étape 1) a rendu le translucide sclérotique et le tableau est maintenant visible - y compris les sites d'électrodes individuelles (Figure 3).

1. Retirez le globe implanté dans de l'éthanol et de l'assiette soigneusement loin excès de tissus, y compris la conjonctive et la capsule de Tenon. Coupez nerf optique à un 2 - longueur de 3 mm (figure 3A).
2. L'utilisation d'un colorant histologique marking schéma, l'étiquette des électrodes avec un code de couleur prédéfinie, en prenant soin de ne pas tacher le colorant.

• Nous avons choisi une suite disponible dans le commerce du colorant histologique spécialisé (voir annexe). De petites quantités de colorant ont été soigneusement appliqués avec un pinceau à pointe fine (taille Roymac 00) sur le tissu et on laisse sécher à l'air pour un maximum de 5 min.
• Pour nos besoins, nous avons choisi: vert pour l'électrode active (s) qui a (ont) stimulées au maximum, à des niveaux supraliminaires, pour la durée de l'étude, le rouge pour d'autres électrodes actives, le jaune pour les électrodes plus de retour de diamètre, et bleu de guides supplémentaires et / ou des marquages ​​de distance anatomiques (figures 3B et 3C).
• Quelques essais et erreurs peuvent être nécessaires pour trouver un colorant qui est stable tout au long des étapes ultérieures. Par exemple, dans la figure 4, on peut voir que le colorant vert était plus résistant que le colorant rouge. La dilution du colorant dans de l'éthanol à 70% permet d'améliorer Penet lipidiqueration et le revêtement de tissu.
• Il est utile de croquis ou photographie du globe teint pour référence future.

3. Retour à l'éthanol à 70% pour déshydrater le colorant.
4. Répétez l'étape 2.1 pour le globe de contrôle non implantés.
5. Utilisation des fils de suture à partir de l'étape 1.3, aligner l'oeil de commande et l'oeil implanté comme une paire en miroir.
6. Placer un gabarit de silicone (avec les mêmes dimensions que l'ensemble d'électrodes) à l'emplacement mis en miroir sur l'oeil de commande que l'implant se trouve sur l'oeil implanté (NB la sclérotique translucide et les marquages ​​de colorant de l'étape 2.2 de permettre une visualisation immédiate de la position de la matrice implantée ).
7. Effectuer les étapes 2,2 et 2,3 pour l'oeil de commande, de sorte que chaque emplacement de l'électrode implantée a une paire de commande dans un emplacement anatomique comparables (par exemple un miroir adapté équivalent).

3. Dissection et Embedding

1. Retirez l'ensemble de l'implant de l'oeil et de supprimer l'avant de l'oeil(Y compris la cornée, de l'iris et le cristallin). Retirez le corps vitré de l'œilleton restant (chambre postérieure).
2. Disséquer l'oeil implanté en de multiples bandes représentatifs (~ 2 mm d'épaisseur) contenant chacun un sous-ensemble des régions marquées colorant (figure 3D). Notez que l'orientation des bandes doit être choisi pour aider à évaluer divers aspects de la réponse tissulaire à l'implant ^7.

Il est utile, pour l'avenir, de faire un disque dont les régions colorants sont présents sur chaque bande et leurs positions relatives (et couleurs).

3. Placer la bande sur son côté dans un bassin peu profond de l'agar liquéfié (4%; 80 - 90 ° C) avec la partie à couper première face vers le bas (figure 3E).
4. Une fois la gélose a durci, couper autour de l'échantillon et le placer dans une cassette de tissu soutenu par des inserts en mousse (figure 3F).
5. Répétez les étapes 3.1-3.3 pour l'œil de contrôle - takING soin de disséquer miroir appariés bandes.
6. Traiter toutes les cassettes via la technique de traitement paraffine standard (automatisé nuit).
7. Intégrer tissu traité dans de la paraffine avec le côté à couper premières vers le bas.

4. Coupe et coloration

1. Couper des blocs de paraffine en 5 sections um référant régulièrement aux notes des étapes 2 et 3.
2. Recueillir sections de chacune des régions teints et monter sur des lames.

La région immédiatement adjacente à chaque spot teint de la sclérotique peut maintenant être évaluée avec certitude que c'était à proximité proche de l'électrode correspondante dans le tableau (figure 4).

3. Tacher ou effectuer immunofluorescence comme vous le souhaitez. Exemple taches et immunohistochimie de la figure 5 sont les suivantes: H & E Luxol rapide bleu (LFB); violet de crésyl; trichrome bleu de Masson; Schiff acide périodique (PAS); bleu de Prusse station de Perlsà; synthétase anti-glutamine (GS), protéine anti-neurofilaments (NF); anti-protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) et 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
4. Taches standards et spéciaux ont été réalisés comme détaillé:
   1. Coloration H & E a été réalisée selon le protocole fourni par Leica Multistainer bain ensemble ST5020 (Leica Biosystems).
   2. LFB violette et de crésyl (modifié par ^11):
      1. Déparaffiner dans 3 bains de xylène (3x 2 min) et 2 changements d'éthanol (100%, 100%) (2x 1 min) et rincer à l'eau du robinet (45 sec).
      2. Sections hydrate à 95% d'éthanol.
      3. Lieu en solution LFB ¹¹ à 37 - 42 ° C (la nuit).
      4. Rincez excès tache avec de l'éthanol à 70%.
      5. Rincer à l'eau distillée.
      6. Lieu de carbonate de lithium dilué (8%) (quelques secondes).
      7. Différencier dans l'éthanol à 70% (quelques secondes).
      8. Rincer à l'eau distillée.
      9. Répétez les étapes 4.4.2.6 à 4.4.2.8, si nécessaire, jusqu'à ce que background est incolore.
      10. Placer dans une solution d'acétate de crésyl violet de travail à 37 ° C (10 min).
      11. Ne pas laver à l'eau.
      12. Déshydrater en 3 changements d'alcool absolu (1x 30 sec, 2x 20 sec) et 3 bains de xylène (1x 1 min 30 sec, 2x 1 min).
      13. Mount et lamelle avec DPX.
   3. Trichrome bleu de Masson (modifié par ^11):
      1. Déparaffiner selon 4.4.2.1.
      2. Apportez sections à l'eau (2 min).
      3. Colorer les noyaux utilisant le fer hématoxyline de Weigert (2 min).
      4. Laver à l'eau du robinet, rincer à l'eau distillée.
      5. Colorer dans une solution de fuchsine écarlate acide Biebrich (5 min).
      6. Rincer à l'eau distillée.
      7. Différencier l'acide phospho-phosphotungstique jusqu'à collagène est rose pâle (6 min).
      8. Rincer à l'eau distillée.
      9. Contre-dans le bleu d'aniline (1 min).
      10. Bien se laver dans de l'acide acétique à 1% (1 min).
      11. Déshydrater, montage et lamelle comme per 4.4.2.12 et 4.4.2.13.
   4. PAS (modifié par ^11):
      1. Déparaffiner selon 4.4.2.1.
      2. Oxyder à l'acide périodique à 1% (15 min).
      3. Laver à l'eau de l'eau distillée puis courir.
      4. Colorer dans le réactif de Schiff (15 min).
      5. Laver à l'eau (5 min).
      6. Contre-avec Hématoxyline de Harris (1 min).
      7. Laver rapidement sous l'eau du robinet.
      8. Différencier dans l'alcool d'acide de 0,5% (1 dip).
      9. Bien laver à l'eau du robinet.
      10. Bleu dans l'eau du robinet de Scott (1 min).
      11. Bien laver à l'eau.
      12. Déshydrater, montage et lamelle selon 4.4.2.12 et 4.4.2.13.
   5. Bleu de Prusse de Perls tache comme décrit dans ^11.
5. Immunofluorescence a été réalisée comme détaillé:
   1. Déparaffiner selon 4.4.2.1.
   2. Rincer à l'eau distillée (2 x 5 min).
   3. Effectuer la récupération de l'antigène à l'aide de tampon citrate à 0,01%, un pH de 6 à 75 à 80 ° C (20 min) uned laisser refroidir dans une solution tampon de citrate à 0,01% (20 min).
   4. Laver les coupes dans du tampon phosphate salin (PBS) (2x 5 min).
   5. Perméabiliser la membrane cellulaire dans une solution tampon de lavage (10 minutes).
   6. Incuber dans une solution de sérum bloc (2 h).
   7. Incuber sections dans un seul anticorps primaire dilué dans du diluant d'anticorps (10% normal chèvre serum/0.1% Triton X-100/PBS) (une nuit dans le réfrigérateur). Le titre de chaque anticorps primaire utilisé est indiquée dans le tableau 1.
   8. Après une nuit d'incubation, laver les sections dans une solution tampon de lavage (5x 3 min). De ce point, gardez sections dans l'obscurité.
   9. Incuber les coupes dans l'anticorps secondaire correspondant à un titre de 1:500 pour une durée déterminée (voir le tableau 1 pour plus de détails).
   10. Laver les coupes dans une solution tampon de lavage (3x 5 min).
   11. Incuber les coupes dans DAPI (1:25.000 / PBS) (30 min).
   12. Laver les coupes dans une solution tampon de lavage (3x 5 min).
   13. Mount et lamelle en utilisant FluoresceMilieu de montage NT.

Les échantillons et les échantillons témoins sont prêts pour comparaison par paires.

Representative Results

La figure 4 montre une section représentative résultant de la coupe de l'échantillon représenté dans la figure 3. La section a été coupé à 5 um d'épaisseur et colorées avec H & E selon les protocoles décrits ci-dessus. La forme brute de la bande d'échantillon est conservé avec des artefacts de tissus différentielles minimales (figure 4A). Les deux marques de teinture étaient visibles sur la sclérotique, bien que le colorant vert a mieux résisté que le rouge (figure 4B). Les couches de la rétine n'ont pas été artifactually détachés et la morphologie rétinienne est préservée (figure 4C). Le tissu rétinien à côté des marques de colorant, ce qui correspond à l'emplacement des électrodes dans le réseau, peut être aisément identifié.

La figure 5 montre une coloration représentant spécial et immunohistochimie de coupes de tissus préparées selon le protocole en vigueur. Reportez-vous à la figure 5 caption et complémentaire Matériaux pour plus de détails sur les taches spécifiques et les modifications apportées à leur usage. Post-modification, ces taches et immunohistochimie étaient équivalentes aux normes établies - comme vérifié par les pathologistes.

Type d'anticorps primaire et titre (entre parenthèses)	GFAP (1:1500)	NF200 (1:100)	GS (1:100)
Type d'anticorps secondaire et titre (entre parenthèses)	Alexa Fluor 594	Alexa Fluor 488	Alexa Fluor 488
Durée de l'incubation de l'anticorps secondaire	1 heure	2 heures	45 min

Tableau 1. Type d'anticorps, Titre et durée de l'étiquetage.

Figure 1. SuprachoroIDAL Prototype réseau d'électrodes. A) Macro photographie d'un tableau moulé de qualité clinique. B) Photomicrographie d'un tableau préclinique à la main.

Figure 2. Ancien histologie rétine. Des méthodes histologiques standard ont été utilisés pour préparer ceux-ci, H & E taché, sections d'un oeil implanté avec un réseau d'électrodes suprachoroïdien. A) Une section orthogonale à travers la cavité de la matrice d'électrodes (représenté par une étoile). La rétine est détaché du tissu oculaire externe. Cela est particulièrement évident en dessous de la région implantée (flèche). Il est impossible de déterminer quelle partie de la rétine était à côté de chaque électrode de la matrice. Scalebar = 1 mm. B) A plus fort grossissement de la région encadrée dans le Panneau A. Il existe plusieurs, régulièrement espacés, des artefacts dans la rétine layers (flèches), ainsi que les principaux détachement de la couche tapetum (la couche réfléchissante en regard félin). Scalebar = 100 um. C) A plus fort grossissement de la région encadrée dans le panneau B. Sous-indiqué les segments externes des photorécepteurs, ainsi que l'épithélium pigmentaire, qui restent intacts, ce qui suggère que le détachement était un effet secondaire artefact du traitement, plutôt que d'être causée par un traumatisme ou in vivo pathologie. SCALEBAR = 20 um.

Figure 3. La localisation et la dissection de l'électrode-Adjacent tissus. J.-C.) High Dynamic Range photographies macro d'un œil énucléé, avec un réseau d'électrodes suprachoroïdien in situ. A) poste fixe avec fixateur de Davidson, et avant l'enlèvement de tableau, la sclérotique translucide permet de visualiserles électrodes individuelles dans le tableau (exemple unique indiquée par la flèche). B) Les électrodes sont marqués avec une couleur de teinture prédéfini. C) Marquage Dye espacement régulier de points de repère anatomiques sont utilisés pour maintenir la cohérence entre les expériences. D) Après le retrait de l' tableau, l'œil est découpé par main dans les bandes de l'échantillon. Les flèches colorées indiquent deux des sites adjacents d'électrodes sur la sclérotique. Pointillé jaune indique plan de coupe. E) Macro-photo de bande d'échantillon intégré dans un bloc de gélose. F) Macro photographie de la bande d'échantillon agar-embed partir du panneau E, découpé et placé dans une cassette d'intégration soutenu par des coussinets biopsie mousse pour minimiser le mouvement de la section en cours de traitement.

Figure 4. New histologie rétine. trong> La bande de l'échantillon ci-dessus (à partir de la figure 3D), contenant la poche d'électrode, a été inclus en paraffine, sectionnés à 5 um et colorées avec H & E. A) vert et régions teints rouges (indiqués par des flèches, identique à la figure 3D) sont visibles dans une section prise au niveau de la ligne en pointillés dans la figure 3D jaune. Barre d'échelle = 1.000 um. La rétine n'est pas détaché, ni au-dessous de la poche de tableau ni de loin. B) La région encadrée de Panel A avec un colorant rouge et vert visible indiqué par les flèches, et la rétine intacte tout au long. Barre d'échelle = 500 C) La région encadrée de Groupe B, montrant l'intact, ci-joint, la rétine à côté du colorant vert um.. Barre d'échelle = 50 um. Sachant que la localisation du colorant indique la position d'une électrode, on peut évaluer en toute confiance le tissu rétinien adjacent de dommages, le cas échéant, provoqué par une stimulation électrique.

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Figure 5. Des exemples de cytohistochemistry rétinienne modifié en utilisant des colorations spéciales et immunofluorescence. L'utilisation de fixateur de Davidson, par opposition à des techniques standard de formol de fixation, les modifications requises pour les protocoles de coloration habituelles, telles que décrites dans le texte du protocole principal. Les pathologistes ont confirmé que ces modifications ont entraîné une coloration équivalente. A) H & E haematoxylin taches noyaux de cellules violettes, tandis que éosine cytoplasme de la cellule, collagène et de soutien des tissus de diverses nuances de rose. B) LFB taches bleues myéline alors que la contre-coloration de violet de crésyl peut être utilisé pour . identifier les cellules ganglionnaires par coloration des corps de Nissl dans le bleu perikaryon et mettant en évidence les cellules satellites qui entourent les cellules C) trichrome bleu de Masson; l'écarlate de Biebrich-fuchsine acide solution taches muscle fibres rouge, tandis que les taches bleues aniline le collagène, dans ce cas, la sclérotique, bleu D) PAS;. composants de la glycoprotéine de membrane basale et les composants du tissu conjonctif sont colorées violet, tandis que le haematoxylin contre-colorants noyaux de cellules pourpre E) bleu de Prusse de Perls.; au niveau du site de l'hémorragie, la formation d'hémosidérine de globules rouges dégradées et la libération des complexes de fer produit une couleur pourpre tandis que l'addition de teintures rouge neutre lysosomes rouge F) GS;. ce neurotransmetteur enzyme dégradant trouvé dans les cellules de Müller ¹³ (vert ), peut être vu s'étendant dans les deux sens avec les corps cellulaires Müller dans la couche nucléaire interne et endfeet cellulaire Müller formant la membrane limitante interne G) NF-200;. cette chaîne lourde de protéine du cytosquelette (vert) trouvée dans le soma et les processus cellulaire , liaisons transversales avec d'autres neurofilaments pour maintenir la structure des neurones ^14,15. Ganglioncellules et leurs axones peuvent être vus dans la couche de cellules ganglionnaires et la couche de fibres nerveuses, tandis que les axones des cellules horizontales situées à la frontière extérieure de la couche nucléaire interne de la rétine félin, sont également mises en évidence. Contre-coloration au DAPI (bleu) permet la visualisation des couches de la rétine H) GFAP;. Cette protéine du cytosquelette (rouge) ont proliféré dans les cellules de Müller et les astrocytes pendant gliosis ^16, peut être vu en alignant la couche de fibres nerveuses avec les cellules de Müller formant des extensions minces par l'intérieur vers couches de la rétine externe. Contre-coloration au DAPI (bleu) permet de visualiser les couches de la rétine. Barre d'échelle = 50 um dans tous les panneaux. La rétine interne est affiché en haut de chaque image; la rétine externe est indiqué au bas de chaque image, à l'exclusion Groupe E, ce qui montre réaction subscleral.

Discussion

L'évaluation de la sécurité de l'implant est une considération primordiale pour les études précliniques. Avant une prothèse rétinienne peut être implanté chez l'homme, il est essentiel de vérifier que cela ne causera aucun préjudice. Cela nécessite une évaluation à la fois de la biocompatibilité des implants ^17-23 ainsi que tout dommage potentiel qui pourrait être causé par une stimulation électrique chronique ^24-26. Expérience avec des prothèses neurales similaires, tels que l'implant cochléaire, donne un aperçu du large éventail de stimulation et physiques, des paramètres qui ne causent pas de dommages aux tissus ^27. Cependant, la rétine a des caractéristiques différentes à d'autres sites d'implantation et les limites de sécurité donc précis (tels que la densité de charge maximum) ne peuvent pas être pris en charge dans des études antérieures dans d'autres systèmes. densités de charge sont les plus élevés dans les sites d'électrodes actives et cela correspond avec le plus grand potentiel de dommages. Par conséquent, une méthode pour localiser le tissu directement adjacentaux électrodes actives individuelles augmenterait considérablement l'utilité de ces études. Le tissu adjacent à des régions spécifiques de l'implant peut également être mis en évidence pour une inspection plus minutieuse. Cette approche ciblée permet moins de sections à analyser, tout en conservant la confiance que le "scénario du pire" a été examiné.

La méthode de localisation de colorant scléral décrit ici a été testé avec du silicone en forme de main et moulé / Pt matrices d'électrodes ^28-30. Il a été utilisé avec couche mince polyamide tableaux ^7,31 et aussi mince pellicule de silicone / Pt tableaux ^32. Certaines études prothèses rétiniennes employées électrodes "puce en forme" avec implantations intrascléral ^33. La présente technique devrait être efficace pour évaluer ce type de matrices d'électrodes. Regard félin avec sclérotique mince (épaisseur au pôle postérieur 90 - 200 um) a permis la visualisation des électrodes individuelles dans un tableau. Cependant, même si electro individueldes n'étaient pas visibles, leurs positions peuvent être facilement déduites en utilisant un modèle de silicone lorsque le contour du tableau peut être vu (similaire à celui utilisé dans l'étape 2.6).

La cartographie colorant limite la nécessité d'obtenir des coupes de tissus non pertinentes car seuls les sections avec le colorant présent sont obtenus. La possibilité de déduire avec précision la position de l'électrode permet non seulement l'analyse histopathologique pertinentes et une plus grande puissance statistique, mais a un impact majeur sur la gestion du temps et de l'argent en réduisant la quantité de lames et les lames utilisées ainsi que le coût du travail. L'utilisation d'un colorant qui est adhérente et peut résister à la transformation du tissu, tout en étant également visible dans les coupes de tissus non colorées est importante examen initial. La connaissance de la localisation du colorant et de l'orientation du tissu au cours de la dissection et intégrant assiste le processus de coupe. Cela comprend les orienter correctement le bloc de parvenir à une section qui n'est pas coupé obliquement et donne un representati pleinsur du tissu. Il est donc important que la personne qui effectue la coupe est présent au moment de l'application de la teinture, la dissection et l'intégration.

Le protocole global est robuste aux modifications mineures, notamment avec des timings de fixation. Cependant, la dissection de l'oeil et les étapes de marquage colorant sont des opérations délicates qui bénéficient d'une bonne dextérité manuelle pour éviter d'endommager le spécimen. Alors que le fixateur de Davidson s'est avéré efficace pour réduire les artefacts détachement de la rétine à proximité d'un implant, il n'empêche pas les dommages mécaniques directe lors de la dissection. Le fixateur de Davidson était difficilement compatible avec certaines procédures histologiques et immunohistochimiques spéciales. Par conséquent, il était nécessaire de modifier / optimiser ces étapes comme détaillé ci-dessus. Les changements progressifs dans les temps et les concentrations coloration ont été faites jusqu'à ce que le résultat optimal a été atteint - pour plus de détails, reportez-vous aux documents supplémentaires.

Quantification de la rétinehistologie reste problématique. La rétine est non homogène et à la fois l'épaisseur et la variation de la densité des cellules avec l'augmentation de distance depuis la zone centralis ^34,35. Par conséquent, les tissus voisins dans l'oeil implanté ne peut pas être utilisé pour des comparaisons et un œil de contrôle est utilisé à la place. Par paires de chaque section correspondant à l'œil de commande nous donne une comparaison statistique plus puissant des changements pathologiques; résultats d'efficacité et de sécurité avec les prothèses rétiniennes sont mieux évaluées en comparant les yeux compagnon dans un sujet ^36. Des précautions particulières doivent être prises pour minimiser coupe oblique car cela affecterait la quantification.

En résumé, les méthodes décrites ci-dessus ont considérablement amélioré notre analyse histopathologique, qui à son tour a donné lieu à un flux de travail préclinique plus efficace. Les résultats des études précliniques utilisant ces méthodes conduit directement à un essai clinique dans lequel 3 patients atteints de RP ont été implantés en toute sécurité avec suprachoroidal prothèses rétiniennes. Ces méthodes sont utiles à la fois pour les stimulateurs rétiniens et autres implants oculaires où la réponse pathologique à l'implantation à long terme doit être évalué. Cette méthode a donné des avantages intéressants pour le maintien de la cytoarchitecture et l'enregistrement de la pathologie de régions d'intérêt sur l'implant. Bien que n'étant pas spécifiquement testées, une modification de ces procédures peut être utilisé dans d'autres espèces et d'autres emplacements anatomiques, en particulier là où un tableau est implanté superficiellement.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
The Davidson marking system	Bradley Products	1163-4 - red 1163-5 - blue 1163-2 - yellow 1163-1- green
Rabbit Polyclonal Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody	Millipore	AB5804	1:1500, overnight incubation
Mouse Monoclonal Anti-Glutamine Synthetase Antibody	Millipore	MAB302	1:100 overnight incubation
Monoclonal Mouse Anti-Neurofilament 200 Antibody	Sigma-Aldrich	N0142	1:100 overnight incubation
4',6-diamindino-2-phenylindole, dilactate (dilactate)	Life Technologies	D3571	1:25,000 30 min incubation
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG	Life Technologies	A11029	1:500
Superfrost 90° yellow	Grale Scientific	SF41299
FLEX IHC Microscope Slides	DAKO	K802021-2
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG	Life Technologies	A11037	1:500
Normal goat serum	Life Technologies	PCN5000	10% serum/0.1% Triton X-100/PBS
Non-Standard Solution Preparation for Special Stains 1% Aqueous Cresyl Violet Stock Solution Cresyl violet 1 g Distilled water 100 ml Cresyl Violet Acetate Working Solution 1% aqueous cresyl violet stock solution 9 ml Distilled water 51 ml 10% acetic acid 0.5 ml Biebrich Scarlet-Acid Fuchsin Solution 1% Beihrich scarlet 90 ml 1% acid fuchsin 10 ml Glacial acetic acid 1 ml Phosphomolybdic-Phosphtungstic Acid Solution Phosphomolybdic acid 2.5 g Phosphotungstic acid 2.5 g Distilled water 100 ml Aniline Blue Solution Aniline blue 2.5 g Glacial acetic acid 2 g Distilled water 100 ml Solutions for Immunohistochemistry Wash Buffer Solution 0.1% Triton X-100 in Phosphate buffered saline (PBS) Serum Block Solution 10% normal goat serum/0.1% Triton X-100 in PBS SUPPLEMENTARY MATERIAL Luxol Fast Blue The purpose of performing a Luxol Fast Blue (LFB) stain was to identify the ganglion cells in the ganglion cell layer through the counterstain of cresyl violet. While LFB stains myelin, the cresyl violet stain binds to the Nissl substances in neurons, composed of rough endoplasmic reticulum and ribosomes. Numerous cells in the retina contain Nissl substance including amacrine cells. These cells usually are located in the inner boundary layer of the inner nuclear layer, but displaced amacrine cells can be found in the ganglion cell layer. The staining of Nissl substance is helpful in differentiating large, heavily stained ganglion cells from smaller displaced amacrine cells. To aid visualisation of these cells, we modified the cresyl violet working solution protocol by increasing the volume of the cresyl violet stock solution in the working solution. We increased the volume in 1.0 ml increments from 6.0 ml to 9.0 ml, in turn reducing the volume of distilled water. Assessing the ease of visualising and identifying the ganglion cells, optimal staining was achieved with 9 ml of additional cresyl violet stock solution and 51 ml of distilled water. Cresyl violet is a basic dye, though to dye the Nissl substance, it is required to be used in an acidic solution, and therefore the volume of acetic acid remained unchanged at 0.5 ml. Periodic Acid Schiff The Periodic Acid Schiff (PAS) stain was performed to highlight polysaccharides especially glycogen, found in basement membranes and fungal cell walls, indicating a fungal infection. The process of the PAS stain is to oxidise the hydroxyl groups in polysaccharides using periodic acid, producing aldehyde groups. The application of the Schiff reagent, binds to the aldehyde groups producing a magenta color with haematoxylin counterstaining producing purple cell nuclei. Our slides showed weak staining at the inner limiting membrane. This may be due to the polysaccharides present, as not all polysaccharides can be oxidised with a standard time frame, especially those containing anionic polysaccharides. We therefore increased the duration of the oxidation step from 10 min to 12, 15, and 20 min. We found that a 15 min oxidation step was most effective in PAS staining. Masson’s Trichrome Blue The principle of the Masson's trichrome blue stain is to stain collagen and muscle, which in our retinal slides can be used to indicate an increase in collagen tissue which may indicate fibrosis due to injury. This stain is sensitive to fixation techniques, so alterations were needed to obtain optimal staining. The process of this stain is to initially stain cytoplasm and muscle fibres red using the acidic Biebrich scarlet-acid fuchsin red dye. Differentiation with phosphomolybdic/phosphotungstic acid competes with the red dye in the collagen fibres. In the sclera, the large phosphomolybdic/phosphotungstic acid molecules are able to penetrate the loose connective tissue, as opposed to the dense muscle fibres which are penetrable to small molecules only. Aniline blue dye is then applied to replace the acid in the collagen fibres producing blue dyed sclera. To optimise this stain in retinal sections, the duration of staining with Biebrich scarlet-acid fuchsin dye was reduced to create a balance between the blue and the red dye. The use of Davidson's fixative also required an extended differentiation time to remove the red dye from the collagen. We trialled differentiation at 5, 6, 8, and 10 min, with optimal results occurring at 6 min. Differentiation also varies on the thickness and cutting of smooth sections, with greater than 6 min differentiation possibly being required. Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Antibody Polyclonal, host species is rabbit, has a molecular weight of 50 kDa. GFAP antigen is an intermediate filament found in the cytoplasm (the cytoplasm of astrocytes and Müller cells in the retina), the antigen is made form 428 amino acids and has a molecular weight of 49512 Da. Neurofilament-200 antibody Monoclonal, host species is mouse, clone N52, isotype IgG1, it recognises phosphorylated and non-phosphorylated forms of the heavy neurofilaments which have a molecular weight of 200 kDa. The antibody will bind to an epitope in the tail domain of the neurofilament. The antibody will stain neurofilaments in the neuronal perikarya, dendrites and axons. Glutamine Synthetase (GS) antibody Monoclonal, clone GS-6, host species is mouse, has a molecular weight of 45 kDa and antibody isotype IgG2a. The GS antigen is found in the cell cytoplasm (cytoplasm of Müller cells in the retina), the antigen has 373 amino acids and a molecular weight of 42,064 Da.