Teknikker for Processing Eyes implantert med en retinal protese for Lokalisert Histopatologisk analyse

Summary

Teknikker for å visualisere retinal cytoarchitecture direkte tilknytning til individuelle elektroder i en retinal stimulator.

Abstract

Med den siste utviklingen av netthinnens proteser, er det viktig å utvikle pålitelige teknikker for å vurdere sikkerheten til disse enhetene i prekliniske studier. Men standard fiksering, forberedelse og automatiserte histologi prosedyrer er ikke ideelt. Her beskriver vi nye rutiner for å vurdere helsen til netthinnen direkte tilknytning til et implantat. Retinal proteser har elektrode arrays i kontakt med øyevevet. Tidligere metoder har ikke vært i stand til romlig lokalisere øyevevet tilknytning til enkelte elektroder i matrisen. I tillegg resulterer standard histologisk behandling ofte i brutto artifactual avløsning av netthinnens lag ved vurdering av implanterte øyne. Følgelig har det vært vanskelig å vurdere lokaliserte skader hvis dette er tilstede forårsaket av implantasjon og stimulering av en implantert elektrode matrise. Derfor er det utviklet en fremgangsmåte for å identifisere og lokalisere det okulære vev naboliggende til implantert electrodes ved hjelp av en (fargekodet) fargestoff merkeordning, og vi endret en øyefiksjon teknikk for å minimere artifactual netthinneavløsning. Denne metoden har også gjengitt sclera gjennomskinnelig, slik at lokalisering av de enkelte elektroder og bestemte deler av et implantat. Til slutt brukte vi en matchet kontrollgruppe for å øke kraften i de histopatologiske vurderinger. I sammendrag, gjør denne metoden pålitelig og effektiv diskriminering og vurdering av retinal cytoarchitecture i et implantert øye.

Introduction

Retinal proteser kan fort bli nyttige kliniske intervensjoner for behandling av ulike former for alvorlig synstap. Visse forhold, slik som retinitis pigmentosa (RP), resultere i omfattende degenerasjon av fotoreseptorer i øyet, dette er de celler som er ansvarlige for transdusering av lys inn nevrale signaler. Men noen celler i andre lag av netthinnen fortsatt, og er potensielle mål for elektrisk stimulering med en retinal protese ^en. Tidlige resultater fra kliniske studier har vært lovende for elektrode arrays implantert i Epiretinal ^{2,3, 4,5} subretinal og intrascleral ^seks steder. Disse enhetene er laget av forskjellige materialer med forskjellige former, men bruker elektriske pulser for å aktivere de gjenværende levedyktige nerveceller i netthinnen for å skape visuelle percepts.

Vår bredere gruppe (Bionic Vision Australia) har utviklet en retinal implantat som har progressivsed til en klinisk pilotstudie med tre RP pasienter implantert med suprakoroidale elektrode arrays (Clinical Trial Antall: NCT01603576). Figur 1A viser dette suprakoroidale prototype retinal protese.

Pasientens sikkerhet er viktig i kliniske studier, og dermed før du begynner menneskelige forsøk, utførte vi omfattende akutt og kronisk testing i prekliniske modeller (figur 1B). Histopatologiske vurderinger var viktig å avgrense de kirurgiske prosedyrer, iterere gjennom elektrode design, og til slutt etablere sikkerhet av implantatet. For å opprettholde en effektiv arbeidsflyt tappet med standard kliniske patologi praksis, ble en parafin embedding teknikk ansatt. Det var også ønskelig å anvende prosedyrer flekker med sammenlignbare kliniske standarder, for eksempel hematoxylin og eosin (H & E), som er lett tolket av pathologists. Vi ønsket også en teknikk som kan tilpasses for immunhistokjemiske analyser,For å lette videre mobilnettet evaluering av vev.

Den biocompatibility av implantatet materialer, og sikkerhet for kronisk elektrisk stimulering, må vurderes nøye. Det er viktig å være i stand til å undersøke den histopatologi av okulært vev tilstøtende til de enkelte stimulerende elektroder i matrisen. Imidlertid arrays måtte fjernes før prosessering prøvene, slik at de kan bli testet, og fordi deres metallkomponenter ikke kunne være lett seksjoneres. Derfor gjorde vår etablerte vev forberedelse ikke tillate lokalisering og kartlegging av vev med hensyn til de implanterte elektroder ^7. I tillegg til mangelen på en vev lokalisering metode, resulterte standard formaldehyd-baserte fiksering og behandlingsteknikker i utbredt gjenstander og avløsning av retinal på grunn av den differensielle krympning av de forskjellige lagene i øyet (figur 2). På grunn av den ikke-homogenitet av than netthinnen, var det vanskelig å fatte gyldige sammenligninger med kontroll vev, spesielt for kvantitative målinger. Disse kombinerte begrensninger komplisert nøyaktige vurderinger av potensiell skade forårsaket av våre implantert arrays.

Her presenterer vi nye teknikker for å overvinne disse begrensningene. Vi har endret spesialiserte øyefiksjon og behandling teknikker ^8-10 å opprettholde kompatibiliteten med parafin-baserte histologi. Vi har endret standard histologiske og immunhistokjemiske flekker å gi sammenlignbare resultater, basert på tilbakemeldinger fra kliniske patologer. Etter å gjengi Innbukking vev gjennomskinnelig, ble en dye-basert fargekode ansatt for å markere øyevevet tilknytning til hver enkelt elektrode, før du fjerner matrisen fra suprakoroidale plass. Ved å markere elektroden array og de enkelte elektrodestedene, kan prøvene være nøyaktig samlet inn fra elektrode naboregionene. Matchet prøvene kunne bli samlet inn fra the kontroll øye for å lette parvise sammenligninger.

Protocol

En. Enucleation og Post-fiksering

Denne protokollen forutsetter at faget har blitt implantert ensidig med en suprakoroidale elektrode array.

1. Forbered postfix løsninger i glass Schott flasker.
   1. Davidsons bindemiddel løsning, 2x 100 ml
      • 2 ml formalin (37% formaldehyd)
      • 10 ml iseddik (99,7%)
      • 35 ml etanol (98%)
      • 53 ml destillert vann
   2. 50% etanol, 2x 100 ml
   3. 70% etanol, 2x 100 ml
2. Transcardially perfuse gjenstand med varm (37 ° C) heparinisert saltløsning fulgt av kaldt (4 ° C) nøytral bufret formalin (10%).
3. Knyt sting på den overlegne limbus (eller et sted som er fjerntliggende fra suprakoroidale array) av begge øyne - i tråd med en rectus muskler, for å tjene som et landemerke.
4. Enucleate øyne, opprettholde noen utlagte ledere fra den implanterte øyet.
5. Plasser EACh øye i 100 ml Davidson bindemiddel løsning og la til post-fikse ved romtemperatur.
6. Etter 18 - 36 timer i Davidsons bindemiddel, overføre til 50% etanol (romtemperatur) i 6-8 time, deretter til slutt til 70% etanol (romtemperatur).
7. Kjøle prøver ved 4 ° C og oppbevar til disseksjon.

Intakte og trykksatt øye kupler har blitt lagret på denne måte i opp til 3 måneder uten ugunstig å påvirke den resulterende histologi.

2. Identifisering og Tissue Mapping

Den ovenfor fiksering protokollen (trinn 1) er gjengitt sclera gjennomskinnelig og matrisen er nå synlig - herunder de enkelte elektrode-områder (figur 3).

1. Fjern implantert kloden fra etanol og nøye trimme vekk overflødig vev, inkludert conjunctiva og Tenon sin kapsel. Trim synsnerven til en 2-3 mm lengde (figur 3A).
2. Ved hjelp av en histologisk fargestoff Marking ordningen, etikett elektrodene med en forhåndsdefinert fargekode, tar seg ikke å gni fargestoffet.

• Vi valgte en kommersielt tilgjengelig suite av spesialiserte histologisk fargestoff (se vedlegg). Små mengder av fargestoffet ble forsiktig påført med en fin spiss pensel (Roymac størrelse 00) til vevet og tillatt å lufttørke i opp til 5 min.
• For vårt formål, har vi valgt: grønn for den aktive elektroden (e) som var (var) stimulert maksimalt, på suprathreshold nivåer, for varigheten av studien, rødt for andre aktive elektroder, gul for de større diameter returelektroder, og blå for flere veiledninger og / eller anatomiske avstand merking (Tall 3B og 3C).
• Noen prøving og feiling kan være nødvendig å finne et fargestoff som er stabil gjennom de etterfølgende trinn. For eksempel, i figur 4, kan det sees at dette fargestoff var mer elastisk enn det røde fargestoff. Fortynne fargestoff i 70% etanol bidrar til å forbedre lipid Penetrasjon og vev belegg.
• Det er nyttig å skissere eller fotografere farget verden for fremtidig referanse.

3. Retur til 70% etanol for å dehydrere fargestoff.
4. Gjenta trinn 2.1 for unimplanted kontroll kloden.
5. Ved hjelp av sting fra trinn 1.3, justere kontroll øyet og implantert øyet som en speilet par.
6. Plasser en silikon-malen (med de samme dimensjoner som den elektrode array) i speilvendt posisjon på kontroll øye som implantatet er plassert på implanterte øyet (NB den gjennomskinnelige sclera og fargestoffet markeringene fra trinn 2.2 tillate klar visualisering av det implanterte matrise stilling ).
7. Utfør trinn 2.2 og 2.3 for kontroll øyet, slik at hver implantert elektrode stedet har kontroll pair i en anatomisk sammenlignbare (dvs. speil matchet tilsvarende) plassering.

3. Disseksjon og Embedding

1. Fjerne implantatet matrise fra øyet og ta ut foran øyet(Inkludert cornea, iris og linsen). Fjern glasslegemet fluid fra den gjenværende øyekopp (bakre kammer).
2. Skjær det implanterte øyet inn i flere representative strimler (~ 2 mm tykkelse) som hver inneholder en delmengde av fargestoffmolekylene merkede områder (figur 3D). Legg merke til at retningen av strimlene bør velges for å bistå i å vurdere ulike aspekter av vevsrespons til implantatet ^7..

Det er nyttig, for fremtidig referanse, for å lage en oversikt over hvilke fargestoff regionene er til stede på hver stripe og deres relative steder (og farger).

3. Plasser stripe på sin side i et grunt basseng av flytende agar (4%, 80-90 ° C) med den siden som skal kappes første vendt nedover (Figur 3E).
4. Når agar har satt, kuttet rundt prøven og sted inn i en vev kassett støttes av skuminsats (figur 3F).
5. Gjenta trinn 03.01 til 03.03 for kontroll øye - taking omsorg å dissekere speil-matchet strimler.
6. Behandle alle kassetter via standard (automatisert natten) parafin prosessering.
7. Embed behandlet vev i parafin med den siden som skal kappes første vendt nedover.

4. Kutting og Beising

1. Skjær parafinblokker inn fem mikrometer seksjoner henviser regelmessig til notatene fra trinn 2 og 3.
2. Samle seksjoner fra hver av de fargede områdene og montere på lysbilder.

Regionen umiddelbart tilstøtende til hver farget flekk av sclera kan nå vurderes med tillit til at det var i nærmeste nærhet til den tilsvarende elektrode i rekken (fig. 4).

3. Beis eller utføre immunfluorescens som ønsket. Eksempel flekker og immunhistokjemi vist i figur 5 er: H &E; Luxol fort blå (LFB); cresyl fiolett; Masson er Trikrom blå, periodiske syre Schiff (PAS), Perls 'prøyssiske blå stai, anti-glutamin-syntetase (GS), anti-protein neurofilament (NF), anti-glial fibrillary surt protein (GFAP) og 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
4. Standard og spesielle flekker ble utført som beskrevet:
   1. H & E farging ble utført i henhold til protokollen levert av Leica Multistainer bad rekke ST5020 (Leica Biosystems).
   2. LFB og cresyl fiolett (endret fra ^11):
      1. Dewax i tre med xylen (3 x 2 min) og to endringer av etanol (100%, 100%) (2 x 1 min), og skylling i springvann (45 sek).
      2. Hydrat deler til 95% etanol.
      3. Sted i LFB løsning ¹¹ ved 37-42 ° C (over natten).
      4. Skyll av overflødig beis med 70% etanol.
      5. Skyll i destillert vann.
      6. Sted i fortynnet litiumkarbonat (8%) (noen sekunder).
      7. Differensiere i 70% etanol (noen sekunder).
      8. Skyll i destillert vann.
      9. Gjenta trinn 4.4.2.6 til 4.4.2.8, om nødvendig, til background er fargeløs.
      10. Sted i cresyl fiolett acetat fungerende løsning ved 37 ° C (10 min).
      11. Ikke vask i vann.
      12. Dehydrerer i tre endringer av absolutt alkohol (1x 30 sek, 2x 20 sek) og tre endringer av xylen (1x 1 min 30 sek, 2x 1 min).
      13. Mount og dekkglass med DPX.
   3. Masson er Trikrom blå (endret fra ^11):
      1. Dewax pr 4.4.2.1.
      2. Ta med deler til vann (2 min).
      3. Stain kjerner hjelp Weigert sin jern haematoxylin (2 min).
      4. Vask i vann, skyll i destillert vann.
      5. Flekk i Biebrich scarlet-syre fuchsin løsning (5 min).
      6. Skyll i destillert vann.
      7. Differensiere i phosphomolybdic-Phosphotungstic syre til kollagen er blek rosa (6 min).
      8. Skyll i destillert vann.
      9. Counterstain i anilin blå (1 min).
      10. Vask godt i 1% eddiksyre (1 min.)
      11. Dehydrere, montere og dekkglass som peh 4.4.2.12 og 4.4.2.13.
   4. PAS (endret fra ^11):
      1. Dewax pr 4.4.2.1.
      2. Oksidere i 1% periodsyre (15 min).
      3. Vask i rennende vann og destillert vann.
      4. Flekken i Schiffs reagens (15 min).
      5. Vask i vann (5 min).
      6. Counterstain med Harris haematoxylin (1 min).
      7. Vask kort i vann fra springen.
      8. Differensiere i 0,5% syre alkohol (en dukkert).
      9. Vask godt i vann fra springen.
      10. Blue in Scotts vann fra springen (1 min).
      11. Vask godt i vann.
      12. Dehydrere, montere og dekkglass som per 4.4.2.12 og 4.4.2.13.
   5. Perls 'prøyssiske blå flekken som beskrevet i ^11..
5. Immunfluorescens farging ble utført som beskrevet:
   1. Dewax pr 4.4.2.1.
   2. Skylling i destillert vann (2 x 5 min).
   3. Utfør antigen gjenfinning ved hjelp av 0,01% citratbuffer, pH 6 ved 75 - 80 ° C (20 min) end avkjøl på 0,01% citrat-bufferoppløsning (20 min).
   4. Vask seksjoner i fosfatbufret saltvann (PBS) (2 x 5 min).
   5. Permeabilize cellemembranen i vaske-buffer-oppløsning (10 min).
   6. Inkuber i serum blokk løsning (2 timer).
   7. Inkuber seksjoner i en enkelt primære antistoffet fortynnes i antistoff fortynning (10% normal geit serum/0.1% Triton X-100/PBS) (over natten i kjøleskap). Den titer av hver primære antistoff som brukes er vist i tabell 1.
   8. Etter inkubasjon over natten, vask seksjoner i vaskebuffer-løsning (5 x 3 min). Fra dette punktet, holde seksjoner i mørket.
   9. Inkuber seksjoner i tilsvarende sekundært antistoff på et titer 1:500 for en bestemt varighet (se tabell 1 for detaljer).
   10. Vask seksjoner i vaskebuffer-løsning (3 x 5 min).
   11. Inkuber seksjoner i DAPI (1:25,000 / PBS) (30 min).
   12. Vask seksjoner i vaskebuffer-løsning (3 x 5 min).
   13. Mount og dekkglass hjelp fluorescent montering media.

Prøver og kontrollprøver er klar for parvise sammenligningen.

Representative Results

Fig. 4 viser et representativt snitt oppnådd fra kutting av prøven er vist i figur 3.. Seksjonen ble kuttet med 5 mikrometer tykkelse og farget med H & E i henhold til fremgangsmåtene beskrevet ovenfor. Brutto form av prøven strimmel er konservert med minimal differensielle vev artefakter (figur 4A). Begge tegninger fargestoff var synlige på sklera, selv om dette fargestoff var mer elastisk enn det røde (figur 4B). Netthinnens lag ble ikke artifactually frittliggende og netthinnens morfologi er bevart (Figur 4C). De retinale vev naboliggende til fargestoffet tegninger, som tilsvarer plasseringen av elektrodene i matrisen, kan lett identifiseres.

Figur 5 viser representative spesiell farging og immunohistokjemi av vevssnitt fremstilt i henhold til den aktuelle protokoll. Se Figur 5 caption og supplerende materiale for flere detaljer om de spesifikke flekker og modifikasjoner ved deres bruk. Post-modifikasjon, disse flekkene og immunhistokjemi tilsvarte etablerte standarder - som verifisert av patologer.

Typen primær antistoff og titer (i parentes)	GFAP (1:1500)	NF200 (1:100)	GS (1:100)
Type sekundært antistoff og titer (i parentes)	Alexa Fluor 594	Alexa Fluor 488	Alexa Fluor 488
Inkubasjonsvarigheten av sekundær antistoff	1 time	2 hr	45 min

Tabell 1. Antistoff Type, Titre og varighet av merking.

Figur 1. Suprachoroidal Prototype elektrode Array. A) Macro fotografi av en klinisk karakter støpt array. B) Lysmikroskopibilde av en håndlaget preklinisk array.

Figur 2. Tidligere Retinal Histologi. Standard histologiske metoder ble brukt til å forberede disse, H & E farget, deler av et øye implantert med en suprakoroidale elektrode array. A) En rettvinklet snitt gjennom elektroden array hulrom (avbildet med en stjerne). Netthinnen er løsrevet fra den ytre øyevevet. Dette er spesielt tydelig under den implanterte region (pil). Det er umulig å bestemme hvilken del av netthinnen var tilstøtende til hver enkelt elektrode i matrisen. Scalebar = 1 mm. B) En høyere forstørrelse av eske regionen i Panel A. Det er flere, regelmessig linjeavstand, artefakter i retinal Layers (piler), så vel som store løsgjøring fra den tapetal lag (det reflekterende lag i feline øyne). Scalebar = 100 mikrometer. C) En høyere forstørrelse av eske regionen i panel B. Pil indikerte de ytre segmenter av fotoreseptorer, samt den pigmental epitel, som forblir intakt, noe som tyder på at løsgjøring var en kunstig bi-effekt av behandlingen, i motsetning til å være forårsaket av en in vivo-trauma eller patologi. Scalebar = 20 mikrometer.

Figur 3. Lokalisering og Dissection av elektrode-tilstøtende vev. AD) High Dynamic Range makro fotografier av en enucleated øye, med en suprakoroidale elektrode array in situ. A) Post fast med Davidsons bindemiddel, og før matrise fjerning, gjør den gjennomskinnelige sclera visualisering avde enkelte elektroder i matrisen (eneste eksempel indikert med pil). B) Elektrodene er merket med en forhåndsdefinert fargestoff farge. C) Dye markeringer ved jevne mellomrom fra anatomiske landemerker brukes til å opprettholde konsistens på tvers av eksperimenter. D) Ved fjerning av rekke, blir øye dissekert for hånd inn sample strimler. Fargede pilene viser to av elektroden tilstøtende områder på sclera. Gul stiplet linje angir planet av seksjonering. E) Makro-fotografi av prøven stripe integrert i en agar blokk. F) Macro bilde av agar-embed sample stripe fra Panel E, klippe ut og plassert i en embedding kassett støttes av skum biopsi pads for å minimalisere bevegelse av seksjonen under behandlingen.

Figur 4. New Retinal Histologi. Trong> Eksemplet over stripen (fra figur 3D), som inneholder elektroden lomme, var parafininnstøpt, seksjonert ved 5 uM og farget med H & E. A) grønt og rødt farget regioner (angitt ved piler, samme som figur 3D) er synlige i et snitt tatt på nivået av den gule stiplede linjen i figur 3D. Scale bar = 1000 mikrometer. Netthinnen er ikke frittliggende, verken under rekke lommen eller eksternt. B) Det eske regionen fra Panel A med synlig rødt og grønt fargestoff markert med piler, og intakt netthinnen hele. Scale bar = 500 mikrometer. C) Den eske regionen fra Panel B, viser intakt, festet, netthinnen ved siden av grønt fargestoff. Scale bar = 50 mikrometer. Å vite at plasseringen av fargestoffet indikerer posisjonen til en elektrode, kan vi trygt vurdere tilstøtende retinalt vev er skadet, om noen, forårsaket av elektrisk stimulering.

ve_content "fo: keep-together.within-page =" always ">
Figur 5. Eksempler på modifisert retinal cytohistochemistry ved hjelp av spesielle flekker og immunofluorescence. Bruk av Davidsons bindemiddel, i motsetning til standard formalin fiksering teknikker, kreves endringer på de vanlige fargingsprotokoller, som beskrevet i den viktigste protokollen teksten. Patologer har bekreftet at disse endringene resulterte i tilsvarende farging. A) H &E; haematoxylin flekker cellekjerner lilla mens eosin flekker celle cytoplasma, kollagen og støttende vev ulike nyanser av rosa. B) LFB flekker myelin blå mens cresyl fiolett counterstain kan brukes til å . identifisere ganglion celler ved farging Nissl organer innenfor perikaryon blå og utheving satellitt celler som omgir cellene C) Masson er Trikrom blå, den Biebrich scarlet-syre fuchsin løsning flekker muskel fimene rødt, mens den anilin blå flekker kollagen, i dette tilfellet sklera, blå D) PAS,. glykoprotein komponenter av basalmembran og bindevev komponenter er farget fiolett, mens hematoxylin counterstains cellekjerner lilla E) Perls 'Prøyssiske blå.; på stedet av blødninger, produserer dannelsen av haemosiderin fra degradert røde blodceller og frigjøring av jern komplekser en lilla farge, mens tillegg av nøytrale røde beisfarger lysosomene rød F) GS;. dette signalstoffet nedverdigende enzym som finnes i Müller celler ¹³ (grønn ), kan sees som strekker seg i begge retninger med Muller cellelegemer i den indre kjerne og sjikt Müller celle endfeet danner den indre begrensende membranen G) NF-200;. denne tungkjede cytoskeletal protein (grønn) som finnes i cellen soma og prosesser , crosslinks med andre neurofilaments å opprettholde strukturen i nevroner ^14,15. Ganglionceller og deres aksoner kan sees i ganglion cellelaget og nervefiber laget, mens aksonene av horisontale celler lokalisert ved den ytre grensen av den indre kjerne laget i feline netthinnen, blir også markert. Kontrafarging med DAPI (blå) tillater visualisering av netthinnens lag H) GFAP;. Dette cytoskeletal protein (rød) proliferated i Müller celler og astrocytes under gliosis ^16, kan sees lining nerve fiber lag med Müller celler danner tynne utvidelser gjennom den indre til ytre netthinnens lag. Kontrafarging med DAPI (blå) muliggjør visualisering av de retinale lag. Scale bar = 50 mikrometer i alle paneler. Den indre netthinnen er vist ved toppen av hvert bilde, og den ytre retina er vist ved bunnen av hvert bilde, unntatt Panel E, som viser subscleral reaksjon.

Discussion

Bedømme sikkerheten til implantatet er et grunnleggende hensyn for prekliniske studier. Før en retinal protese kan bli implantert i mennesker er det viktig å kontrollere at det ikke vil føre til noen skade. Dette krever en vurdering av både implantatet biokompatibilitet ^17-23, så vel som en hvilken som helst potensiell skade som kan være forårsaket av vedvarende elektrisk stimulering ^24-26. Erfaring med lignende nevrale proteser, som cochlea-implantat, gir innsikt i det brede spekter av stimulering, og fysiske, parametere som ikke forårsake vevsskade ^27. Imidlertid har netthinnen ulike egenskaper til andre implantasjoner og derfor presise sikkerhet grenser (for eksempel maksimal ladningstetthetsfordeling) ikke kan antas fra tidligere studier i andre systemer. Charge tettheter er høyest på de aktive elektrodestedene og dette samsvarer med det største potensialet for skade. Derfor er en fremgangsmåte for lokalisering av vevet direkte tilstøtendetil de enkelte aktive elektroder vil i stor grad øke nytten av disse studiene. Den vev naboliggende til spesifikke regioner av implantatet kan det også trekkes frem for nærmere undersøkelse. Dette målrettet tilnærming tillater færre deler som skal analyseres, og samtidig bevare tillit til at "worst case scenario" ble undersøkt.

Den Innbukking fargestoff lokalisering metoden beskrevet her har blitt grundig testet med hånd-formet og støpt silikon / Pt elektrode arrays ^28-30. Det har vært brukt med tynn-film polyamid arrays ^7,31 og også tynn-film silikon / Pt arrays ^32. Noen retinal protese studier ansatt "bullet formet" elektroder med intrascleral implantasjoner ^33. Den foreliggende teknikk må være effektiv for å vurdere denne type elektroder matriser. Feline øynene med tynn sclera (tykkelse på bakre pol 90-200 mikrometer) tillatt visualisering av individuelle elektroder i en matrise. Men selv om individuelle elektrodes ikke var synlige, deres posisjoner kan lett utledes ved hjelp av et silikon-mal når konturen av matrisen kan sees (lik den som er brukt i trinn 2.6).

Fargestoffet kartlegging begrenser behovet for å oppnå ikke-relevante vev seksjoner som bare seksjoner med fargestoffet tilstede blir oppnådd. Evnen til å nøyaktig antyde elektrode posisjon ikke bare tillater relevant histopatologisk analyse og større statistisk styrke, men har en stor innvirkning på tid og kostnadsstyring ved å redusere mengden av lysbilder og kniver brukt, samt prisen på arbeidskraft. Bruken av fargestoff som er vedheftende og tåler vev behandling samtidig som den også er synlig i ufargede vevssnitt er et viktig innledende betraktning. Kunnskap om plasseringen av fargestoff og orientering av vevet ved disseksjon og under innstøping bistår skjæreprosessen. Dette omfatter korrekt orientering av blokken for å oppnå en seksjon som ikke er skrått kuttet, og gir en full representation av vevet. Det er derfor viktig at den som utfører skjæring er til stede på tidspunktet for fargestoff program, disseksjon og innebygging.

Det overordnede protokollen er robust overfor mindre endring, spesielt med fiksering timings. Men øyet disseksjon og fargestoff merking trinnene er delikat prosedyrer som drar nytte av god fingerferdighet for å unngå skade på prøven. Mens Davidsons bindemiddel har vist seg effektiv for å redusere kunstig avløsning av netthinnen nær et implantat, betyr det ikke hindrer direkte mekanisk skade under disseksjon. Davidsons bindemiddel var ikke lett kompatibelt med noen spesielle histologiske og immunhistokjemiske prosedyrer. Derfor var det behov for å endre / optimalisere disse trinnene som beskrevet ovenfor. Inkrementelle endringer i farging ganger og konsentrasjoner ble gjort før den optimale resultat ble oppnådd - for mer informasjon, se supplerende materiale.

Kvantifisering av retinalhistologi er fortsatt problematisk. Retina er ikke-homogene, og både tykkelse og celletettheten forandring med økende avstand fra området centralis ^34,35. Derfor kan tilgrensende vev innenfor det implanterte øyet ikke benyttes til sammenligninger og en kontroll øye anvendes i stedet. Parvis matching av hver seksjon med kontroll øye gir oss en mer kraftig statistisk sammenligning av patologiske endringer, effekt og sikkerhet resultater med netthinnens protetikk er bedre vurderes når man sammenligner de andre øyne i et emne ^36. Spesielle hensyn må tas for å minimere skrå skjæring da dette vil påvirke kvantifisering.

I sammendraget, beskrev metodene ovenfor har betydelig forbedret vår histopatologisk analyse, som igjen har ført til en mer effektiv preklinisk arbeidsflyt. Resultatene fra prekliniske studier med disse metodene direkte førte til en klinisk studie hvor 3 RP pasienter har blitt trygt implantert med suprachoroidal netthinnens proteser. Disse metodene er relevante både netthinnens stimulatorer og andre okulære implantater der patologisk respons på lang sikt implantasjon må evalueres. Denne metoden forutsatt verdt fordeler for å opprettholde cytoarchitecture og registrering av patologi til regioner av interesse på implantatet. Selv om det ikke spesifikt er testet, kan en modifikasjon av disse fremgangsmåtene kan benyttes på andre arter og andre anatomiske områder, særlig hvor en matrise er implantert overfladisk.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
The Davidson marking system	Bradley Products	1163-4 - red 1163-5 - blue 1163-2 - yellow 1163-1- green
Rabbit Polyclonal Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody	Millipore	AB5804	1:1500, overnight incubation
Mouse Monoclonal Anti-Glutamine Synthetase Antibody	Millipore	MAB302	1:100 overnight incubation
Monoclonal Mouse Anti-Neurofilament 200 Antibody	Sigma-Aldrich	N0142	1:100 overnight incubation
4',6-diamindino-2-phenylindole, dilactate (dilactate)	Life Technologies	D3571	1:25,000 30 min incubation
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG	Life Technologies	A11029	1:500
Superfrost 90° yellow	Grale Scientific	SF41299
FLEX IHC Microscope Slides	DAKO	K802021-2
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG	Life Technologies	A11037	1:500
Normal goat serum	Life Technologies	PCN5000	10% serum/0.1% Triton X-100/PBS
Non-Standard Solution Preparation for Special Stains 1% Aqueous Cresyl Violet Stock Solution Cresyl violet 1 g Distilled water 100 ml Cresyl Violet Acetate Working Solution 1% aqueous cresyl violet stock solution 9 ml Distilled water 51 ml 10% acetic acid 0.5 ml Biebrich Scarlet-Acid Fuchsin Solution 1% Beihrich scarlet 90 ml 1% acid fuchsin 10 ml Glacial acetic acid 1 ml Phosphomolybdic-Phosphtungstic Acid Solution Phosphomolybdic acid 2.5 g Phosphotungstic acid 2.5 g Distilled water 100 ml Aniline Blue Solution Aniline blue 2.5 g Glacial acetic acid 2 g Distilled water 100 ml Solutions for Immunohistochemistry Wash Buffer Solution 0.1% Triton X-100 in Phosphate buffered saline (PBS) Serum Block Solution 10% normal goat serum/0.1% Triton X-100 in PBS SUPPLEMENTARY MATERIAL Luxol Fast Blue The purpose of performing a Luxol Fast Blue (LFB) stain was to identify the ganglion cells in the ganglion cell layer through the counterstain of cresyl violet. While LFB stains myelin, the cresyl violet stain binds to the Nissl substances in neurons, composed of rough endoplasmic reticulum and ribosomes. Numerous cells in the retina contain Nissl substance including amacrine cells. These cells usually are located in the inner boundary layer of the inner nuclear layer, but displaced amacrine cells can be found in the ganglion cell layer. The staining of Nissl substance is helpful in differentiating large, heavily stained ganglion cells from smaller displaced amacrine cells. To aid visualisation of these cells, we modified the cresyl violet working solution protocol by increasing the volume of the cresyl violet stock solution in the working solution. We increased the volume in 1.0 ml increments from 6.0 ml to 9.0 ml, in turn reducing the volume of distilled water. Assessing the ease of visualising and identifying the ganglion cells, optimal staining was achieved with 9 ml of additional cresyl violet stock solution and 51 ml of distilled water. Cresyl violet is a basic dye, though to dye the Nissl substance, it is required to be used in an acidic solution, and therefore the volume of acetic acid remained unchanged at 0.5 ml. Periodic Acid Schiff The Periodic Acid Schiff (PAS) stain was performed to highlight polysaccharides especially glycogen, found in basement membranes and fungal cell walls, indicating a fungal infection. The process of the PAS stain is to oxidise the hydroxyl groups in polysaccharides using periodic acid, producing aldehyde groups. The application of the Schiff reagent, binds to the aldehyde groups producing a magenta color with haematoxylin counterstaining producing purple cell nuclei. Our slides showed weak staining at the inner limiting membrane. This may be due to the polysaccharides present, as not all polysaccharides can be oxidised with a standard time frame, especially those containing anionic polysaccharides. We therefore increased the duration of the oxidation step from 10 min to 12, 15, and 20 min. We found that a 15 min oxidation step was most effective in PAS staining. Masson’s Trichrome Blue The principle of the Masson's trichrome blue stain is to stain collagen and muscle, which in our retinal slides can be used to indicate an increase in collagen tissue which may indicate fibrosis due to injury. This stain is sensitive to fixation techniques, so alterations were needed to obtain optimal staining. The process of this stain is to initially stain cytoplasm and muscle fibres red using the acidic Biebrich scarlet-acid fuchsin red dye. Differentiation with phosphomolybdic/phosphotungstic acid competes with the red dye in the collagen fibres. In the sclera, the large phosphomolybdic/phosphotungstic acid molecules are able to penetrate the loose connective tissue, as opposed to the dense muscle fibres which are penetrable to small molecules only. Aniline blue dye is then applied to replace the acid in the collagen fibres producing blue dyed sclera. To optimise this stain in retinal sections, the duration of staining with Biebrich scarlet-acid fuchsin dye was reduced to create a balance between the blue and the red dye. The use of Davidson's fixative also required an extended differentiation time to remove the red dye from the collagen. We trialled differentiation at 5, 6, 8, and 10 min, with optimal results occurring at 6 min. Differentiation also varies on the thickness and cutting of smooth sections, with greater than 6 min differentiation possibly being required. Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Antibody Polyclonal, host species is rabbit, has a molecular weight of 50 kDa. GFAP antigen is an intermediate filament found in the cytoplasm (the cytoplasm of astrocytes and Müller cells in the retina), the antigen is made form 428 amino acids and has a molecular weight of 49512 Da. Neurofilament-200 antibody Monoclonal, host species is mouse, clone N52, isotype IgG1, it recognises phosphorylated and non-phosphorylated forms of the heavy neurofilaments which have a molecular weight of 200 kDa. The antibody will bind to an epitope in the tail domain of the neurofilament. The antibody will stain neurofilaments in the neuronal perikarya, dendrites and axons. Glutamine Synthetase (GS) antibody Monoclonal, clone GS-6, host species is mouse, has a molecular weight of 45 kDa and antibody isotype IgG2a. The GS antigen is found in the cell cytoplasm (cytoplasm of Müller cells in the retina), the antigen has 373 amino acids and a molecular weight of 42,064 Da.