Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

رني بوساطة ضربة قاضية جين مزدوجة وذوقي قياس مدركات في عسل النحل ( Published: July 25, 2013 doi: 10.3791/50446
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1School of Life Sciences, Arizona State University, 2Department of Chemistry, Biotechnology, and Food Science, Norwegian University of Life Sciences

Summary

في هذا البروتوكول، ونحن تصف استراتيجيتين التي تقمع في وقت واحد اثنين من الجينات (مزدوجة ضربة قاضية الجينات) في نحل العسل. ثم نقدم كيفية استخدام استجابة تمديد خرطوم (PER) مقايسة لدراسة تأثير مزدوج ضربة قاضية الجينات على عسل النحل التصور الذوقية.

Abstract

يوضح هذا الفيديو تقنيات الرواية من تدخل الحمض النووي الريبي (رني) الذي القيام بعملية التنظيم التقليلي اثنين من الجينات في وقت واحد في نحل العسل باستخدام الحمض النووي الريبي (الرنا المزدوج الجديلة) الحقن المزدوج تقطعت بهم السبل. كما يعرض بروتوكولا للخرطوم استجابة الإرشاد (PER) فحص لقياس الإدراك الذوقية.

رني بوساطة ضربة قاضية الجين هو أسلوب فعال downregulating الهدف التعبير الجيني. وعادة ما تستخدم هذه التقنية للتلاعب جين واحد، لكن له حدود للكشف عن التفاعلات والآثار المشتركة بين الجينات. في الجزء الأول من هذا الفيديو، نقدم استراتيجيتين لضرب أسفل في وقت واحد اثنين من الجينات (وتسمى مزدوجة ضربة قاضية الجينات). نعرض كل الاستراتيجيات قادرون على قمع فعالية اثنين من الجينات، vitellogenin (VG) وultraspiracle (USP)، والتي هي في حلقة ردود فعل التنظيمية. هذا النهج المزدوج ضربة قاضية الجينات يمكن أن تستخدم لتشريح العلاقات المتبادلة بين الجينات ويمكن تطبيقها بسهولة فيأنواع الحشرات المختلفة.

الجزء الثاني من هذا الفيديو هو دليل على خرطوم تمديد استجابة (PER) الفحص في نحل العسل بعد العلاج من ضعف ضربة قاضية الجينات. مقايسة PER هو اختبار معيار لقياس الإدراك الذوقية في النحل والعسل، والتي تعد مؤشرا رئيسيا لمدى سرعة نضوج نحلة العسل والسلوكي هو. تصور الذوقية أكبر من النحل عش يشير إلى زيادة التنمية السلوكية التي كثيرا ما يرتبط مع سن مبكرة في بداية البحث عن الطعام والعلف التخصص في حبوب اللقاح. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تطبيق PER فحص لتحديد الدول الأيضية من شبع أو الجوع في نحل العسل. وأخيرا، PER الفحص جنبا إلى جنب مع الاقتران المحفزات رائحة مختلفة للتكييف كما انها تستخدم على نطاق واسع النحل للتعلم والذاكرة دراسات في نحل العسل.

Introduction

تدخل الحمض النووي الريبي (رني) هو الحمض النووي الريبي على إسكات الجينات في مرحلة ما بعد النسخي، والذي يحدث في طائفة واسعة من الكائنات الحية حقيقية النواة. يتم تشغيل عملية رني بالنقر المزدوج تقطعت بهم السبل الحمض النووي الريبي (الرنا المزدوج الجديلة) السلائف داخلية أم خارجية. الرنا المزدوج الجديلة ينشط بروتين المقامر ريبونوكلياز الذي يربط ويشق الرنا المزدوج الجديلة إلى شظايا صغيرة (20-25 BP). ثم شظايا صغيرة من الرنا المزدوج الجديلة دليل على الاعتراف وتشطر من mRNAs والتكميلية من البروتينات argonaute، وهو عنصر حفاز من مجمع إسكات الحمض النووي الريبي التي يسببها (RISC) 1. في الثدييات، dsRNAs أطول من 30 NT، تنشيط استجابة المضادة للفيروسات (الإنترفيرون استجابة، IFN) الذي يؤدي إلى تدهور غير محددة من الحمض النووي الريبي النصوص 2. ومع ذلك، فقد ثبت dsRNAs طويلا لتكون فعالة ومحددة في الحشرات لأنه ليس هناك نقص في هذا الإنترفيرون 3.

وقد استخدمت dsRNAs طويلة لdownregulation من الجينات المستهدفة في أنواع الحشرات المختلفة. نحل العسل هي واحدة من بيونالكائنات الحشرات EER التي قد كشفت مهام العديد من الجينات الهامة في تطوير والسلوك باستخدام الرنا المزدوج الجديلة 4،5. وقد أجريت عدة طرق التسليم الرنا المزدوج الجديلة في نحل العسل: التغذية الرنا المزدوج الجديلة downregulates بكفاءة الهدف التعبير الجيني في يرقات نحل العسل 6، في حين حقن الرنا المزدوج الجديلة هو نهج فعالة لضربة قاضية الجينات في الأجنة العسل النحل 4 والنحل الكبار 7،8.

آثار ضربة قاضية الجينات التي أظهرتها تطبيق الرنا المزدوج الجديلة للحشرات هي عابرة والمترجمة. وقد أظهرت الدراسات أن كلا من حقن الرنا المزدوج الجديلة البطن وحقن الرنا المزدوج الجديلة الصدري قمع بفعالية الهدف التعبير الجيني في خلايا الجسم من الدهون في منطقة البطن من الحشرات 9،10. يتم حقن الرنا المزدوج الجديلة في تجاويف البطن والصدر وخلايا الدهون في الجسم هي قادرة على تولي الرنا المزدوج الجديلة من الدملمف حيث استحم الخلايا 10. ومع ذلك، لا يمكن استهداف الجينات في الأجهزة الأخرى، مثل المبايض والعقول، إما عن طريقالحقن في البطن أو الصدر. من أجل استهداف الجينات في نحل العسل الدماغ، كما تم إجراء حقن الدماغ من الرنا المزدوج الجديلة، الأمر الذي يؤثر بشكل فعال الهدف التعبير الجيني في مناطق الدماغ المحلية 11. هنا، ونحن الوثيقة الوحيدة حقن الرنا المزدوج الجديلة البطن وهو أكثر شيوعا في عسل النحل الكبار.

تم رني تستخدم في المقام الأول لاستهداف جين واحد وكان أداة قوية لتكشف عن وظيفة الجين. ومع ذلك، أي الجينات ليست معزولة عن الآخرين، بل هو في الشبكات التنظيمية المعقدة. مفتاح لفهم عملية بيولوجية هو لتشريح كيفية تفاعل الجينات مع بعضها البعض، الأمر الذي يتطلب التلاعب في وقت واحد من جينات متعددة بدلا من ضربة قاضية جين واحد. في خطوط خلايا الثدييات، نجح العلماء في تثبيط وقت واحد اثنين أو ثلاثة جينات باستخدام نظم التوصيل 12 أو متعدد الرنا الميكروي (ميرنا) تصاميم دبوس 13. ولكن في الحشرات، متعددة knockdowns الجين لا تزال غير مجربة. هنا، ونحن حاضرار استراتيجيات الحقن المختلفة التي يمكن تحقيق ضربة قاضية الجينات مزدوجة. نحن استهداف اثنين من الجينات: vitellogenin (VG) الذي يشفر بروتين تمهيدا صفار البيض، وultraspiracle (USP) الذي يشفر مستقبلات لهرمون المفترضة الأحداث (JH) ويمكن أن تكون بمثابة عامل النسخ الوساطة الردود على JH 14 في نحل العسل. VG وJH تنظيم بعضها البعض في حلقة التغذية المرتدة 15 ويشاركون في عسل النحل السلوكية المادة 9. باستخدام الجينات ضربة قاضية مزدوجة، ونحن التشويش على حد سواء VG والممرات JH، واكتشاف كيف أنها تؤثر على سلوك النحل العسل معا وعلم وظائف الأعضاء وكيفية VG، جامعة جنوب المحيط الهادئ وJH التفاعل 9.

تصور الذوقية يشكل مؤشرا السلوكية لنحل العسل السلوك الاجتماعي 16. من حيث التنمية السلوكية، والنحل عش مع التصور الذوقية العالية سلوكيا سريع ناضجة، وعادة العلف في وقت مبكر من الحياة، ويفضلون لجمع حبوب اللقاح 16،17. وعلى الرغم م التنظيميةechanisms الكامنة وراء الإدراك ذوقي لا تزال غير واضحة، وقد أظهرت الدراسات أن الإدراك ذوقي مرتبط الأيض الداخلية الطاقة 9، 18،19 إفراز الهرمونات والبيوجينية أمين مسارات 20. كلا VG وJH هي المنظمين الهرمونية المهم تحوير الإدراك ذوقي 7،21. في المختبر، والاختلاف في التصور الذوقية في نحل العسل يمكن تقييمها من خلال اختبار الاستجابة تمديد خرطوم (PER) إلى حلول السكروز مختلفة. يتم اختبار كل نحلة على حد سواء عن طريق لمس هوائيات لها مع قطرات من الماء يعقبه سلسلة تصاعدي تركيز 0.1، 0.3، 1، 3، 10، 30٪ سكروز. ويلاحظ استجابة إيجابية إذا نحلة تمتد بالكامل خرطوم لها عندما لمست قطرات من الماء أو السكروز إلى كل هوائي. استنادا إلى عدد من الردود الإيجابية إلى حلول، ومستوى الإدراك الذوقي كل فرد يمكن تحديد 16. ومع ذلك، فإن تطبيق PER لا يقتصر على قياس زتصور ustatory. وPER هو أيضا وسيلة فعالة لاختبار حالة الأيض من النحل مثل شبع مقابل الجوع. النحل مع أكبر الردود على السكروز هي جوعا في العام (وانغ وAmdam، بيانات غير منشورة). وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا أن نموذج PER استخدامها في التعلم النقابي والذاكرة في نحل العسل. في هذه الحالة سوف يتم تدريب النحل على المنتسبين وجود الماء السكروز مع رائحة. عندما تعلم النحل الرابطة، فقط وجود رائحة يمكن أن تثير استجابة إيجابية خرطوم دون مكافأتهم مع السكروز 22،23. في هذا الفيديو، وتبين لنا كيفية تنفيذ PER لتقييم الإدراك الذوقية التي قد تم توصيله مع VG وجامعة جنوب المحيط الهادئ ضربة قاضية مزدوجة في دراسة سابقة 9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

الجزء 1: رني بوساطة ضربة قاضية مزدوجة الجين

1. الرنا المزدوج الجديلة التجميعي

  1. وقد صممت الاشعال باستخدام البرمجيات الحرة على الانترنت Primer3 (: الاشعال تصميم dsRNAs استهداف VG، جامعة جنوب المحيط الهادئ والتحكم الجين الترميز الخضراء بروتين مضان (GFP) التي ليست في عسل النحل الجينوم http://frodo.wi.mit.edu/ ) .
  2. الرنا المزدوج الجديلة التوليف لVG، جامعة جنوب المحيط الهادئ وGFP: استخدام RiboMax T7 نظام إنتاج الحمض النووي الريبي من PROMEGA لفي المختبر النسخ.
  3. الرنا المزدوج الجديلة تنقية:
    1. تمسخ واستعادة الطبيعة: حرارة الرنا المزدوج الجديلة إلى 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وندعه يبرد في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
    2. الدناز العلاج الأول: إضافة 1 ميكرولتر الدناز أنا في كل رد فعل الرنا المزدوج الجديلة ومزجها عبها بواسطة الأنابيب. احتضان لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    3. إضافة 150 ميكرولتر nuclease خالية من المياه و 750 ميكرولتر TRizol - LS في كل رد فعل، وتخلط بلطف لهم من قبل الجردerting الأنبوب. احتضان هذه العينات لمدة 5 دقائق عند 30 درجة مئوية.
    4. إضافة 200 كلوروفورم ميكرولتر في كل عينة. مزيج بقوة لمدة 20 ثانية. الطرد المركزي عينات لمدة 15 دقيقة في XG 12،000 في 4 درجات مئوية.
    5. نقل المرحلة طاف إلى كل أنبوب جديد وإضافة 500 ميكرولتر ايزوبروبيل في كل أنبوب. مزجها بواسطة قلب الأنبوب. احتضان الخليط لمدة 20 دقيقة عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في XG 12،000 في 4 درجات مئوية.
    6. إزالة طاف واستخدام 1،000 ميكرولتر الإيثانول بنسبة 75٪ لغسل بيليه. بعد الطرد المركزي في أنبوب لمدة 5 دقائق عند 7،500 XG في 4 درجات مئوية، والهواء الجاف في الرنا المزدوج الجديلة بيليه، واستخدام المياه مجانا nuclease بحل بيليه. من أجل ضمان فعالية الجين التنظيم إلى أسفل، وينبغي أن يكون تركيز الرنا المزدوج الجديلة حوالي 9 -10 ميكروغرام / ميكرولتر.

2. الرنا المزدوج الجديلة حقن في البطن

لمضاعفة ضربة قاضية الجينات، وهناك نوعان من الاستراتيجيات: 1) حقنة واحدة: الرنا المزدوج الجديلة مزيج من اثنين من الجينات وinjeماسح الصور المقطعية المخلوط؛ 2) لمدة يومين الحقن: حقن الرنا المزدوج الجديلة أول استهداف جين واحد في اليوم الأول، وحقن الرنا المزدوج الجديلة الثانية في نفس النحل في اليوم الثاني.

  1. البرد ظهرت حديثا النحل في 4 ° C الثلاجة لمدة 1-2 دقيقة. عندما يجمد النحل، النحل يشن 3-4 بالتوازي على أطباق بتري كاملة من الشمع الصلبة مع دبابيس الحشرات عبرت بين بطونهم وthoraces.
  2. هدئ النحل مرة أخرى في 4 ° C الثلاجة. ضمان النحل غير قادرة على الحركة تماما. يستغرق حوالي 1-2 دقائق. ينبغي أن النحل تبدو فضفاضة. إذا أصبح النحل كرة لولبية أو ملتوية، وهذا يعني وبرود أنها طويلة جدا والتي ينبغي تجنبها. تقشعر لها الأبدان يسبب الكثير من الوفيات عالية، ولكن الشلل الكامل لا يقل أهمية عن أي حركة يزيد من حجم الجرح والوفيات.
  3. وضع المتاح 30 G إبرة (BD) على الصغير حقنة هاميلتون. يستغرق 3 الرنا المزدوج الجديلة ميكرولتر وتأكد من عدم وجود فقاعة هواء في الحقنة. يتم إدخال الإبرة إلى جانب البطن لتجنب داماجينج الأعضاء الداخلية. اضغط على المكبس حقنة ببطء للسماح للالرنا المزدوج الجديلة لاستيعابها. منذ الرنا المزدوج الجديلة هو لزج جدا، ويستغرق 2-3 ثانية ليطرد تماما من المحاقن. بعد دفع تماما أسفل الغطاس، وترك الإبرة في الجرح لمدة 4-5 ثوانى. مراقبة النحل لمدة 3-5 ثوان بعد الحقن. إذا كان الدملمف تسرب قطرات من الجرح، وتجاهل النحل.
  4. استخدام ألوان مختلفة للاحتفال thoraces يناظرها لعلاجات مختلفة. عند هذه النقطة إذا استخدمت استراتيجية حقنة واحدة، يمكن وضعها النحل يعود إلى مستعمرة بعد 1 ساعة المراقبة. ومع ذلك، إذا استخدمت استراتيجية الحقن لمدة يومين، بعد حقنها مع الرنا المزدوج الجديلة الأولى، يجب وضع النحل في قفص شبكة اسطوانة مع العسل المتوفرة على الجانب وأن يوضع في حاضنة عند 34 درجة مئوية والرطوبة 80٪ .
  5. في اليوم الثاني، اتبع الخطوات 2.2 و 2.3 أن يبرد النحل في أقفاص سلكية وجبل لهم على لوحات الشمع. أداء الحقن مع الرنا المزدوج الجديلة الثانية كما هو descriالسرير في الخطوة 2.4.
  6. السماح للاسترداد النحل في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة وتعريفهم إلى مستعمرة.

ملاحظة: يمكن الكشف عن آثار ضربة قاضية من قبل كمي RT-PCR (QRT-PCR) والغربية النشاف. بشكل عام، فعالية ضربة قاضية يختلف ويعتمد على عوامل كثيرة. في دراستنا، يمكن الكشف عن الجينات ضربة قاضية مزدوجة بعد 7 أيام الحقن والحقن واحدة لمدة يومين.

الجزء 2: ململة التمديد استجابة (PER) مقايسة

1. جمع النحل من الخلية

في يوم 6 بعد الحقن، وجمع النحل المعالجة من مستعمرة دون استخدام المدخن. جمع النحل في شبكة معدنية أقفاص الاسطوانة. 3 الحفاظ على النحل في كل قفص.

2. النحل المتزايدة للPER

هدئ النحل في 4 درجات مئوية حتى يتم يجمد بالكامل. تحميل كل نحلة عموديا في أنبوب من البلاستيك المصممة خصيصا لPER. الحفاظ على البطن داخل أنبوب من قبل النقيبز قطعتين صغيرة من الشريط، والحفاظ على رأس تخرج من الأنبوب. وضع أنابيب على رف مع صفين من الأعمدة بلاستيكية صغيرة، وتعيين كل أنبوب (النحل) مع رقم معرف. ثم وضع النحل يعامل على الرفوف في حاضنة (34 درجة مئوية، والرطوبة 80٪) والاحتفاظ بها في الحاضنة لمدة 2 ساعة.

3. إعداد سلسلة من الحلول المياه السكروز

إعداد 0٪، 0.1٪، 0.3٪، 1٪، 3٪، 10٪ و 30٪ سكروز حلول المياه وتحميل حلول في المحاقن مع الإبر 15-20 G.

4. PER الفحص

لمس الهوائي النحل مع قطرات من محلول 0٪ (الماء)، يليه بنسبة 0.1٪، 0.3٪، 1٪، 3٪، 10٪ و 30٪ الحلول المياه السكروز. اختبار جميع النحل مع الماء أولا والسماح دقيقتين على الأقل كما الفاصل الزمني بين كل حل يتم استخدامه. لذلك، لدينا عادة لا يقل عن 20 النحل لكل محاكمة. إذا كان النحل تمتد بالكامل خرطوم لها، ويحسب ردا ايجابيا.

5.إدارة البيانات

نلخص مجموع الردود الإيجابية لكل فرد لدرجة استجابة الذوقية (GRS). إجراء التحليل الإحصائي المناسب على البيانات.

جزء 3. الجينات التحقق من صحة ضربة قاضية

يتم تشريح جثث الدهون من مجموعة أخرى من النحل لمدة 7 أيام تعامل القديمة. يتم استخدام الإجراء TRizol القياسية لاستخراج الحمض النووي الريبي، والتي تبعتها الدناز I علاج 24. يتم تحليل VG وجامعة جنوب المحيط الهادئ التعبير الجيني من قبل خطوتين QRT-PCR. أكتين يتم استخدام الجينات مرجع لأنه لديه تعبيرات مستقرة في الأنسجة المختلفة من نحل العسل. وتستخدم نشرت الاشعال PCR في الوقت الحقيقي لVG وجامعة جنوب المحيط الهادئ الجين في هذه التجربة 24. ويتم تحليل البيانات باستخدام دلتا دلتا CT طريقة 25.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

كل يومين حقن استراتيجيات للحقنة واحدة وخفضت بشكل كبير VG (في اتجاه واحد أنوفا، ف <0.001) (الشكل 2A)، وجامعة جنوب المحيط الهادئ (في اتجاه واحد أنوفا، ف <0.001) (الشكل 2B) مستويات النص في نحل العسل بعد ستة أيام من الرنا المزدوج الجديلة تم حقن. كان قمع USP نص باستخدام حقنة واحدة مع خليط الرنا المزدوج الجديلة والحقن لمدة يومين مع VG الأولى والثانية جامعة جنوب المحيط الهادئ (VG / USP) أقل بكثير من الحقن لمدة يومين مع جامعة جنوب المحيط الهادئ أول وVG الثاني (USP / VG) (بعد مخصص التحليل، خليط P مقابل جامعة جنوب المحيط الهادئ / VG = 0.013، P VG / جامعة جنوب المحيط الهادئ مقابل جامعة جنوب المحيط الهادئ / VG = 0.019).

وGRS في النحل ضربة قاضية مزدوجة كان أعلى بكثير من النحل السيطرة GFP (طالب T اختبار، P = 0.0496) (الشكل 3).

= "jove_content" FO: المحافظة على together.within الصفحات = "دائما"> الشكل 1
الشكل 1. تم حقن انسيابي للتدخل الحمض النووي الريبي (رني) / خرطوم استجابة الإرشاد (PER) الفحص. أربع مجموعات من 50 النحل ظهرت حديثا مع RNA المزدوج تقطعت بهم السبل (الرنا المزدوج الجديلة) من vitellogenin (VG) وultraspiracle (USP) باستخدام استراتيجيات مختلفة أو مزيج مع الرنا المزدوج الجديلة من مخضر البروتين (GFP) الجين الذي لا وجود له في الجينوم عسل النحل. تم وضع النحل مرة أخرى إلى الخلية بعد الحقن، وجمعت بعد 6 أيام. تم جمع ستة عشر النحل في كل مجموعة لجين التحقق من صحة ضربة قاضية من قبل في الوقت الحقيقي باستخدام PCR، وثلاثين في المجموعة كانت للخرطوم استجابة الإرشاد (PER) الفحص. و'GFP الرنا المزدوج الجديلة' تشير إلى النحل حقنوا GFP الرنا المزدوج الجديلة، و'VG + USP خليط' تشير إلى النحل فيjected مع VG وجامعة جنوب المحيط الهادئ الرنا المزدوج الجديلة خليط، و'VG / USP' تشير إلى النحل حقن مع VG الرنا المزدوج الجديلة في اليوم الأول، ثم حقنها مع جامعة جنوب المحيط الهادئ الرنا المزدوج الجديلة في اليوم الثاني، و'USP / VG' تشير إلى النحل حقن الرنا المزدوج الجديلة مع جامعة جنوب المحيط الهادئ على في اليوم الأول، وحقنوا VG الرنا المزدوج الجديلة في اليوم الثاني.

الشكل 2
الشكل 2. ضعف الجينات التحقق من صحة ضربة قاضية من قبل في الوقت الحقيقي باستخدام PCR. تسجيل تحولت القيمة النسبية مرنا (يعني ± SEM) في الجسم الدهون في منطقة البطن من النحل المعالجة. تم حساب القيمة النسبية مرنا باستخدام دلتا دلتا CT الأسلوب. (A) التعبير VG بعد 6 أيام من الحقن الرنا المزدوج الجديلة. النصوص VG كانت كبيرة أسفل ينظمها ثلاثة ك مزدوج النهج nockdown (في اتجاه واحد أنوفا، ف <0.001). (B) التعبير USP بعد 6 أيام من الحقن الرنا المزدوج الجديلة. تم تخفيض محاضر جامعة جنوب المحيط الهادئ بشكل كبير من قبل ثلاثة مناهج ضربة قاضية مزدوجة (في اتجاه واحد أنوفا، ف <0.001). ومع ذلك، كان التعبير USP في النحل حقن مع الخليط الرنا المزدوج الجديلة و VG / جامعة جنوب المحيط الهادئ أقل بكثير من تلك التي في النحل حقن مع جامعة جنوب المحيط الهادئ / VG (بعد مخصص التحليل، ص خليط مقابل جامعة جنوب المحيط الهادئ / VG = 0.013، P VG / جامعة جنوب المحيط الهادئ مقابل جامعة جنوب المحيط الهادئ / VG = 0.019)، مشيرا إلى أن VG قد يكون المنظم الرئيسي في حلقة التنظيمية VG وJH. و'RQ' يشير إلى مستوى الكمي النسبية للمحاضر الجين المستهدف. رسائل مختلفة فوق القضبان دلالة فروق ذات دلالة إحصائية بين مجموعات العلاج.

ig3.jpg "/>
الشكل (3). النحل الذي حقنوا VG وجامعة جنوب المحيط الهادئ الرنا المزدوج الجديلة خليط زيارتها درجة استجابة الذوقية (GRS) باستخدام استجابة تمديد خرطوم (PER) الفحص. أعلى GRS من الضوابط GFP، مما يدل على أنهم كانوا أكثر حساسية لالسكروز. رسائل مختلفة فوق القضبان دلالة فروق ذات دلالة إحصائية بين مجموعات العلاج (طالب T اختبار، P = 0.0496).

الشكل 4
الشكل 4. ممكن شبكات الجينات التنظيمية التي كشفت عنها باستخدام VG وجامعة جنوب المحيط الهادئ نهج ضربة قاضية مزدوجة. يتم إنتاج هرمون الأحداث (JH) في الدماغ نحلة العسل ويفرز إلى الدملمف. Vitellogenin (VG) هي السلائف بروتين صفار البيض التي تنتجها خلايا الدهون في الجسم. VG وJH موجودة في حلقة التغذية المرتدة التي تنظم التمثيل الغذائي الفيزيولوجياogy، تصور الذوقية، والعمر عند بداية البحث عن الطعام والعلف تفضيل نحل العسل. تشير الدراسات إلى أن ultraspiracle (USP) هي مستقبلات المفترضة لJH، وربما تكون بمثابة عامل النسخ. وقد كشفت لنا ضربة قاضية مزدوجة من VG وجامعة جنوب المحيط الهادئ VG يلعب أدوارا أساسية في العلاقة بين VG، جامعة جنوب المحيط الهادئ وJH. 1. لقد وجدنا ضربة قاضية مزدوجة من VG وجامعة جنوب المحيط الهادئ تسبب في زيادة أكبر في JH من ضربة قاضية VG واحدة، وضربة قاضية واحدة جامعة جنوب المحيط الهادئ لم تحدث أي تغيير في JH. فإنه يشير إلى أن VG يمنع إنتاج JH فحسب، بل يحول دون استجابة من ردود الفعل JH لجامعة جنوب المحيط الهادئ ضربة قاضية (A). في knockdowns المزدوجة، تسبب في زيادة كبيرة من نتائج إنتاج JH من انخفاض تثبيط من VG التي كتبها VG ضربة قاضية واستجابة تعويضية لانخفاض تنبيغ JH الناجمة عن جامعة جنوب المحيط الهادئ ضربة قاضية (B). 2. لقد وجدنا USPكان أكثر وفرة تخفيض نص من قبل جامعة جنوب المحيط الهادئ الرنا المزدوج الجديلة عندما كان في المقام الأول VG أو downregulated في وقت واحد، مما يشير إلى VG يقمع حساسية من جامعة جنوب المحيط الهادئ mRNAto الرنا المزدوج الجديلة لها. كيف يمكن VG أن تشارك في تدخل الحمض النووي الريبي (رني)؟ VG ينظم عسل النحل المناعي الدفاع ورني هو جزء من فيروسات نظام المناعة الفطرية. يظهر لدينا دراسة سابقة argonaute 3 (GB19389، PIWI)، عنصرا هاما من عناصر معقدة إسكات الحمض النووي الريبي التي يسببها (RISC)، هي واحدة من الجينات المرشحة التأثير على السلوك الاجتماعي العسل النحل (التصور الذوقية والعمر عند بداية البحث عن الطعام والعلف التفضيل)، والذي هو التي تسيطر عليها VG / JH حدة. لذلك، احتمال واحد هو أن VG قد قمع البروتينات التي تؤثر على النشاط argonaute من RISC (A). عندما VG هو downregulated، جامعة جنوب المحيط الهادئ الرنا المزدوج الجديلة هي قادرة على تتحلل بشكل أكثر كفاءة مرنا جامعة جنوب المحيط الهادئ (B). 3. أيضا يكشف دراستنا ضربة قاضية مزدوجة USP أن يفعللا توسط تأثير كابح من JH على الإنتاج VG في الدهون في الجسم لأنه لا ضربة قاضية USP واحد يؤثر VG فرة نص، ولا مزدوج VG وجامعة جنوب المحيط الهادئ ضربة قاضية يسبب مزيد من الحد من النصوص VG. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

دراستنا هي أول جهد لضرب أسفل في وقت واحد في اثنين من الجينات الحشرات الكبار. نتائجنا تظهر أن استراتيجيات اثنين من الرنا المزدوج الجديلة حقن (حقنة واحدة والحقن لمدة يومين) فعالة لقمع الجينات مزدوجة، وإسكات الجينات في وقت واحد من VG وجامعة جنوب المحيط الهادئ يمكن اختبارها بعد 6 أيام من الحقن الرنا المزدوج الجديلة إلى النحل 8،9. ومع ذلك، تختلف الجينات فعالية ضربة قاضية في أنواع الحشرات المختلفة تبعا لمستوى نسخة من الجين المستهدف، ومعدلات دوران البروتين والرنا المزدوج الجديلة كفاءة امتصاص الخلايا أو الأجهزة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن تأثير رني هو الجرعة التي تعتمد. وجدنا نحلة ظهرت حديثا يمكن أن تقبل بشكل جيد 4 الرنا المزدوج الجديلة ميكرولتر، ولكن وفيات زيادة سريعة إذا تم حقن أكثر من 4 الرنا المزدوج الجديلة ميكرولتر. لذلك، قد تكون الإستراتيجية الحقن لمدة يومين أكثر ملاءمة من حقنة واحدة للتجربة الذي يتطلب مبلغا أكبر من حجم الحقن.

هنا، وضربة قاضية الجينات مزدوج 9

على سبيل المثال VG وJH موجودة في حلقة ردود فعل تنظيم عسل النحل علم وظائف الأعضاء 9 والنضج السلوكي 26،27. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن VG ضربة قاضية الجينات يمكن أن تزيد من مستوى JH في عسل النحل 28، في حين أن التطبيق الموضعي للJH يمكن أن تقلل VG التعبير 29. وبالإضافة إلى ذلك، قد اقترح دراسات USP هو مستقبلات المفترضة لJH، وربما توسط الردود على JH كعامل النسخ 14،30. ولكن، كيف VG ينظم JH عيار وما إذا USP وتشارك في تنظيم VG بواسطة JH لا تزال غير مفهومة تماما. باستخدام نهج ضربة قاضية مزدوجة، اكتشفنا العلاقات المتبادلة بين مفصلة VG، جامعة جنوب المحيط الهادئ وJH ( VG يلعب دورا محوريا بين VG، جامعة جنوب المحيط الهادئ وJH. مستوى عال من VG يمنع ليس فقط JH إنتاج 15، ولكن يحول دون استجابة ردود فعل منهجي لجامعة جنوب المحيط الهادئ ضربة قاضية (الشكل 4A). في VG وجامعة جنوب المحيط الهادئ النحل ضربة قاضية مزدوجة، وزيادة الإنتاج JH أكثر من ذلك في 9 VG knockdowns واحد. وثمة تفسير محتمل هو أن الزيادة الهائلة في عدد JH في knockdowns مزدوج ناتج عن انخفاض كبير في التأثير السلبي للVG على JH الناجمة عن VG ضربة قاضية واستجابة تعويضية لانخفاض تنبيغ JH الناجمة عن جامعة جنوب المحيط الهادئ ضربة قاضية (الشكل 4B). ثانيا، ضربة قاضية من VG الأولى والثانية ضربة قاضية جامعة جنوب المحيط الهادئ أو في وقت واحد من كل من تسبب تخفيض أكثر من جامعة جنوب المحيط الهادئ مما ضربة قاضية واحدة من جامعة جنوب المحيط الهادئ فعلت. هذا قد يوحي بأن VG يحول دون حساسية من جامعة جنوب المحيط الهادئ mRNAto DS لهاالحمض النووي الريبي. هذه النتيجة هو أول من ربط VG مع العمليات رني. وتشارك VG في الدفاع المناعي في نحل العسل (31) ورني هي واحدة من العديد من الأنظمة المضادة للفيروسات في الكائنات حقيقية النواة 32. وقد أظهرت الدراسات أن عملية رني ينطوي على البروتينات argonaute التي يتم حفظها في جميع أنحاء حقيقيات النوى 33. ومن المثير للاهتمام، ونحن سبق وجدت أن argonaute 3 (GB19389، PIWI) هو واحد من الجينات المرشحة لتنظيم السلوك الاجتماعي العسل النحل التي VG / JH حدة يلعب الأدوار المركزية 34. وبالتالي، تفسير بديل واحد هو أن يقمع VG ظائف البروتينات argonaute التأثير تدهور مرنا (الشكل 4A). عندما VG هو downregulated، argonautes المساهمة بنشاط أكبر إلى تدهور مرنا جامعة جنوب المحيط الهادئ الناجم عن الرنا المزدوج الجديلة لها (الشكل 4B). وأخيرا، وجدنا لم يتم تغيير VG فرة نص من قبل جامعة جنوب المحيط الهادئ ضربة قاضية، وخفضت من قبل VG وجامعة جنوب المحيط الهادئ ضربة قاضية مزدوجة في الE مستوى مماثل كما أنه من خلال VG ضربة قاضية واحدة. وتشير هذه النتائج إلى أن جامعة جنوب المحيط الهادئ ليست متورطة في تحريمي تأثير من JH على VG. وعموما، فإن ضربة قاضية مزدوجة الجينات على ما يبدو هو نهج قوية لمساعدتنا في فهم شبكة الجينات التنظيمية في التفاصيل.

PER هو فحص معيار لقياس الإدراك الذوقية في نحل العسل، والتي تم استخدامها باعتبارها مؤشرا لتطوير نحل العسل السلوك الاجتماعي 35. النحل مع حساسية عالية لنسبة السكر عادة ما تبدأ البحث عن الطعام في وقت مبكر من الحياة، ويفضلون لجمع حبوب اللقاح. ويمكن أيضا أن يتم اختبار التصور الذوقية للتنبؤ تأثير العلاج على السلوكيات الاجتماعية قبل أن يتم إجراء أي دراسات السلوك الأخرى واسعة النطاق. بالإضافة إلى ذلك، لقد أظهرنا هذا التصور الذوقية يرتبط مع الدولة الأيضية الداخلية 9 لذلك، PER يمكن استخدامها لتحديد مستويات الجوع شبع و. وعلاوة على ذلك، PER إرفاقها مع الشروط رائحة ويستخدم لدراسة التعلموالذاكرة في نحل العسل. بشكل جماعي، PER الاختبار هو تقنية مفيدة جدا لدراسة سلوك النحل العسل وعلم وظائف الأعضاء الأيضية. ومع ذلك، PER حساسة للطرق التعامل مع 36. على سبيل المثال، كانت النحل التي كانت من قبل تخدير تقشعر لها الأبدان أو CO 2 أكثر استجابة لالسكروز من الضوابط 36. PER يختلف أيضا خلال النهار، وحساسة للظروف البيئية والإجهاد. ولذلك، من المهم جدا للحفاظ على البيئة وإجراءات متناسقة أثناء التجربة. بشكل عام، ننتهي PER في الصباح واتبع نفس الجدول الزمني في الأيام التالية. ونحن عادة نبدأ في جمع النحل في الصباح الباكر في الساعة 8:00 صباحا، ويستغرق 3 ساعة للحصول على استعداد لPER. إذا PER الاحتياجات التي يتعين القيام بها في عدة أيام، فمن المهم للانتهاء من ذلك في فترة قصيرة في حالة تغيرات البيئة. PER ينبغي أن تؤخذ في مجموعات ويجب أن تتضمن كل مجموعة أكثر من 20 النحل لأن الفاصل الزمني على الأقل 2 دقيقة يجب أن تظل بين مختلف concentratiإضافات حلول السكروز. فعلنا 75-100 النحل لكل مجموعة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

فإن الكتاب أود أن أشكر ايرين Fennern لمساعدة التجربة. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل مجلس البحوث في النرويج (180504، 185306 و191699)، PEW ترست الخيرية، والمعهد الوطني للشيخوخة (NIA P01 AG22500).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
GE Healthcare PCR beads in 96 well plate GE Healthcare 27-9557-01
QIAquick PCR purification kit Qiagen 28104
RiboMax T7 RNA production system Promega P1300
Trizol LS Invitrogen 10296028
Chloroform:Isoamyl alcohol 24:1 Sigma-Aldrich C0549
isopropyl alcohol Sigma-Aldrich I9516
Hamilton micro syringe Hamilton 80301
30G BD disposable needles BD Biosciences 305106
Sucrose Sigma-Aldrich 84097
1 ml Syringe BD Biosciences 30960
Stereo dissection microscope Leica Microsystems S6D
Insect pins Fine Science Tools 26000-25
Wax plate

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Okamura, K., Ishizuka, A., Siomi, H., Siomi, M. C. Distinct roles for Argonaute proteins in small RNA-directed RNA cleavage pathways. Genes Dev. 18, 1655-1666 (2004).
  2. Shi, Y. Mammalian RNAi for the masses. Trends Genet. 19, 9-12 (2003).
  3. Huvenne, H., Smagghe, G. Mechanisms of dsRNA uptake in insects and potential of RNAi for pest control: a review. J. Insect Physiol. 56, 227-235 (2010).
  4. Beye, M., Hartel, S., Hagen, A., Hasselmann, M., Omholt, S. W. Specific developmental gene silencing in the honey bee using a homeobox motif. Insect Mol. Biol. 11, 527-532 (2002).
  5. Amdam, G. V., Simoes, Z. L., Guidugli, K. R., Norberg, K., Omholt, S. W. Disruption of vitellogenin gene function in adult honeybees by intra-abdominal injection of double-stranded RNA. BMC Biotechnol. 3, 1 (2003).
  6. Patel, A. The making of a queen: TOR pathway governs diphenic caste development. PLoS ONE. 6, e509 (2007).
  7. Amdam, G. V., Norberg, K., Page, R. E., Erber, J., Scheiner, R. Downregulation of vitellogenin gene activity increases the gustatory responsiveness of honey bee workers (Apis mellifera). Behav. Brain Res. 169, 201-205 (2006).
  8. Wang, Y., et al. Down-regulation of honey bee IRS gene biases behavior toward food rich in protein. PLoS Genet. 6, e1000896 (2010).
  9. Wang, Y., Brent, C. S., Fennern, E., Amdam, G. V. Gustatory perception and fat body energy metabolism are jointly affected by vitellogenin and juvenile hormone in honey bees. PLoS Genet. 8, e1002779 (2012).
  10. Luna, B. M., Juhn, J., James, A. A. Injection of dsRNA into Female A. aegypti Mosquitos. J. Vis. Exp. (5), e215 (2007).
  11. Mussig, L., et al. Acute disruption of the NMDA receptor subunit NR1 in the honeybee brain selectively impairs memory formation. J. Neurosci. 30, 7817-7825 (2010).
  12. Stove, V., Smits, K., Naessens, E., Plum, J., Verhasselt, B. Multiple gene knock-down by a single lentiviral vector expressing an array of short hairpin RNAs. Electron J. Biotechnol. 19, 13 (2006).
  13. Sun, D., Melegari, M., Sridhar, S., Rogler, C. E., Zhu, L. Multi-miRNA hairpin method that improves gene knockdown efficiency and provides linked multi-gene knockdown. Biotech. 41, 59-63 (2006).
  14. Ament, S. A., et al. The transcription factor ultraspiracle influences honey bee social behavior and behavior-related gene expression. PLoS Genet. 8, e1002596 (2012).
  15. Amdam, G. V., Omholt, S. W. The hive bee to forager transition in honeybee colonies: the double repressor hypothesis. J. Theor. Biol. 223, 451-464 (2003).
  16. Pankiw, T., Page, R. E. Response thresholds to sucrose predict foraging division of labor in honeybees. Behav. Ecol. Sociobiol. 47, 265-267 (2000).
  17. Pankiw, T., Nelson, M., Page, R. E., Fondrk, M. K. The communal crop: modulation of sucrose response thresholds of pre-foraging honey bees with incoming nectar quality. Behav. Ecol. Sociobiol. 55, 286-292 (2004).
  18. Jaycox, E. R. Behavioral Changes in Worker Honey Bees (Apis mellifera L.) after Injection with Synthetic Juvenile Hormone (Hymenoptera: Apidae). J. Kan. Entomol. Soc. 49, 165-170 (1976).
  19. Jaycox, E. R., Skowronek, W., Guynn, G. Behavioral changes in worker honey bees (Apis mellifera) induced by injections of a juvenile hormone mimic. Ann. Entomol. Soc. Am. 67, 529-534 (1974).
  20. Scheiner, R., Pluckhahn, S., Oney, B., Blenau, W., Erber, J. Behavioural pharmacology of octopamine, tyramine and dopamine in honey bees. Behav. Brain Res. 136, 545-553 (2002).
  21. Robinson, G. E. Effects of a juvenile hormone analogue on honey bee foraging behaviour and alarm pheromone production. J. Insect. Physiol. , 277-282 (1985).
  22. Giurfa, M., Malun, D. Associative mechanosensory conditioning of the proboscis extension reflex in honeybees. Lear Memory. 11, 294-302 (2004).
  23. Scheiner, R., Page, R. E., Erber, J. The effects of genotype, foraging role, and sucrose responsiveness on the tactile learning performance of honey bees (Apis mellifera L.). Neurobiol. Learn Mem. 76, 138-150 (2001).
  24. Wang, Y., et al. PDK1 and HR46 gene homologs tie social behavior to ovary signals. PLoS ONE. 4, e4899 (2009).
  25. Wang, Y., et al. Regulation of behaviorally associated gene networks in worker honey bee ovaries. J. Exp. Biology. 215, 124-134 (2012).
  26. Amdam, G. V., Csondes, A., Fondrk, M. K., Page, R. E. Complex social behaviour derived from maternal reproductive traits. Nature. 439, 76-78 (2006).
  27. Amdam, G. V., Ihle, K. E., Page, R. E. Hormones, Brain and Behavio. Pfaff, D., et al. , Elsevier Academic Press. (2009).
  28. Guidugli, K. R., et al. Vitellogenin regulates hormonal dynamics in the worker caste of a eusocial insect. FEBS Letters. 579, 4961-4965 (2005).
  29. Corona, M. juvenile hormone, insulin signaling, and queen honey bee longevity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 7128-7133 (2007).
  30. Sinha, S., Ling, X., Whitfield, C. W., Zhai, C., Robinson, G. E. Genome scan for cis-regulatory DNA motifs associated with social behavior in honey bees. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 16352-16357 (2006).
  31. Amdam, G. V., et al. Hormonal control of the yolk precursor vitellogenin regulates immune function and longevity in honeybees. Exp. Gerontol. 39, 767-773 (2004).
  32. Wang, Q. C., Nie, Q. H., Feng, Z. H. RNA interference: antiviral weapon and beyond. World J. Gastroenterol. 9, 1657-1661 (2003).
  33. Carmell, M. A., Xuan, Z., Zhang, M. Q., Hannon, G. J. The Argonaute family: tentacles that reach into RNAi, developmental control, stem cell maintenance, and tumorigenesis. Genes Dev. 16, 2733-2742 (2002).
  34. Hunt, G. J. Behavioral genomics of honeybee foraging and nest defense. Naturwissenschaften. 94, 247-267 (2007).
  35. Pankiw, T., Waddington, K. D., Page, R. E. Modulation of sucrose response thresholds in honey bees (Apis mellifera L.): influence of genotype, feeding, and foraging experience. J. Comp. Physiol. A. 187, 293-301 (2001).
  36. Pankiw, T., Page, R. E. Effect of pheromones, hormones, and handling on sucrose response thresholds of honey bees (Apis mellifera L.). J. Comp. Physiol. A. Neuroethol. Sens. Neural. Behav. Physiol. 189, 675-684 (2003).
رني بوساطة ضربة قاضية جين مزدوجة وذوقي قياس مدركات في عسل النحل (<em&gt; mellifera أبيس</em&gt;)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, Y., Baker, N., Amdam, G. V.… More

Wang, Y., Baker, N., Amdam, G. V. RNAi-mediated Double Gene Knockdown and Gustatory Perception Measurement in Honey Bees (Apis mellifera). J. Vis. Exp. (77), e50446, doi:10.3791/50446 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter